Les ribosomes sont responsables de la traduction des ARNm en protéines. Des modifications de la composition des ribosomes altèrent son activité de traduction et favorisent la tumorigenèse. L’identification des altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein pourrait être un nouveau mécanisme de tumorigenèse mammaire et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En effet, les cancers du sein restent la première cause de mortalité liés aux cancers chez la femme et leur hétérogénéité induit un problème thérapeutique important. Dans ce contexte, les altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein ont été abordées dans des cohortes humaines et dans des modèles cellulaires de l’EMT (Transition Epithélio-Mésenchymateuse), un processus impliqué dans la tumorigenèse mammaire. Ces travaux ont permis d’identifier : i) deux facteurs impliqués dans la biogenèse des ribosomes, FBL (fibrillarine) et NCL (nucléoline) dont les variations d’expression sont associées à un mauvais pronostic chez les patientes ; et ii) des variations de composition du ribosome et de son activité traductionnelle dans l’EMT. L’ensemble de ces résultats soutient l’existence d’altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein / Ribosomes are responsible of translating mRNAs to proteins. Alterations of ribosome composition modify its translation activity and favour tumourigenesis. Identification of ribosomes composition alterations in breast cancers might correspond to a new mechanism responsible of mammary tumourigenesis and might open up novel therapeutic approaches. Indeed breast cancers represent the first cause of women mortality due to cancers and their heterogeneity induces an important therapeutic problem.In this context, alterations of ribosomes composition were determined in human cohorts and in EMT (Epithelial to Mesenchymal Transition) cellular models, the EMT being a process involved in mammary tumourigenesis. This studies identify : (i) two factors involved in ribosome biogenesis, FBL (fibrillarin) and NCL (nucleolin) whose expression variations are associated with poor prognosis in patients and (ii) variations of ribosome composition and its translational activity in EMT. Altogether, this data support the presence of ribosomes composition alterations in breast cancers

La plupart des molécules d’ARN doivent se replier en structure tertiaire complexe afin d’accomplir leurs fonctions biologiques. Cependant, les déterminants d’une chaîne de polynucléotides qui sont nécessaires à son repliement et à ses interactions avec d’autres éléments sont essentiellement inconnus. L’établissement des relations structure-fonction dans les grandes molécules d’ARN passe inévitablement par l’analyse de chaque élément de leur structure de façon individuelle et en contexte avec d’autres éléments. À l’image d’une construction d’immeuble, une structure d’ARN est composée d’unités répétitives assemblées de façon spécifique. Les motifs récurrents d’ARN sont des arrangements de nucléotides retrouvés à différents endroits d’une structure tertiaire et possèdent des conformations identiques ou très similaires. Ainsi, une des étapes nécessaires à la compréhension de la structure et de la fonction des molécules d’ARN consiste à identifier de façon systématique les motifs récurrents et d’en effectuer une analyse comparative afin d’établir la séquence consensus. L’analyse de tous les cas d’empaquetage de doubles hélices dans la structure du ribosome a permis l’identification d’un nouvel arrangement nommé motif d’empaquetage le long du sillon (AGPM) (along-groove packing motif). Ce motif est retrouvé à 14 endroits dans la structure du ribosome de même qu’entre l’ARN ribosomique 23S et les molécules d’ARN de transfert liées aux sites ribosomaux P et E. Le motif se forme par l’empaquetage de deux doubles hélices via leur sillon mineur. Le squelette sucre-phosphate d’une hélice voyage le long du sillon mineur de l’autre hélice et vice versa. Dans chacune des hélices, la région de contact comprend quatre paires de bases. L’empaquetage le plus serré est retrouvé au centre de l’arrangement où l’on retrouve souvent une paire de bases GU dans une hélice interagissant avec une paire de bases Watson-Crick (WC) dans l’autre hélice. Même si la présence des paires de bases centrales GU versus WC au centre du motif augmente sa stabilité, d’autres alternatives existent pour différents représentants du motif. L’analyse comparative de trois librairies combinatoires de gènes d’AGPM, où les paires de bases centrales ont été variées de manière complètement aléatoire, a montré que le contexte structural influence l’étendue de la variabilité des séquences de nucléotides formant les paires de bases centrales. Le fait que l’identité des paires de bases centrales puisse varier suggérait la présence d’autres déterminants responsables au maintien de l’intégrité du motif. L’analyse de tous les contacts entre les hélices a révélé qu’en dehors du centre du motif, les interactions entre les squelettes sucre-phosphate s’effectuent via trois contacts ribose-ribose. Pour chacun de ces contacts, les riboses des nucléotides qui interagissent ensemble doivent adopter des positions particulières afin d’éviter qu’ils entrent en collision. Nous montrons que la position de ces riboses est modulée par des conformations spécifiques des paires de bases auxquelles ils appartiennent. Finalement, un autre motif récurrent identifié à l’intérieur même de la structure de trois cas d’AGPM a été nommé « adenosine-wedge ». Son analyse a révélé que ce dernier est lui-même composé d’un autre arrangement, nommé motif triangle-NAG (NAG-triangle). Nous montrons que le motif « adenosine-wedge » représente un arrangement complexe d’ARN composé de quatre éléments répétitifs, c’est-à-dire des motifs AGPM, « hook-turn », « A-minor » et triangle-NAG. Ceci illustre clairement l’arrangement hiérarchique des structures d’ARN qui peut aussi être observé pour d’autres motifs d’ARN. D’un point de vue plus global, mes résultats enrichissent notre compréhension générale du rôle des différents types d’interactions tertiaires dans la formation des molécules d’ARN complexes. / Most RNA molecules have to adopt a complex tertiary structure to accomplish their biological functions. However, the important determinants of a polynucleotide chain that are required for its proper folding and its interactions with other elements are essentially unknown. The establishment of structure-function relationships in large RNA molecules goes inevitably through the analysis of each element of their structure separately and in context with other elements. Like a building, an RNA structure is built of repetitive pieces that are glued together in a specific way. These repetitive elements, instead of being bricks, are recurrent motifs. Recurrent RNA motifs are arrangements of nucleotides found in different parts of a tertiary structure and have identical or very similar conformations. Thus, a necessary step toward the understanding of RNA structure and function consists in the systematic identification of recurrent motifs, followed by their comparative analysis and establishment of their sequence consensus. The analysis of all instances of helical packing within the ribosome structure led to the identification of a new structural arrangement, named the along-groove packing motif (AGPM), which is found in 14 places of the ribosome structure as well as between the 23S ribosomal RNA and the transfer RNA molecules bound to the P and E sites. The motif is formed by the packing of two double helices via their minor grooves. The sugar-phosphate backbone of one helix goes along the minor groove of the other helix and vice versa. In each helix, the contact region includes four base pairs. The closest packing occurs in the center where one can often see a GU base pair packed against a WC base pair. While the presence of the central base pairs GU versus WC in the core of the motif enhances its stability, other alternatives are also present among available structures of the motif. A comparative analysis of three different combinatorial gene libraries of AGPM, in which the central base pairs were fully randomized, shows that the structural context influences the scope of nucleotide sequence variability of the central base pairs. The fact that the identity of the central base pairs can vary suggested that there are other determinants responsible of the motif’s integrity. Analysis of all other inter-helix contacts has shown that outside the center of the motif the interactions between backbones are made via three ribose-ribose contacts. Within each of these contacts, the riboses of the nucleotides that are in touch adopt particular positions in order to provide for collision-free interactions between them. We show that the position of these riboses is modulated by the specific base pair conformation in which it belongs. Finally, another recurrent arrangement that occurs within the structure of three cases of AGPM was identified and called the adenosine-wedge. Analysis has shown that the latter motif is itself composed of a smaller arrangement, called the NAG-triangle motif. We show that the adenosine-wedge motif represents a complex RNA arrangement composed of four repetitive elements, AGPM, the hook-turn, the A-minor and the NAG-triangle, which clearly illustrates the hierarchical organisation of the structure that could also occur in other RNA motifs as well. Altogether, my results enrich our general understanding of the role of different types of tertiary interactions in the formation of large RNA molecules.

La protéine kinase TOR (Target Of Rapamycin) a été identifiée chez la levure et les mammifères comme participant à deux complexes protéiques qui servent de carrefour entre la perception des facteurs endogènes et exogènes et la stimulation de la croissance cellulaire. Depuis la découverte de la kinase AtTOR chez Arabidopsis thaliana, des études ont été menées afin de mieux caractériser son rôle chez les plantes et l’influence de son niveau d’expression sur la régulation du métabolisme et du développement.Au cours de ce travail, j’ai contribué à l’étude de cette kinase en étudiant l’influence de l’inactivation de TOR sur la composition du ribosome au niveau protéique et sur le niveau de phosphorylation de ces protéines, ainsi que sur l’organisation du méristème au niveau moléculaire et cytologique Au cours de cette étude, j’ai montré que certaines protéines constitutives du ribosome pourraient être des cibles de l’activité TOR au niveau de leur abondance et/ou de leur état de phosphorylation. Ainsi, l’inactivation de TOR entraine une diminution du niveau de phosphorylation des protéines RPS6 et pourrait influencer l’abondance des protéines acides constitutives du stalk ribosomal, une structure importante dans la régulation de la traduction. Les résultats obtenus suggèrent également que l’activité TOR est nécessaire au maintien du méristème à l’état fonctionnel en régulant les voies importantes contrôlant la division et la différentiation au sein de cette structure. / The TOR (Target Of Rapamycin) kinase has first been identified in yeast and mammals as being part of two different protein complexes that are implicated in the stimulation of cell growth in response to endogenous and exogenous stimuli. Since the discovery of this kinase in Arabidopsis, some studies have been led to characterize its role in plants and the influence of its expression level on the metabolism and development regulation.In this study, I worked on the influence of the TOR inactivation on the composition of the ribosome on its protein composition and on the phosphorylation status of these proteins and also on the organisation of the meristem at a molecular and cellular level.Regarding to the results I have obtained, I showed that TOR may regulate the abundance and/or the phosphorylation status of some proteins involved in the ribosome composition. Hence, TOR inactivation leads to a decrease of the phosphorylation level of RPS6 proteins and could regulate the abundance of acid proteins constitutive of the ribosomal stalk, a structure important for the translation regulation. The results obtained also suggest that TOR activity may be necessary to keep the meristem functional by the regulation of the main important pathways controlling division and differentiation in that structure.

Ce travail porte sur l’étude de la fidélité de la traduction chez les eucaryotes d’un point de vue mécanistique et génomique. Au cours de ma thèse j'ai développé trois approches :Le premier projet porte sur l’étude du rôle du facteur de l’élongation eEF2 dans le maintien du cadre de lecture. La stratégie associe une mutagénèse aléatoire du gène EFT2 à un criblage phénotypique, elle permet d’isoler des mutants capables d’augmenter ou diminuer l’efficacité de recodage d’une séquence de décalage du cadre de lecture en -1.Le second projet décrit la mise au point d’un système de traduction en molécule unique qui permet d’étudier le ribosome eucaryote. La traduction est initiée grâce à l’IRES CrPV qui a pour caractéristique d’être totalement indépendante des facteurs d’initiation et de l’ARNt initiateur. L’élongation de la traduction est détectée grâce au départ d’un oligonucléotide fluorescent qui est décroché par l’activité hélicase du ribosome. Les résultats de ces expériences constituent une preuve de principe démontrant que l’étude de la traduction eucaryote en molécule unique est possible.Le troisième projet est une étude de génomique comparative qui permet de rechercher des événements de recodage ainsi que d’autres événements non-conventionnels de la traduction dans le génome de la levure Saccharomyces cerevisiae. L’approche est basée sur une recherche d’organisations génomiques conservées au sein de 19 génomes de levures. Les gènes candidats sont testés in vivo grâce à un vecteur double rapporteur. Cette étude a permis de mettre en évidence le gène VOA1 qui a été ensuite caractérisé plus en détails. / This report describes a study of translation fidelity in Eukarya. Two aspects are tested: the molecular mechanism of recoding and the research of recoding events at the genomic level. During my PhD I have developed three projects:The first project deals with the role of the elongation factor eEF2 in reading frame maintenance. The strategy is based on a random mutagenesis of EFT2 and a phenotypic screening in order to isolate mutants increasing or reducing -1 frameshifting efficiency.The second project describes the development of a single molecule translational system to study the eukaryotic ribosome. Translation initiation is mediated by the CrPV IRES which is initiation factor and initiation tRNA independent. Elongation is monitored with the dissociation of a fluorescent oligonucleotide by the helicase activity of the ribosome. This work is a proof of principle that studying eukaryotic ribosome with single molecule techniques is now feasible.The third project is a comparative genomic approach to search for recoding and unconventional translational events in the genome of yeast Saccharomyces cerevisiae. The approach is based on the detection of conserved genomic organization among 19 Fungi genomes. The candidate genes are then tested in vivo with a dual reporter system. This study allowed the characterization of VOA1 which was further analysed.

La particule de reconnaissance du signal (signal recognition particle-SRP) et son récepteur (FtsY chez Escherichia coli) médiatise le processus simultané de traduction-ciblage de la protéine en dirigeant le complexe ribosome-nascent chain (RNCs) vers la membrane de destination. La reconnaissance par la SRP d'une charge RNC à transporter dépend de la présence de la partie N-terminale. L'assemblage de Ftsy au complexe RNC-PRS entraine plusieurs changements de configuration de SRP et de FtsY durant le cycle de direction. D'abord un stade « précoce » sans GTP est adopté. Celui-ci est stabilisé par le RNC. Ensuite une configuration « fermée » avec GTP est formée. Cette dernière peut s'activer pour hydrolyser GTP, elle entre alors dans sa configuration « active ». La succession de ces trois étapes conduit à la libération du complexe SRP-récepteur d'avec le ribosome et de sa protéine en cours de traduction, et leur mise à disposition au pore de la membrane. Dans ce projet, notre intérêt se limite à la traduction par le ribosome de la séquence signale EspP (RNCEspP). In vivo, EspP est une protéine dont le ciblage vers le récepteur membranaire se réalise après la traduction. Cependant il arrive que RNCEspP se lie au complexe SRP-FtsY, faisant échouer le ciblage. Nous avons étudié les bases structurales du rejet de RNCEspP par SRP et FtsY. Pour cela nous avons effectué la comparaison de la structure RNCEspP-SRP-FtsY obtenue par observation au cryo-microscope électronique avec d'autres complexes ribosome-SRP-récepteurs traduisant la charge FtsQ, qui est elle normalement ciblé par SRP. Nous avons cherché à observer la différence de structure entre les complexes SRP-FtsY dans les deux cas. Deux différences majeurs entre les complexes de ciblages contenants les séquences RNCFtsQ et RNCEspP ont été observés. Premièrement, dans le cas de la structure de RNCEspP le domaine M -Ffh est attaché à l'hélice 59 du ribosome, alors que celui-ci est détaché dans le cas de la structure de RNCFtsQ. Nous pensons que le domaine M empêche la libération de la séquence de signal, étape nécessaire à la réalisation du ciblage. Deuxièmement, dans le cas de la structure du complexe avec RNCEspP l'arrangement Ffh-FtsY avec le domaine NG était flexible. Ceci indiquerait que le complexe “précoce” formé sur RNCEspP est moins stable que celui formé sur RNCFtsQ. Une étude biochimique utilisant le transfert d'énergie via résonance fluorescente a corroboré ce résultat, montrant que FTS Y est lié avec une affinité moindre dans le cas du complexe précoce formé sur RNCEspP et que la reconfiguration au stade de complexe fermé est moins efficace. Une analyse biochimique plus poussée des variantes de la séquence de EspP montre que la partie N-Terminale de la séquence est la principale cause de rejet du cycle de ciblage via SRP.Dans un second projet, nous avons étudié la configuration “fermée” de SRP et ftsY en complexe avec une charge RNC stabilisée par un analogue non-hydrolysable de GTP (GMP-PCP). Pour franchir la barrière cinétique qui permet de passer du complexe précoce au complexe fermé, nous avons utilisé une version tronquée de FtsY, à laquelle la séquence terminale avait été amputée de tout le domaine acide (A-) ainsi que de la première hélice alpha du domaine NG. De plus, pour la formation du complexe, nous avons utilisé une construction contenant les 50 premiers acides aminés du leader peptidase (RNCLep50). En l'absence de nucléotides, notre reconstruction au cryo-EM a montré une configuration similaire à celle du stade précoce, dans laquelle Ftsy et Ffh- domaine NG, sont proche du tetraloop de la 4.5 S ARN. Une incubation avec GMP-PCP induit un détachement du domaine NG d'avec la queue du tetraloop. Il semblerait que les domaines NG soient flexibles dans l'état clos, et non attaché à la terminaison ouverte de l'ARN. / The signal recognition particle (SRP) and its receptor (FtsY in Escherichia coli) mediate co-translational protein targeting by delivering ribosome nascent chain complexes (RNCs) to the target membrane. Recognition of an RNC cargo by SRP is dependent on an N-terminal signal sequence. Binding of FtsY to the RNC-SRP complex leads to several conformational changes of SRP and FtsY during the targeting cycle: first, an “early” GTP-independent state is adopted which is stabilized by the RNC, subsequently a “closed” GTP- dependent conformation is formed which can activate itself to hydrolyze GTP (the “activated” state). Faithful completion of all three steps leads to release of the cargo from SRP-FtsY and hand over of the RNC to the translocation pore.It has been shown for E. coli that cargos can be rejected from the SRP pathway during all targeting steps. In the first project, our interest concentrates on ribosomes translating the EspP signal sequence (RNCEspP). In vivo, EspP is a post-translationally targeted protein, but RNCEspP has been shown to be bound by SRP and FtsY leading to a non-productive “early”-like RNCEspP-SRP-FtsY complex. Using single particle cryo-electron microscopy (EM), we analysed the structural basis for the rejection of RNCEspP by SRP and FtsY. Comparison of our RNCEspP-SRP-FtsY cryo-EM structure to other available cryo-EM structures of co-translational targeting complexes containing the correct cargo RNCFtsQ unravelled differences in the SRP-FtsY structure between a correct cargo and an incorrect cargo. Two major differences between the targeting complexes containing the cargos RNCFtsQ and RNCEspP were observed: first, the Ffh M-domain was attached to ribosomal RNA helix 59 of RNCEspP, while it was detached from this site in the case of RNCFtsQ. It could be that such an ordered M-domain is hampering the release of the signal sequence which is required for successful completion of targeting. Second, the Ffh-FtsY NG-domain arrangement was flexible in the complex with RNCEspP in comparison to RNCFtsQ indicating that the "early"-like complex formed on RNCEspP is less stable. Biochemical data using fluorescence resonance energy transfer corroborated these results, showing that FtsY is bound with lower affinity in the RNCEspP “early” complex and that the rearrangement to the “closed” conformation is less efficient. Further biochemical analysis of EspP signal sequence variants showed that mainly the N-terminal extension of the EspP signal sequence is responsible for its rejection from the SRP pathway.

Une étude récente sur le transfert peptidique pH dépendant effectuée avec divers ARNt aminoacyles a révélé la dépendance au pH du transfert peptidique. L’instabilité hydrolytique rend impossible l’obtention de la valeur expérimentale du pKa de l’eau donné pour le groupement α-amino des esters 3'-aminoacyladenosine. Comme les analogues de la puromycine sont les analogues les plus proches du 3’-terminal des ARNt aminoacyles et qu’ils contiennent une liaison amide stable en position 3’, il est intéressant de déterminer la valeur du pKa du groupement α-amino de différents analogues de la puromycine mais aussi de corréler ces valeurs de pKa aux valeurs de pKa des groupements ARNt aminoacyles correspondants obtenues par le transfert peptidique pH dépendant. Le premier chapitre de la thèse se concentre sur la synthèse de différents analogues de la puromycine et sur la détermination de leur basicité par une analyse RMN pH dépendante. Ce chapitre discutera aussi la conformation intrinsèque des analogues de la puromycine mesurée par la pH dépendance de leur constante de couplage J1’-2’. Les synthèses d’analogues dinucléotidiques, d’un analogue xylo-puromycine et d’un analogue de désoxyxylopuromycine seront aussi décrites. Les conjugués peptidyl-ARN miment des fragments importants d’intermédiaires de la transduction. Ces analogues peuvent être utilisés comme outils expérimentaux pour comprendre l’évolution de la synthèse codée des peptides. L’innovation dans le concept de ‘négoce moleculaire’ entre les peptides, les oligonucléotides et les bicouches lipidiques, qui pourrait être à la base de l’évolution de la synthèse peptidique contrôlée par l’ARN, nous a poussé à synthétiser des conjugués peptidyl-ARN amphiphiliques et à étudier leurs interactions avec les bicouches lipidiques. Dans le deuxième chapitre les stratégies de synthèse sur support solide utilisant des analogues de puromycine comme élément constitutif seront discutées / A recent pH dependent peptidyl transfer assay in the ribosome with various aminoacyl tRNAs revealed the pH dependence of the peptidyl transfer. Hydrolytic instability makes impossible to obtain the experimental bulk water pKa data for the α-amino groups of 3'-aminoacyladenosine esters. Since puromycin analogues are the most similar analogues of the 3’-end of the aminoacyl tRNAs and they contain a stable amide bond in 3’-position, the determination of the pKa value of the α-amino groups of different puromycin analogues and correlation of these pKa values with those of α-amino groups of the corresponding aminoacyl tRNAs obtained by pH dependent peptidyl transfer deserves attention. Chapter 1 of the thesis focuses on the synthesis of different puromycin analogues and on the determination of their basicities by a pH dependent NMR analysis. This chapter also analyses the intrinsic conformations accessed by the puromycin analogues, as measured by the pH dependence of their J1’-2’ coupling constants. The synthesis of dinucleotide analogues, a xylo-puromycin analogue and a deoxyxylopuromycin analogue will also be described. Peptidyl-RNA conjugates mimic important fragments of natural intermediates of translation. These analogues can be used as an experimental tool to understand the evolution of the coded synthesis of peptides. The novelty in the concept of a ‘molecular deal’ between peptides, oligonucleotides and lipidic bilayers, which may be the basis for the evolution of RNA controlled peptide synthesis, prompted us to synthesize amphiphilic peptidyl-RNA conjugates and to study their interactions with lipidic bilayers. In chapter 2 the solid support synthetic strategies using puromycin analogues as the building blocks will be discussed

Au cours des dernières années, le développement de nouvelles thérapies contre les infections bactériennes a suscité un grand intérêt face à l’émergence des nombreuses souches résistantes aux antibiotiques. Le point de départ de cette recherche de nouveaux antibiotiques, pour lesquels les bactéries n’ont pas encore acquis de mécanismes de résistance, est l’identification de nouvelles cibles cellulaires. En 2000, des études génétiques ont identifié engA, un gène bactérien dont le produit est une GTPase, comme une cible pharmacologique pertinente: elle est essentielle à la survie cellulaire, conservée au sein des bactéries et absente chez les eucaryotes.Puisque EngA agit comme un facteur d’assemblage pour le ribosome bactérien, un de nos objectifs a été de développer un test de criblage pour identifier des inhibiteurs des interactions EngA-ribosome. Ces interactions sont modulées par des changements conformationnels d'EngA, qui sont eux-mêmes déclenchés par la fixation de différents nucléotides dans le domaine catalytique. Cependant, les liens entre ces différents changements restent encore méconnus. Nous avons utilisé une approche multi-technique pour étudier ces questions et obtenir des informations utiles pour l’optimisation de notre test de criblage.Des analyses de SAXS et protéolyse limitée ont démontré un changement conformationnel en solution après adition de nucléotides di- ou tri-phosphate. La comparaison des données avec des modèles cristallographiques d'EngA a confirmé la conformation de la protéine liée au GDP. Cependant, la conformation de la protéine liée au GTP ne correspond à aucune structure connue. Des essais d’interaction ont démontré que la fixation de différents nucléotides au niveau des domaines catalytiques régule l’interaction d'EngA avec le ribosome. En outre, les effets des nucléotides se produisent en utilisant des fortes concentrations, ce qui suggère que le rôle d'EngA dans la biogenèse du ribosome peut être contrôlé par la concentration intracellulaire de nucléotides. Les travaux visant la détermination de la structure d'EngA dans sa conformation liée au GTP par cristallographie nous ont permis d’obtenir la structure d’EngA dans différentes formes cristallines. Cependant, ces structures représentent la conformation liée au GDP. L’analyse de l’empilement des cristaux a montré des contacts intermoléculaires conservés qui peuvent stabiliser cette conformation pendant la nucléation. Des mutations spécifiques permettant la rupture de ces contacts peuvent éventuellement aider à promouvoir la cristallisation de conformations alternatives. Des analyses de cryo-microscopie électronique ont débuté afin d’obtenir la structure du complexe EngA:50S de chez B. subtilis. Des résultats préliminaires montrent une carte de densité électronique à 6.4 Å de résolution. L’interprétation de ces résultats est en cours. / The development of new therapeutics against bacterial infections has aroused great interest over the last years in the context of drug resistance. The starting-point in the pursuit of new antibiotics for which bacterial resistance mechanisms do not exist is the identification of novel cellular targets. Genetics studies in the early 2000s have identified engA as a conserved bacterial gene whose product is a GTPase that could represent a potential drug target: it is conserved among bacteria, essential for cell survival, and absent in humans.Since EngA acts as an assembly factor for the bacterial ribosome, one of our aims was to develop an assay to screen inhibitors of the EngA-ribosome interactions. These interactions are modulated by EngA conformational changes that are in turn triggered by the binding of different nucleotides to the catalytic G-domain. As the interplay between all these events in bacteria is still not resolved, we have used a multi-technique approach to explore these questions in order to obtain useful information for the setting up of a robust screening assay.SAXS and limited proteolysis showed a conformational change occurring in solution upon addition of either di- or tri-phosphate nucleotides. While model validation analysis confirmed the GDP-bound conformation, the GTP-bound state does not match any known EngA structure. Binding studies have revealed modulation of interactions by different nucleotide-bound states. Furthermore, response to nucleotides occurs at high concentrations, suggesting that the role of EngA in promoting ribosome assembly could be monitored by the intracellular nucleotide concentration. Efforts on identifying the GTP-bound state 3D structure by crystallography have resulted in EngA structures in different crystal forms. Although all the obtained structures represent the GDP-bound state, packing analysis has revealed conserved crystal contacts that can potentially stabilise this conformation during nucleation. Specific mutations aiming at disrupting these contacts may help to promote crystallisation of alternative conformations. Cryo-EM investigation has been initiated in order to obtain the structure of the B. subtilis EngA:50S complex. So far, an electron density map at 6.4 Å resolution has been obtained and its interpretation is underway.

Proteins with selective toxicity have been investigated for use in many ways. One class of proteins, ribosome-inactivating proteins (RIPs), is found throughout the plant kingdom as well as in lower organisms like certain fungi and bacteria. These are a group of proteins that has the property of damaging the ribosomes in an irreversible manner. They are N-glycosidases that modify the 28S rRNAs to render them incapable of sustaining further translation. RIPs have been divided into two groups, i.e. type I RIPs, which are single polypeptide chains and type II RIPs, which are heterodimeric. Abrin is a type II RIP, isolated from the seeds of Abrus precatorius plant commonly known as jequirity plant. It is a heterodimeric glycoprotein consisting of an A and a B subunit linked together by a single disulfide bond. The toxicity of the protein comes from the A subunit harboring the RNA-N- glycosidase activity which catalyses the depurination of a specific adenine residue at position 4324 on the 28S rRNA. The depurination of the adenine prevents the formation of a critical stem loop structure to which the elongation factor -2 (EF-2) binds during the translocation step of the translation, thus stalling the translation machinery of the cells. The B subunit of abrin is a galactose specific lectin. The lectin activity enables the protein toxin to bind to the cell surface glycoproteins and/or glycolipids. Binding of abrin is followed by internalization of the protein by receptor mediated endocytosis and transport to the Endoplasmic reticulum (ER) by the retrograde transport pathway. Inside the ER, the single disulfide bond linking the two subunits, is reduced which is important for the A subunit toxicity. The A subunit then translocates into the cytosol using the ER-associated degradation (ERAD) pathway and cleaves the specific adenine residue on the 28S rRNA of the 60 S ribosome involved in active translation and thereby inhibiting the protein synthesis. In addition to its ability to inhibit translation, abrin induces apoptosis in cells. Earlier work from our laboratory has shown that abrin-induced apoptosis follows the intrinsic pathway of apoptotic cell death. The treated cells show mitochondrial membrane potential loss followed by caspases -9 and -3 activation and DNA fragmentation. RIPs have been used primarily in immunotherapy because of their toxicity at very low concentrations (picomolar). With the development of monoclonal antibodies as tool for targeting cell surface markers, the possibility to couple antibodies to RIPs and thus deliver the toxic protein directly to specific cells becomes feasible. Abrin, as one such potent RIP, has gained interest in the field of medicine and immunotherapeutics. Abrin can also be a candidate for use in bioterrorism and warfare. Therefore, it is very important to first understand the inhibitory effect of abrin and the extent of its toxicity on cells. Earlier studies from our laboratory have focused on the sensitivity and mechanism of cell death induced by abrin in Jurkat cells, a T –cell line. In the present study, we attempted to investigate the overall toxicity of the molecule with respect to both properties, inhibition of protein translation and induction of apoptosis, in different lineages of cells. We have carried out a comparative study on abrin toxicity on human cell lines from two different cell lineages namely hematopoietic and epithelial. The thesis is divided into introduction and two chapters. In the introduction, we have presented the general properties of this family of proteins, with a brief history; classification and distribution of plant RIPs and their enzymatic properties. The chapter also deals with possible usage of these proteins, mainly in the field of immunotherapy. We have introduced, abrin, the protein of our interest in this chapter. The structure of abrin is described and also the biological effects of the toxin are discussed in brief. The chapter one deals with the translation inhibitory property of the protein, abrin. As mentioned earlier, abrin inhibits protein synthesis via the RNA-N-glycosidase activity residing in its A-chain. We have presented the general cytotoxic pathway of type II RIPs in this chapter. It deals with the internalization and transport of the toxin to their site of action, the cytosol. As reported earlier, our results confirmed that abrin inhibited protein synthesis in all cells. Abrin mediated inhibition of translation was dose dependent. Though the inhibition was common to all the cells from both the lineages, the sensitivity of the cells towards the toxin and kinetics of this inhibition event differed significantly. The kinetics of inhibition of protein synthesis is faster in case of hematopoietic cells as compared to the epithelial cells even at lower doses of the toxin. These differences were not due to variations in the ability of protein synthesis of cells. The chapter also discusses binding of the protein to cells. Our data suggest that binding of abrin to the cells is not responsible for the variations observed in the translation inhibitory property of the protein except in Raji cells. The B-cell line Raji was found to be least sensitive towards the toxin. Our studies show that due to presence of high sialic acid residues on the surface of these cells, Raji cells are refractory to abrin mediated inhibition of protein synthesis. The second chapter presents our data on cell death upon abrin treatment. This part is divided into an introduction and two sections, A and B. In the introduction, different cell death modalities are discussed along with recent findings in the field of programmed cell death. Section A deals with abrin induced apoptosis in epithelial cells. We have compared the extent of abrin-triggered apoptosis in these cells. Some of the early events known in the apoptotic cascade of abrin are compared. Though apoptosis is observed in these cells, our data suggest a delay in the apoptotic trigger in the epithelial cells showing that epithelial cells can survive the stress induced by abrin for a longer time. When treated with other apoptotic agents, like etoposide, these cells are found to be resistant. Therefore, though there is a delay in the trigger of apoptosis, we have shown that the cells tested from the epithelial lineage undergo apoptosis on abrin treatment. Section B, discusses the ability of the protein to induce cell death in hematopoietic cells. We have presented studies on cell death other than apoptosis, detected in these cells upon abrin treatment. We found that some of the cell lines tested undergoes more necrosis than apoptosis with abrin treatment. When the status of the mitochondria was checked, we found that in U266B1 cells, a B-cell line, there was mitochondrial stress as well as reactive oxygen species (ROS) production. But these cells died by necrosis. The data obtained from this study show the involvement of lysosomes and cathepsins in abrin induced cell death in U266B1 cells. Though other cells also undergo necrosis, these events were unique to U266B1 cells.

La plupart des molécules d’ARN doivent se replier en structure tertiaire complexe afin d’accomplir leurs fonctions biologiques. Cependant, les déterminants d’une chaîne de polynucléotides qui sont nécessaires à son repliement et à ses interactions avec d’autres éléments sont essentiellement inconnus. L’établissement des relations structure-fonction dans les grandes molécules d’ARN passe inévitablement par l’analyse de chaque élément de leur structure de façon individuelle et en contexte avec d’autres éléments. À l’image d’une construction d’immeuble, une structure d’ARN est composée d’unités répétitives assemblées de façon spécifique. Les motifs récurrents d’ARN sont des arrangements de nucléotides retrouvés à différents endroits d’une structure tertiaire et possèdent des conformations identiques ou très similaires. Ainsi, une des étapes nécessaires à la compréhension de la structure et de la fonction des molécules d’ARN consiste à identifier de façon systématique les motifs récurrents et d’en effectuer une analyse comparative afin d’établir la séquence consensus. L’analyse de tous les cas d’empaquetage de doubles hélices dans la structure du ribosome a permis l’identification d’un nouvel arrangement nommé motif d’empaquetage le long du sillon (AGPM) (along-groove packing motif). Ce motif est retrouvé à 14 endroits dans la structure du ribosome de même qu’entre l’ARN ribosomique 23S et les molécules d’ARN de transfert liées aux sites ribosomaux P et E. Le motif se forme par l’empaquetage de deux doubles hélices via leur sillon mineur. Le squelette sucre-phosphate d’une hélice voyage le long du sillon mineur de l’autre hélice et vice versa. Dans chacune des hélices, la région de contact comprend quatre paires de bases. L’empaquetage le plus serré est retrouvé au centre de l’arrangement où l’on retrouve souvent une paire de bases GU dans une hélice interagissant avec une paire de bases Watson-Crick (WC) dans l’autre hélice. Même si la présence des paires de bases centrales GU versus WC au centre du motif augmente sa stabilité, d’autres alternatives existent pour différents représentants du motif. L’analyse comparative de trois librairies combinatoires de gènes d’AGPM, où les paires de bases centrales ont été variées de manière complètement aléatoire, a montré que le contexte structural influence l’étendue de la variabilité des séquences de nucléotides formant les paires de bases centrales. Le fait que l’identité des paires de bases centrales puisse varier suggérait la présence d’autres déterminants responsables au maintien de l’intégrité du motif. L’analyse de tous les contacts entre les hélices a révélé qu’en dehors du centre du motif, les interactions entre les squelettes sucre-phosphate s’effectuent via trois contacts ribose-ribose. Pour chacun de ces contacts, les riboses des nucléotides qui interagissent ensemble doivent adopter des positions particulières afin d’éviter qu’ils entrent en collision. Nous montrons que la position de ces riboses est modulée par des conformations spécifiques des paires de bases auxquelles ils appartiennent. Finalement, un autre motif récurrent identifié à l’intérieur même de la structure de trois cas d’AGPM a été nommé « adenosine-wedge ». Son analyse a révélé que ce dernier est lui-même composé d’un autre arrangement, nommé motif triangle-NAG (NAG-triangle). Nous montrons que le motif « adenosine-wedge » représente un arrangement complexe d’ARN composé de quatre éléments répétitifs, c’est-à-dire des motifs AGPM, « hook-turn », « A-minor » et triangle-NAG. Ceci illustre clairement l’arrangement hiérarchique des structures d’ARN qui peut aussi être observé pour d’autres motifs d’ARN. D’un point de vue plus global, mes résultats enrichissent notre compréhension générale du rôle des différents types d’interactions tertiaires dans la formation des molécules d’ARN complexes. / Most RNA molecules have to adopt a complex tertiary structure to accomplish their biological functions. However, the important determinants of a polynucleotide chain that are required for its proper folding and its interactions with other elements are essentially unknown. The establishment of structure-function relationships in large RNA molecules goes inevitably through the analysis of each element of their structure separately and in context with other elements. Like a building, an RNA structure is built of repetitive pieces that are glued together in a specific way. These repetitive elements, instead of being bricks, are recurrent motifs. Recurrent RNA motifs are arrangements of nucleotides found in different parts of a tertiary structure and have identical or very similar conformations. Thus, a necessary step toward the understanding of RNA structure and function consists in the systematic identification of recurrent motifs, followed by their comparative analysis and establishment of their sequence consensus. The analysis of all instances of helical packing within the ribosome structure led to the identification of a new structural arrangement, named the along-groove packing motif (AGPM), which is found in 14 places of the ribosome structure as well as between the 23S ribosomal RNA and the transfer RNA molecules bound to the P and E sites. The motif is formed by the packing of two double helices via their minor grooves. The sugar-phosphate backbone of one helix goes along the minor groove of the other helix and vice versa. In each helix, the contact region includes four base pairs. The closest packing occurs in the center where one can often see a GU base pair packed against a WC base pair. While the presence of the central base pairs GU versus WC in the core of the motif enhances its stability, other alternatives are also present among available structures of the motif. A comparative analysis of three different combinatorial gene libraries of AGPM, in which the central base pairs were fully randomized, shows that the structural context influences the scope of nucleotide sequence variability of the central base pairs. The fact that the identity of the central base pairs can vary suggested that there are other determinants responsible of the motif’s integrity. Analysis of all other inter-helix contacts has shown that outside the center of the motif the interactions between backbones are made via three ribose-ribose contacts. Within each of these contacts, the riboses of the nucleotides that are in touch adopt particular positions in order to provide for collision-free interactions between them. We show that the position of these riboses is modulated by the specific base pair conformation in which it belongs. Finally, another recurrent arrangement that occurs within the structure of three cases of AGPM was identified and called the adenosine-wedge. Analysis has shown that the latter motif is itself composed of a smaller arrangement, called the NAG-triangle motif. We show that the adenosine-wedge motif represents a complex RNA arrangement composed of four repetitive elements, AGPM, the hook-turn, the A-minor and the NAG-triangle, which clearly illustrates the hierarchical organisation of the structure that could also occur in other RNA motifs as well. Altogether, my results enrich our general understanding of the role of different types of tertiary interactions in the formation of large RNA molecules.

La membrane cellulaire est la barrière qui sépare l'intérieur des cellules de l'environnement extérieur. Elle se compose de lipides et de protéines. Les gènes codant pour les protéines membranaires représentent environ 30% des génomes. Les protéines membranaires sont synthétisées dans le cytosol par les ribosomes, mais suivent des voies spécifiques pour s'intégrer dans la membrane cellulaire. Les ribosomes en cours de traduction de protéines membranaires sont reconnus dans le cytosol et adressés à la membrane. Par la suite, les chaînes naissantes de protéines membranaires sont insérées dans la bicouche lipidique puis repliées de façons appropriées, ce mécanisme s'appelle la translocation. Le processus d'adressage est médiée par la particule de reconnaissance du signal (SRP) et son récepteur, tandis que la translocation est effectuée par un certain nombre de complexes de protéines membranaires.Cette thèse décrit deux des complexes impliqués dans cet adressage et translocation co-traductionnelle chez Escherichia coli : Le complexe ribosome-SRP-FtsY pour l'adressage en conformation «fermé» et le complexe dans lequel le ribosome est lié à l'holo-translocon (HTL) qui se compose de sept protéines membranaires. J'ai utilisé principalement la cryo-microscopie électronique pour caractériser ces complexes. La cryo-EM permet de déterminer la structure des échantillons biologiques à une résolution supérieure au nanomètre dans leur environnement natif, sans avoir à le cristalliser. Dans ce travail, j'ai bénéficié des améliorations récentes dans l'équipementet le traitement d'image.A partir d'un ensemble de données de cryo-EM obtenu par les membres du groupe, j‘ai déterminé la structure du complexe ribosome-SRP-FtsY en conformation «fermé» avec une résolution de 5.7 Å. Différentes stratégies de tri des calculsont été appliquées pour identifier la partie la plus homogène de l'ensemble des données. La structure montre un domaine bien résolu SRP ARN et SRP M avec une séquence signal liée. L'interaction entre les SRP et le ribosome pourrait être modélisée avec une grande fidélité. Cette structure révèle également que les GTPases SRP-ftsY sont détachées de la tétra-boucle de l'ARN et sont flexibles, libérant alors le site de sortie du ribosomepermettant la liaison du translocons.Dans le second projet, différentes approches ont été poursuivis pour résoudre la structure du complexe ribosome-HTL à haute résolution. Une structure initiale à 22 Å a été obtenue en mélangeant HTL solubilisés en détergent avec des ribosomes, démontrantla possibilité de préserver le complexe dans les conditions utilisées pour la préparation des grilles. J'ai ensuite exploré l'utilisation de nanodiscs et un nouveau détergent appelé LMNG pour stabiliser HTL dans des tampons sans détergent. Un deuxième ensemble de données a ensuite été recueilli à partir d'échantillon obtenu par gradient de fixation, la structure a été résolue à 17 Å. La préparation des échantillons a été optimisée utilisant entre autre les amphipoles. On a montré que deux types d'amphipole-HTL peuvent se lier au ribosome, et des structures de plus grande résolution devrait être obtenu à partir de ces échantillons. / The cell membrane is the barrier that separates the interior of cells from the outside environment. It consists of lipids and proteins. Genes encoding membrane proteins make up about 30% of the genome. Membrane proteins are synthesized in the cytosol by ribosomes, but employ special pathways to integrate into the cell membrane. Ribosomes translating membrane proteins are recognized by special factors in the cytosol and targeted to the membrane. Subsequently, nascent chains of the membrane proteins are inserted into the lipid bilayer and are folded into their proper structures, a process termed translocation. The targeting process is mediated by the signal recognition particle (SRP) and its receptor, while the translocation is performed by a number of membrane protein complexes.This thesis describes two of the complexes involved in co-translational targeting and translocation in Escherichia coli: The ribosome-SRP-FtsY targeting complex in the “closed” conformation and the complex of a ribosome with the holo-translocon (HTL) consisting of seven membrane proteins. I mainly used electron cryo-microscopy to characterize these complexes. Cryo-EM allows structural determination of biological samples at sub-nanometer resolution in their native environment, without the need to crystallize the specimen. In this work, I took advantage of the recent advances in both the hardware and the image processing.Starting from a cryo-EM dataset obtained by group members, I have determined the structure of ribosome-SRP-FtsY complex in the “closed” conformation at 5.7 Å resolution. Different computational sorting strategies were applied to identify the most homogeneous sub-pool of the dataset. The structure shows a well-resolved SRP RNA and SRP M domain with a signal sequence bound. The interaction between SRP and ribosome could be modeled with high confidence. This structure also reveals that the SRP-FtsY GTPases are detached from the RNA tetraloop and are flexible, thus liberating the ribosomal exit site for binding of the translocation machinery.In the second project, different approaches were pursued to solve the structure of the ribosome-HTL complex at high resolution. An initial structure at 22 Å was obtained by mixing detergent-solubilized HTL with the ribosome, demonstrating that it is possible to preserve the complex under the conditions used for specimen preparation. I have then explored the use of nanodiscs and a new detergent called LMNG to stabilize HTL in detergent-free buffers. A second dataset was subsequently collected from a sample prepared by gradient-fixation, and the structure was solved at 17 Å. Sample preparation has been optimized further using amphipols. Two types of amphipol-HTL complexes were shown to bind to the ribosome, and higher resolution structures are expected to be obtained from these samples.