Le S-nitrosoglutathion (GSNO), donneur d’oxyde nitrique (NO) physiologique, présente une application potentielle dans le traitement des maladies cardiovasculaires (CVD). Cependant, avec une demi vie supérieure à celle de NO, GSNO reste labile limitant ainsi son application. Cette étude vise au développement de particules nanocomposites (NCP) incluant des nanoparticules polymériques chargées en GSNO (GSNO-NP) dans une matrice polysaccharidique pour la voie orale. Bien que les GSNO-NP encapsulant efficacement GSNO, le libèrent rapidement in vitro, elles retardent la S-nitrosation (biomarqueur de NO) des protéines de cellules musculaires lisses en culture (18 h). Par conséquent, pour une libération prolongée, les GSNO-NP ont été incluses dans une matrice d’alginate (a), chitosan (c) ou un mélange des deux (acNCP). Les GSNO-acNCP avec une encapsulation élevée (76%) et une libération in vitro jusqu’à 24 h, ont significativement favorisé le passage de GSNO au travers d’un modèle de barrière intestinale (Caco-2). A la lumière de cette compatibilité avec un traitement oral journalier, le gavage de rats Wistar avec ces GSNO-acNCP 17 h avant prélèvement de l’aorte a diminué la contraction maximale phényléphrine (PHE) dépendante d’anneaux aortiques isolés. De plus, la N-acétylcystéine (NAC) (thiol déstockant NO tissulaire) produit la relaxation d’anneaux précontractés avec la PHE, prouvant le stockage de NO au sein de la paroi vasculaire. En augmentant le temps de résidence gastrointestinale et donc le passage de GSNO au travers de l’intestin, les GSNO-acNCP produisent un effet prolongé (17 h après administration) par l’intermédiaire du stockage de NO au niveau tissulaire / As a physiologic nitric oxide (NO) donor, S-nitrosoglutathione (GSNO) has potential therapeutic application for the treatment of cardiovascular disease (CVD). With a longer in vivo half-life than NO, GSNO is still sensitive to many factors leading to poor applicability. This study aimed at the development of nanocomposite particles (NCP) based on synthetic polymeric nanoparticles encapsulating GSNO (GSNO-NP) embedded in a polysaccharidic matrix for oral delivery of GSNO. Although GSNO-NP, with a high encapsulation efficiency, showed an in vitro burst release, they succeeded in the preservation of GSNO stability and bioavailability for smooth muscle cells as they delayed in vitro protein S-nitrosation (NO biomarker) until 18 h. Therefore, to reach the sustained release, GSNO-NP were embedded in a matrix of alginate (a), chitosan (c) or a blend (acNCP). GSNO-acNCP with high encapsulation efficiency (76%) and an in vitro release until 24 h, promoted the highest permeation rate of GSNO through an intestinal barrier model (Caco-2). With this daily oral treatment compatibility Wistar Rat pretreatment by gavage with GSNO-acNCP 17 h before aorta removal decreased the maximal contractile effect induced by phenylephrine (PHE) on isolated aortic rings. Furthermore, the N-acetylcysteine (a thiol displacing NO stores from tissues) produced the relaxation of PHE precontracted aortic rings, proving NO storage in the vessel wall. By increasing the residence time in the gastrointestinal tract thus promoting GSNO crossing through the intestinal barrier, GSNO-acNCP induced a long lasting effect (17 h after administration) through NO storage in vessels

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) représentent un problème de santé publique majeur touchant de jeunes patients. Aux récidives inflammatoires, à la mauvaise qualité de vie et à l’espérance de vie réduite des patients viennent s’ajouter la durée, l’efficacité parfois limitée et le coût des traitements actuellement proposés. La recherche de nouvelles stratégies permettant de prévenir les récidives inflammatoires est primordiale. Ainsi, le rôle du S-nitrosoglutathion (GSNO, donneur et forme de stockage naturelle de NO) dans le maintien de l’intégrité de la barrière intestinale est étudié dans cette thèse, en décrivant : i) l’effet concentration-dépendante du GSNO sur la perméabilité intestinale (modèle de chambre de Ussing, expression des protéines de jonctions cellulaires…), ii) des formulations innovantes de GSNO (nanoparticules composites) à base de nanoparticules d’Eudragit®RL, elles-mêmes encapsulées dans une matrice polymérique à base d’alginate. Différents procédés de formulation ont été testés. Une caractérisation physicochimique des objets développés et des études de perméabilité sur des modèles cellulaires (Caco-2) ont conduit à l’obtention de trois formulations, adaptées à la voie orale et permettant de délivrer de façon prolongée le GSNO. Cependant, la prise en charge du GSNO libre ou formulé, l’identification des cibles du NO au niveau intestinal, mais aussi les doses et durées du traitement in vivo restent encore à définir avant de proposer ce donneur de NO comme candidat pour un traitement préventif des MICI / Inflammatory bowel diseases (IBD) (Crohn’s disease, ulcerative colitis…), are disabling pathologies affecting young patients and presenting the particularity that most of the current agents act by down regulating chronic inflammation in the intestine mucosa and cannot cure the disease. As the pivotal role of S-nitrosoglutathione (GSNO) in preventing intestinal inflammation and gut barrier failure has been clearly pointed out, therapies based on pharmaceutical technology to limit chronic inflammation and prevent relapses of barrier failure by an optimized dosage form of GSNO appears as an interesting challenge. The objective of this project relies on i) studying GSNO concentration/response functions in intestine by using Ussing chamber ex vivo model and following protein cell junction expression, ii) developing polymer nanocomposite particles encapsulating GSNO and adapted to the oral route, with GSNO protection, controlled delivery and local effect in intestine as major requirements. GSNO loaded polymeric (Eudragit® RL) nanoparticles were included in polymer matrix based on alginate; different processes were tested and particles were characterized: high GSNO loading, GSNO sustained release and local retention for 4 h in cellulo study (Caco-2) were obtained. Thus, therapies based on GSNO administration should represent a novel strategy to limit chronic inflammation and prevent relapses of barrier failure in IBD patients

L'athérosclérose est une maladie chronique à évolution lente caractérisée par la formation de plaques d'athérome, consistant en l’accumulation de lipoprotéines de basse densité (LDL), de leucocytes, de cellules spumeuses, la migration des cellules musculaires lisses (CML) et l’altération des cellules endotheliales (ECs). Ces phénomènes conduisent à la formation d'un noyau nécrotique incluant des régions calcifiées. La genèse de l'athérosclérose et de l’instabilité de la plaque d’athérome sont le résultat d'une synergie entre inflammation et stress oxydant. Les données actuelles identifient plusieurs populations de macrophages dans la plaque d’athérome présentant différents phénotypes en lien avec l’inflammation (pro-inflammatoire: M1, anti-inflammatoire: M2) ou avec des modifications redox de l’environnement (Mox). Stress oxydant et inflammation sont liés et jouent un rôle important dans (i) la dysfonction endothéliale induisant une diminution de la biodisponibilité du monoxyde d’azote (NO), (ii) l'oxydation des LDL, (iii) le remodelage de la lésion (régulation de protéases et d’antiprotéases) et (iv) la prolifération des CML. Les CML sont le deuxième type cellulaire le plus abondant dans la lésion athérosclérotique après les macrophages, leur hyperprolifération est la conséquence d’une dédifférenciation cellulaire d’un phénotype contractile à sécrétoire, augmentant leur capacité proliférative et migratoire. Les donneurs de NO, comme les S-nitrosothiols, connus également pour protéger contre le stress oxydant grâce essentiellement à la S-nitrosation, peuvent contrer la carence en NO. Parmi eux, le S- nitrosoglutathion (GSNO), forme physiologique de stockage de NO dans les tissus, spécifiquement metabolisé par la gamma-glutamyl transférase (GGT) peut être envisagé. La corrélation entre l’augmentation des concentrations sériques de GGT et les facteurs de risque cardiovasculaire a récemment été démontrée. En particulier, seule la b-GGT s'accumule dans les plaques d'athérome, et concorde avec l’apparition d'autres marqueurs histologiques de vulnérabilité de la plaque. Étant donné que, les macrophages et les CML sont les principaux types cellulaires retrouvés dans les lésions athérosclérotiques et semblaient être colocalisés avec la GGT, l'attention de ce travail de thèse a été centrée sur la compréhension de la provenance de la GGT et son rôle dans le métabolisme du GSNO au sein de la plaque d’athérome. Une première partie de ce manuscrit vise à identifier l'origine de la GGT accumulée dans la plaque d’athérome, et à élucider entre le stimulus inflammatoire et oxydant, qui est responsable de l'accumulation de GGT dans la plaque d'athérome. La deuxième partie a été consacrée à la restauration de la biodisponibilité de NO dans les CML en condition de stress oxydant avec un intérêt particulier porté sur l'identification des protéines S-nitrosés / Atherosclerosis is a slowly progressing chronic disease characterized by the formation of atherosclerotic plaques consisting of accumulated low density lipoprotein (LDL), leukocytes, foam cells, migrated smooth muscle cells (SMCs) and altered endothelial cells (ECs), leading to the formation of necrotic cores with calcified regions. Atherosclerosis genesis and subsequent instability of atherosclerotic plaques result from a synergy between inflammation and oxidative stress. Current data identified several macrophage populations within the atherosclerotic plaque showing different inflammatory phenotypes (pro-inflammatory: M1, anti-inflammatory: M2) or functions in response to redox changes in the environment (Mox). The oxidative stress linked to inflammation plays an important role in (i) endothelial dysfunction, with reduced nitric oxide (NO) bioavailability, (ii) LDL oxidation, (iii) lesion remodeling (regulation of proteases and antiproteases) and (iv) SMCs proliferation. Indeed, SMCs are the second more abundant cell type, after macrophages, in the atherosclerotic lesion because their dedifferentiation from contractile to secreting phenotype increased their proliferation and migration capacity. NO donors, like S-nitrosothiols, also known to protect from oxidative stress by S-nitrosation, could counteract this NO deficiency. Among them, the S-nitrosoglutathione (GSNO), a physiological storage form of NO in tissues, specifically catabolized by the gamma-glutamyltransferase (GGT) is considered. Recently, it has been shown that the increased serum level of GGT is an independent risk factor for cardiovascular mortality related to atherosclerotic disease. In particular, only the big fraction (b-GGT) has been detected inside human atherosclerotic plaques associated to CD68+ macrophage-derived foam cells. As macrophages and SMCs are the main cell types found in atherosclerotic lesion and seemed to be colocalized with GGT, the attention of this thesis work was focused on the understanding of GGT provenance and its role in the GSNO metabolism within the atherosclerotic plaque. A first part of the thesis was to identify the origin of GGT accumulating inside atherosclerotic plaques, and to decipher between inflammation and oxidative stress stimuli, which one is responsible of GGT accumulation in atherosclerotic plaques. The second part was dedicated to the restoration of NO bioavailability within SMCs under oxidative stress with a focus on the identification of S-nitrosated proteins

Les S-nitrosothiols (RSNO) comme le S-nitrosoglutathion (GSNO) sont des donneurs de monoxyde d’azote (NO) prometteurs pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Cependant, ce sont des candidats médicaments peu stables. Précédemment, des nanoparticules chargées en GSNO (GSNO-NP) ont été incluses dans une matrice d’alginate/chitosan. Les particules composites ainsi produites avaient une bonne encapsulation et une libération prolongée de GSNO. De plus, leur administration orale à des rats produisait un stock de NO au niveau de la paroi de l’aorte. Elles avaient cependant plusieurs limitations : préparation et caractérisation longues, manque de stabilité et de reproductibilité. Ce travail avait donc trois objectifs : (1) déterminer le mécanisme d’absorption intestinale des RSNO non formulés ; (2) évaluer la capacité des RSNO non formulés à créer un stock vasculaire de NO ; 3) optimiser la formulation de GSNO. Nous avons montré, dans un modèle in vitro de barrière intestinale, que la perméabilité intestinale de GSNO, S-nitroso-N-acétylcystéine (NACNO) et S-nitroso-N-acetylpénicillamine (SNAP) se fait par un mécanisme passif, principalement par voie transcellulaire (également paracellulaire pour SNAP), avec une perméabilité moyenne. Après avoir traversé la barrière intestinale, les RSNO atteindront les vaisseaux sanguins. Pour comparer leur capacité à former un stock vasculaire de NO dans des aortes (avec endothélium intact ou retiré), nous avons quantifié le stock, vérifié sa biodisponibilité pour la vasorelaxation et évalué son impact sur une vasoconstriction induite par la phénylephrine (PHE). L’incubation des aortes avec les RSNO augmente le stock basal de NO par un facteur trois à cinq. Ce stock est mobilisable pour induire la vasorelaxation et efficace pour diminuer la réactivité vasculaire à la PHE (NACNO>GSNO = SNAP), seulement dans les aortes dont l’endothélium a été retiré. Comme la perméabilité intestinale des RSNO est moyenne, l’intégration du GSNO dans une formulation appropriée est nécessaire. Vu l’impossibilité de résoudre les problèmes liés aux particules composites, le protocole de production des GSNO-NP a été modifié pour produire des microparticules (deux types selon l’état liquide ou solide de GSNO dans la phase interne de l’émulsion). Les deux types de microparticules avaient une libération de GSNO ralentie par rapport aux GSNO-NP. Les nano- comme les micro-particules ont pu être stabilisées par lyophilisation, et amélioraient la perméabilité intestinale de GSNO (jusqu’à une forte perméabilité avec les microparticules). Par conséquent, une administration orale de nano/microparticules chargées en GSNO/RSNO pourrait représenter une nouvelle approche thérapeutique pour les maladies cardiovasculaires. / S-nitrosothiols (RSNOs) such as S-nitrosoglutathione (GSNO) are promising nitric oxide (NO) donors for cardiovascular diseases treatment. However, they are poorly stable drug candidates. In previous studies, GSNO-loaded nanoparticles (GSNO-NP) were embedded into an alginate/chitosan matrix. Resulting nanocomposite particles showed high encapsulation and sustained release of GSNO, and led to the formation of a NO store in the wall of aorta after a single oral administration to rats. However, these nanocomposite particles have several limitations such as time-consuming preparation, lack of both stability and reproducibility. This thesis work aimed at: 1) Elucidate the mechanism of free RSNOs intestinal absorption; 2) Evaluate ability of free RSNOs to form a vascular NO store; 3) Optimize the GSNO formulation. In this study, we showed that the intestinal permeability (in vitro model of intestinal barrier) of GSNO, S-nitroso-N-acetylcysteine (NACNO) and S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) was a passive diffusion, following the transcellular pathway (and also the paracellular way for SNAP) and belonging to the medium permeability class. After crossing the intestinal barrier, RSNOs will reach the vasculature. In order to compare the ability of free RSNOs to form a vascular store of NO either in endothelium-intact or endothelium-removed aortae, we quantified the store, verified its bioavailability for vasorelaxation and evaluated its impact on phenylephrine (PHE)-induced vasoconstriction. Incubation with RSNOs increased the basal NO store three to five times. This store is still bioavailable to induce vasorelaxation and efficient to induce vascular hyporeactivity to PHE (NACNO> GSNO = SNAP) only in endothelium-removed aortae. As intestinal permeability of RSNOs was in the medium class, the integration of GSNO into an appropriate delivery system is essential. Limitations of previously developed nanocomposites particles were impossible to bypass so the production process of GSNO-NP was modified (liquid or solid GSNO in the internal phase of the emulsion) to produce microparticles. Both kinds of microparticles exhibited a slower release of GSNO than GSNO-NP. Nano-and micro-particles were stable after lyophilization and presented an enhancement of GSNO intestinal permeability (up to high permeability class for microparticles). Thus, oral administration of GSNO/RSNO loaded nano/micro particles seems to be a promising avenue for the treatment of cardiovascular diseases.