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Das nur 16,5 kDa große Survivin ist ein bifunktionales Protein, welches eine bedeutende Rolle in zwei wichtigen zellulären Prozessen spielt, der Apoptose und der Mitose. Aufgrund seiner BIR Domäne wird es zu den Inhibitor der Apoptose Proteine (IAP) gezählt. Diese Gruppe an Proteinen interferiert negativ mit der Aktivierung der Caspasen und wirkt somit einer Induktion der Apoptose entgegen. Neben seiner anti-apoptotischen Funktion besitzt das Survivin zudem eine essentielle Rolle bei der Segregation der Chromosomen und während der Zytokinese. In der Mitose bildet Survivin mit Borealin, INCENP und der mitotische Aurora B Kinase den Chromosomalen Passenger Complex (CPC). Das Survivin besitzt zudem eine grosse medizinische Relevanz und gilt als Tumor-assoziertes Antigen, da es zu den Top vier Transkripten zählt, die in einer Vielzahl unterschiedlicher Tumorentitäten überexprimiert werden, aber nicht in Normalgewebe. Diese Überexpression geht einher mit einer erhöhten Resistenz der Tumore gegenüber Chemo- und Strahlentherapie und macht Survivin zu einem idealen molekularen Ziel einer Krebstherapie mittels RNA Interferenz oder spezifischer pharmakologischer Inhibitoren. In einer Vielzahl an Studien, in denen das Survivin-Protein mittels RNAi, dominant negativer Proteine oder „knock out“ des Survivin Genes (BIRC5) aus geschalten wurde, konnte eine Aktivierung des Tumorsuppressorproteins p53, einem wichtigen Mediator der Zellzyklusregulation, beobachtet werden. Bis heute ist es weitgehend unklar, wie eine Aktivierung von p53 nach einem Survivin Verlust erfolgen kann. Zudem stellte sich die Frage, ob eine therapeutische Intervention, welche die Ausschaltung des Survivin-Proteins zum Ziel hat, neben Tumorzellen auch normales Gewebe schädigen kann. Da Tumorzellen sich von normalen Zellen insbesondere dadurch unterscheiden, dass sie Defekte in p53-Signalwegen bzw. eine inaktivierende p53-Mutation oder Gendeletion besitzen, wurde die Auswirkung einer Survivin-Depletion auf p53-positive Tumorzellen und auf isogene Tumorzellen mit ausgeschalteten p53 untersucht. Zu diesem Zweck wurde p53 mittels RNAi in U87-MG und MCF-7 Zellen ausgeschalten und stabile p53-defiziente Zellen generiert. Insgesamt standen für die Untersuchungen mit HCT116, MCF-7 und U87-MG drei Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs sowie ihre isogenetischen, aber p53-defizienten Derivate zur Verfügung. Survivin wurde in diesen Zellen durch einen retroviralen Vektor, der für eine shRNA (small hairpin RNA) gegen Survivin codiert, ausgeschalten. Der Verlust an Survivin führte dabei in Wildtyp- als auch in den p53-defizienten Zellen zu Polyploidie, einer gestörten Zytokinese und multipolaren Spindeln. Zusätzlich konnte eine Induktion an p53/p21waf/cip sowie eine erhöhte, p53- und Caspase 3-unabhängige Apoptose festgestelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression an p21waf/cip in Wildtyp-Zellen sowie seines potentiellen Targets Cyclin D1 mit der Zunahme an Polyploidie nach Survivin RNAi korreliert. Allerdings führt die Expression des Cdk Inhbibitors p21waf/cip nur zu einem transienten Arrest der Zellen, da polyploide, Survivin-depletierte Zellen BrdU inkorporierten und dadurch proliferierten. Zudem wird zum ersten Mal eine ATM/ATR abhängige „DNA Damage Response“ (DDR) in Survivin-depletierten p53-defzienten und Wildtyp Zellen beschrieben, die zu einer Phosphorylierung und Stabilisierung von p53 führt. Sky-Analysen bestätigten numerische als auch schwere chromosomale Aberrationen wie Translokationen und dizentrische Chromosomen in Survivin-depletierten polyploiden Zellen. Die Inhibierung der Aurora B Kinase, einem weiteren Bestandteil des CPC, mittels eines chemischen Inhibitors zeigt analog das Auftreten von DNA Schäden, eine p53/p21waf/cip Aktivierung sowie eine Zunahme an Polyploidie, wie sie für Survivin beschrieben wurde. Diese Erkenntnisse zeigen deutlich auf, dass die DNA Schäden und der p53/p21waf/cip-abhängige G1 Arrest nach dem „knock down“ von Survivin aufgrund einer gestörten Mitose hervorgerufen wurde, während eine IAP-Funktion des Survivins unter den gewählten experimentellen Bedingungen nicht festzustellen war.

Les associations symbiotiques constituent un moteur majeur de la diversification écologique et évolutive des organismes métazoaires. Chez les insectes, elles ont conduit, au cours de l’évolution, à l’émergence d’un nouveau type cellulaire spécialisé dans l’hébergement des bactéries symbiotiques, les bactériocytes. Ces cellules demeurent une énigme fascinante de la symbiose, les processus déterminant leur développement, leur morphogenèse et leur dégénérescence restant encore méconnus. Dans cette étude, nous avons utilisé la symbiose entre le puceron Acyrthosiphon pisum et son endosymbiote obligatoire, Buchnera aphidicola, comme système modèle. En combinant des approches inédites de cytométrie en flux et d’imagerie cellulaire, nous avons démontré une régulation fine et coordonnée des dynamiques de croissance et de dégénérescence des bactériocytes et des symbiotes bactériens, en accord avec les besoins physiologiques de l’insecte. De l’embryon à l’âge adulte, les cellules symbiotiques croissent de manière exponentielle, répondant aux besoins nutritionnels de l’hôte qui nécessite pour son développement de grandes quantités d’acides aminés essentiels produits par le métabolisme bactériocytaire. Avec la sénescence du puceron, les bactériocytes diminuent en nombre, en taille et subissent une dégénérescence progressive. Ce processus dégénératif ne montre pas les signes classiques de l’apoptose. Il résulte d’une hypervacuolisation cytoplasmique, dérivée du réticulum endoplasmique, déclenchant une cascade de réponses cellulaires dont l’activation des voies autophagique et lysosomale. Ce phénomène de mort cellulaire non-apoptotique en deux étapes, rappelant la paraptosis, n’a jamais été décrit chez les insectes et sa découverte ouvre la voie à l’étude des régulations agissant sur l’homéostasie bactériocytaire. Dans le dernier volet de cette thèse, nous avons procédé à l’étude fonctionnelle du gène PAH, fortement exprimé dans les bactériocytes et potentiellement impliqué dans la régulation de leur homéostasie. Les résultats obtenus n’ont pas révélé de phénotype bactériocytaire, après ARN interférence, mais ont permis de démontrer un rôle essentiel de ce gène dans la morphogenèse des insectes. / Symbiotic associations constitute a driving force in the ecological and evolutionary diversification of metazoan organisms. Over the evolution, they have led to the emergence, in insects, of a novel eukaryotic cell type, the bacteriocytes, specialized in harboring symbiotic bacteria. These cells constitute a fascinating enigma in cell biology, as the processes underpinning their development, morphogenesis and degeneration remain still unsolved. In my PhD thesis, we have used the nutritional symbiosis between the aphid, Acyrthosiphon pisum, and its obligate endosymbiont, Buchnera aphidicola, as a model system. We have first developed a novel approach for counting symbiotic bacteria, based on flow cytometry, and showed that the endosymbiont population increases exponentially throughout aphid nymphal development, with a growing rate that has never been characterized by indirect molecular techniques. Using histology and imaging techniques, we have shown that bacteriocytes also increase significantly in number and size during nymphal development. Once adulthood is reached, the dynamics of symbiont and host cells is reversed: the number of endosymbionts decreases progressively and bacteriocytes start to degenerate. These results show a coordination of the cellular dynamics between bacteriocytes and primary symbionts, and reveal a fine-tuning of aphid symbiotic cells to the nutritional demand imposed by the host physiology throughout development. Interestingly, the degenerative process that bacteriocytes undergo with aging exhibits morphological features distinct from the evolutionary conserved apoptotic cell deaths. It originates from an extensive ER-derived hypervacuolation, triggering a cascade of cellular stress responses including the activation of autophagy and lysosomal pathways. This stepwise non-apoptotic cell death, sharing several features with paraptosis, has hitherto never been characterized in insects and its discovery opens the way to the identification of the molecular mechanisms acting on bacteriocyte homeostasis. In the last part of this PhD project, we have proceeded to the characterization of the PAH gene functions in aphid physiology, using an RNA interference (RNAi) approach. Our results show that, even though this gene is highly expressed in bacteriocytes, it is not involved in the regulation of their homeostasis. Nevertheless, we have demonstrated a new role for this metabolic gene in insect embryonic development and morphogenesis.

Das nur 16,5 kDa große Survivin ist ein bifunktionales Protein, welches eine bedeutende Rolle in zwei wichtigen zellulären Prozessen spielt, der Apoptose und der Mitose. Aufgrund seiner BIR Domäne wird es zu den Inhibitor der Apoptose Proteine (IAP) gezählt. Diese Gruppe an Proteinen interferiert negativ mit der Aktivierung der Caspasen und wirkt somit einer Induktion der Apoptose entgegen. Neben seiner anti-apoptotischen Funktion besitzt das Survivin zudem eine essentielle Rolle bei der Segregation der Chromosomen und während der Zytokinese. In der Mitose bildet Survivin mit Borealin, INCENP und der mitotische Aurora B Kinase den Chromosomalen Passenger Complex (CPC). Das Survivin besitzt zudem eine grosse medizinische Relevanz und gilt als Tumor-assoziertes Antigen, da es zu den Top vier Transkripten zählt, die in einer Vielzahl unterschiedlicher Tumorentitäten überexprimiert werden, aber nicht in Normalgewebe. Diese Überexpression geht einher mit einer erhöhten Resistenz der Tumore gegenüber Chemo- und Strahlentherapie und macht Survivin zu einem idealen molekularen Ziel einer Krebstherapie mittels RNA Interferenz oder spezifischer pharmakologischer Inhibitoren. In einer Vielzahl an Studien, in denen das Survivin-Protein mittels RNAi, dominant negativer Proteine oder „knock out“ des Survivin Genes (BIRC5) aus geschalten wurde, konnte eine Aktivierung des Tumorsuppressorproteins p53, einem wichtigen Mediator der Zellzyklusregulation, beobachtet werden. Bis heute ist es weitgehend unklar, wie eine Aktivierung von p53 nach einem Survivin Verlust erfolgen kann. Zudem stellte sich die Frage, ob eine therapeutische Intervention, welche die Ausschaltung des Survivin-Proteins zum Ziel hat, neben Tumorzellen auch normales Gewebe schädigen kann. Da Tumorzellen sich von normalen Zellen insbesondere dadurch unterscheiden, dass sie Defekte in p53-Signalwegen bzw. eine inaktivierende p53-Mutation oder Gendeletion besitzen, wurde die Auswirkung einer Survivin-Depletion auf p53-positive Tumorzellen und auf isogene Tumorzellen mit ausgeschalteten p53 untersucht. Zu diesem Zweck wurde p53 mittels RNAi in U87-MG und MCF-7 Zellen ausgeschalten und stabile p53-defiziente Zellen generiert. Insgesamt standen für die Untersuchungen mit HCT116, MCF-7 und U87-MG drei Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs sowie ihre isogenetischen, aber p53-defizienten Derivate zur Verfügung. Survivin wurde in diesen Zellen durch einen retroviralen Vektor, der für eine shRNA (small hairpin RNA) gegen Survivin codiert, ausgeschalten. Der Verlust an Survivin führte dabei in Wildtyp- als auch in den p53-defizienten Zellen zu Polyploidie, einer gestörten Zytokinese und multipolaren Spindeln. Zusätzlich konnte eine Induktion an p53/p21waf/cip sowie eine erhöhte, p53- und Caspase 3-unabhängige Apoptose festgestelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression an p21waf/cip in Wildtyp-Zellen sowie seines potentiellen Targets Cyclin D1 mit der Zunahme an Polyploidie nach Survivin RNAi korreliert. Allerdings führt die Expression des Cdk Inhbibitors p21waf/cip nur zu einem transienten Arrest der Zellen, da polyploide, Survivin-depletierte Zellen BrdU inkorporierten und dadurch proliferierten. Zudem wird zum ersten Mal eine ATM/ATR abhängige „DNA Damage Response“ (DDR) in Survivin-depletierten p53-defzienten und Wildtyp Zellen beschrieben, die zu einer Phosphorylierung und Stabilisierung von p53 führt. Sky-Analysen bestätigten numerische als auch schwere chromosomale Aberrationen wie Translokationen und dizentrische Chromosomen in Survivin-depletierten polyploiden Zellen. Die Inhibierung der Aurora B Kinase, einem weiteren Bestandteil des CPC, mittels eines chemischen Inhibitors zeigt analog das Auftreten von DNA Schäden, eine p53/p21waf/cip Aktivierung sowie eine Zunahme an Polyploidie, wie sie für Survivin beschrieben wurde. Diese Erkenntnisse zeigen deutlich auf, dass die DNA Schäden und der p53/p21waf/cip-abhängige G1 Arrest nach dem „knock down“ von Survivin aufgrund einer gestörten Mitose hervorgerufen wurde, während eine IAP-Funktion des Survivins unter den gewählten experimentellen Bedingungen nicht festzustellen war.

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The purpose of this thesis was to study mitosis in Drosophila, from a network biology perspective. The primary aim was to develop and test a network-based prediction model that could integrate available data in public databases (like Flybase) and, based on that, predict potential mitotic proteins. The approach taken to design the protein interaction network included the use of a priori knowledge about the microtubule composition of the mitotic spindle and the higher likelihood of microtubule-associated proteins (MAPs) to have a putative mitotic function. The design also included the integration of different complementary datasets, from gene expression and functional RNAi screens to cross species conservation of MAPs for fitting a network-based model for predicting mitotic proteins. I begin with the creation of the MAP interactome based on a MAP dataset in Drosophila. This initial network was extended by transferring homologs and interologues of MAP datasets from four other species, i.e. human, mouse, rat and Arabidopsis. These proteins were then used as seed proteins to conduct a virtual pull-down experiment, by adding indirect interactors into the network, i.e. proteins that directly bind to two or more MAPs within the network, which completed the MAP interactome. Data from genome-wide studies in Drosophila were gathered for each node in the MAP interactome. These ‘layers’ of data were then used as features to fit a prediction model that could score each node in the network, based on the likelihood of its role in mitosis. The final model performed with 96% accuracy after 10-fold cross validation and was used to rank all the proteins in the MAP interactome. By analysing the top 100 high scoring predicted mitotic proteins, a highly connected cluster of 33 proteins was identified that was subject to experimental validation in the lab. The first approach was to conduct an in vitro analysis using an RNAi screen to test for any spindle, chromosome or centrosome phenotypes upon gene knockdown. After two independent RNAi screens, around 80% of the proteins produced mutant mitotic phenotypes strongly supporting the results of the MAP prediction model. The second approach was to conduct an in vivo analysis by expressing GFP- fusion constructs of selected genes from the subcluster. These were expressed in Drosophila early embryos to study their subcellular localization during interphase and mitosis. A variety of localizations were observed ranging from chromatin and microtubules to more generic cytoplasmic localizations. These results suggested not all predicted proteins were co-localizing with microtubules, and therefore might not necessarily be microtubule associated proteins but can possibly be functioning as microtubule associated regulator proteins. Proteomics analysis of a subset of these genes showed a large proportion of false positive interactions but also picked new interactions between member proteins that highlighted a module within the subcluster. The RNAi hits from the in vitro analysis and the members of the module within subcluster-16 from the in vivo analysis provide interesting subjects for further characterization.

Preliminary studies from our laboratory showed that cPLA2α may be responsible for approximately 50-60% of the PGE2 production in response to inflammatory cytokines. Thus, we hypothesized that a closely-related PLA2 is responsible for 40-50% of the PGE2 produced in response to inflammatory cytokines. To this end, we utilized RNAi technology, extensively optimized, to down regulate the expression of closely-related isoforms of phospholipase A2 in A549 cells and used an enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) to quantitate the PGE2 produced. These studies found that cytosolic phospholipase A2α (cPLA2α) regulated 97.7% of the prostaglandin E2 (PGE2) produced in response to inflammatory cytokines (e.g. IL-1β or TNFα), as well as regulating the basal levels of this prostanoid. Furthermore, cPLA2γ, cPLA2δ, and iPLA2 were found to also to regulate the basal levels of PGE2 production. On the other hand, cPLA2β was not involved in prostanoid synthesis in A549 cells either in the presence or absence of inflammatory cytokines. Thus, our studies show that cPLA2α plays the pivotal role in the production of PGE2 in response to inflammatory cytokines, and suggests that cPLA2α may be a possible drug target in diseases such as asthma, inflammation, and cancer.