Chez les eucaryotes, la maturation de l’extrémité 3’ des ARNs messagers a lieu lors de la transcription et regroupe deux étapes : le clivage endonucléolytique du transcrit au niveau d’un site spécifique et l’ajout d’une queue poly(A) sur le fragment en amont du site de clivage. Chez S. cerevisiae, le complexe de polyadénylation est formé par 20 protéines, regroupées principalement en deux sous-complexes : CF IA et CPF. Nous nous intéressons plus spécifiquement à Pcf11, sous-unité du complexe CF IA. Pcf11 est formé de sept sous-domaines, mais la fonction d’une grande partie de la protéine n’est pour l’instant pas connue. Par exemple, aucune fonction n’est associée à la région située entre le domaine d’interaction avec le CTD de l’ARN polymérase II (CID) et une répétion de 20 résidus glutamines. Récemment, la structure de ce domaine, appelé 2nd NTD a été décrite. Pour essayer de comprendre la fonction du 2nd NTD et des motifs liant le zinc encadrant le domaine d’interaction avec Clp1, nous avons mis en place une stratégie systématique de mutagénèse, soit par délétions, soit par mutations ponctuelles. Le 2nd NTD est formé de trois hélices α et interagit avec l’ARN. La délétion de ce domaine conduit à un phénotype de croissance lente chez la levure et un défaut de terminaison de transcription des snoRNAs. Malgré une similarité de structure et de fonction, le 2nd NTD présenterait une fonction indépendante. La fonction des motifs liant le zinc n’est pour l’instant pas connue. Cependant, la mutation de l’un de ces deux motifs conduit à un défaut de clivage et de polyadénylation in vitro. La mutation des deux motifs est létale chez la levure. / In eukaryotes, poly (A) tails are added to nuclear pre-mRNA 3'-ends in the two steps of cleavage and polyadenylation. This co-transcriptional processing requires the activity of a large protein complex comprising at least 20 different polypeptides in yeast organized primarily into the two factors CF IA and CPF. We are interested in the functional characterization of Pcf11, a CF IA subunit. The Pcf11 protein is organized into seven different domains, but here is still a large portion of the polypeptide that has not yet been characterized. For example the region from the end of the CTD interaction domain (CID) to an uninterrupted stretch of 20 glutamine residues has no known function. Recently, the structure of this region, called the 2nd NTD have been characterized. To gain insight into the function of the 2nd NTD and the two zinc fingers motif surrounding the Clp1 interaction domain, we have employed a systematic strategy of mutagenesis, either by deletion or via point mutations. The 2nd NTD is a folded domain composed of three α-helices. The deletion of this domain induced a severe defect of growth in yeast and impaired transcription termination of snoRNAs. Despite its similarity in structure and function with the CID, the 2nd NTD seems to act like an independent RNA binding domain. We don’t know yet the real function of the two zinc fingers motif at the C-terminal region of Pcf11, but the mutation of Cystein residues into serine of one of the two motifs impaired cleavage and polyadenylation. The mutation of the first motif is less harmful than the mutation of the second motif. The simultaneous mutation is lethal in yeast.

Der Missbrauch anaboler Substanzen zur Leistungssteigerung wird von den meisten Sportverbänden, dem Olympischen Komitee und vor allem der Welt Anti Doping Agentur (WADA) abgelehnt und sanktioniert. Trotzdessen bleibt der Missbrauch derartiger Substanzen sowohl im Leistungs- als auch im Freizeitsport nicht zuletzt aufgrund der starken Nebenwirkungen ein schwerwiegendes Problem. Allein im Leistungssport sind 2009 ca. 2 % der von der WADA durchgeführten Dopingkontrollen positiv ausgefallen. Dabei konnten in 65 % der positiv-getesteten Proben muskelaufbauende anabole Substanzen nachgewiesen werden. Im Freizeitsport konzentriert sich der Missbrauch dieser verbotenen Substanzen vor allem im Bereich des Bodybuildings. Die einzige rechtlich relevante und routinemäßig genutzte analytische Methode für den Nachweis anaboler Steroide in Urinproben von Sportlern ist die Gas- oder Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit der Massenspektrometrie. Diese Methoden sind jedoch sehr kosten- und zeitintensiv. Außerdem können dabei unbekannte Substanzen nur schwer nachgewiesen werden. Ein alternativer Ansatz zum Nachweis androgener anaboler Steroide führt über deren biologische Aktivität. Auf diesem Prinzip beruhen unter anderem Hefeassays. Diese Assays sind kostengünstig, schnell und einfach durchzuführen. In dieser Arbeit wurden zwei neue Hefeassays zum einen in der Hefe Saccharomyces (S.) cerevisiae und zum anderen in der Hefe Schizosaccharomyces (S.) pombe konstruiert und hinsichtlich ihrer Eignung zur Doping-Prescreening Analyse getestet. Diese zwei Hefen wurden genutzt, da sie phylogenetisch sehr weit voneinander entfernt sind und dadurch unter anderem einen unterschiedlichen Metabolismus und einen unterschiedlichen Aufbau der Zellwand besitzen. In Hefeassays können falsch negative und falsch positive Ergebnisse auftreten, da endokrin-wirksame Substanzen in der Hefe und im humanen Organismus eine unterschiedliche Wirkung besitzen können. Humane Zellen unterscheiden sich von Hefezellen unter anderem im Metabolismus von aufgenommenen Substanzen, in der Durchlässigkeit der Zellwand für verschiedene Stoffe und in Transportsystemen, die Substanzen aus der Zelle ausschleusen. Eine Kombination dieser beiden neu konstruierten Assays verspricht den Aktivitätsnachweis eines viel größeren Substanzspektrums, als es mit einem System allein möglich wäre, wodurch eine Reduzierung falsch negativer Ergebnisse erreicht werden kann. Als erster Schritt in dieser Arbeit wurde ein bestehendes Hefesystem von Sohoni und Sumpter (1998) charakterisiert. Der Hefestamm dieses S. cerevisiae Reportergen-Assays exprimiert den humanen Androgenrezeptor (AR) konstitutiv, da das AR Gen durch genetische Manipulation ins Genom der Hefe stabil integriert wurde. Außerdem liegt in der Hefezelle ein so genanntes Reporterplasmid vor. Dieses Plasmid trägt das lacZ Gen, welches in diesem Fall als Reportergen funktioniert und unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters steht. Gelangen nun Androgene in diese Zellen wird das lacZ Gen abgelesen und die beta-Galactosidase gebildet. Dieses Enzym wird ins Hefemedium sekretiert und wandelt dort einen gelben in einen roten Farbstoff um. Dieser Farbumschlag kann nunmehr quantitativ gemessen und als Maß androgener Aktivität ausgewertet werden. Die Eignung dieses Reportergenassays als Doping-Prescreening Test konnte in vielfältigen Experimenten bestätigt werden. Zunächst konnten mit diesem Assay bekannte Dopingsubstanzen und deren Metabolite anhand ihrer biologischen Aktivität nachgewiesen werden. Außerdem konnte die Spezifität des Assays gegenüber Androgenen gezeigt werden, wobei Steroide anderer Klassen, wie das Mineralocorticoid Aldosteron, das künstliche Glucocorticoid Dexamethason, das Östrogen 17beta-Östradiol und das Gestagen Progesteron und außerdem das Prohormon Dehydroepiandrosteron im Hefeassay geprüft worden sind. Alle diese Substanzen zeigten keinen relevanten Signalanstieg in physiologischen Konzentrationen. Weiterhin wurde die Praktikabilität des Hefeassays für die Doping-Prescreening Analyse anhand eines Trenbolox- und eines Methyltestosteron-Ausscheidungsversuchs untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Hefen dieses Assays eine 20 %ige Urinkonzentration im Medium tolerieren und gleichzeitig die biologische Aktivität von oral eingenommenem Methyltestosteron und Estra-4,9-dien-3,17-dion (Präparatname: Trenbolox) bzw. deren Metabolite in Urinproben detektierbar ist. Außerdem wurden parallel Urinproben von Frauen und Männern, die keine androgen wirksamen Substanzen eingenommen haben, getestet. Diese Urinproben ohne exogene Zufuhr von anabolen Steroiden wiesen keinen bedeutenden Signalanstieg auf. Eine Verbesserung des ursprünglichen Reportergenassays von Sohoni und Sumpter wurde durch den Austausch des Reportergens von lacZ zum optimierten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) erreicht. Dadurch konnte eine deutliche Verringerung der Inkubationszeit von 48 auf 24 Stunden bewirkt werden. Auch bei der Konstruktion der beiden neuen Reportergenassays in S. cerevisiae und S. pombe wurde daraufhin EGFP als Reportergen eingesetzt. Dafür wurde ein für die jeweilige Hefe spezifisches Reporterplasmid mit dem EGFP-Gen unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters und ein spezifisches Expressionsplasmid mit dem Gen für den humanen Androgenrezeptor konstruiert und in die jeweilige Hefe eingebracht. Durch Optimierungsversuche wurde festgestellt, dass beide neu konstruierten Hefen eine identische einzusetzende Zellzahl, Inkubationszeit, Inkubationstemperatur und ein identisches Kulturvolumen besitzen. Daraus ergibt sich der Vorteil, dass beide Assays gut kombiniert werden können. Mit Hilfe beider Hefeassays konnte die Wirkung verschiedener dopingrelevanter Substanzen detektiert werden, wobei der S. cerevisiae Assay eine geringfügig höhere Sensitivität zeigte als der S. pombe Assay und sogar als der Reportergenassay von Sohoni und Sumpter. Zum weiteren Vergleich der Sensitivität beider Assays wurden drei Ausscheidungsversuche durchgeführt. Im ersten so genannten Trenbolox-Ausscheidungsversuch zeigte der S. pombe Assay in allen fünf Urinproben ein stärkeres Signal als die Referenzprobe. Im S. cerevisiae Assay konnten nur vier der fünf getesteten Urinproben eine höhere Signalintensität als die Referenzprobe erreichen. Dies lässt auf eine unterschiedliche Sensitivität beider Assays für die eingenommene Substanz Estra-4,9-dien-3,17-dion (Trenbolox) bzw. seiner Metabolite schließen. In einem zweiten Ausscheidungsversuch nach 1-Androsteron Einnahme konnte gezeigt werden, dass im Urin hohe Konzentrationen von ausgeschiedener Ausgangssubstanz oder deren Metabolite bis zu 30 Stunden nach Substanzeinnahme ein positives Signal in beiden Hefeassays hervorriefen. Wohingegen zu späteren Ausscheidungszeitpunkten beide Hefeassays sehr unterschiedliche Ergebnisse zeigten. Beide Hefen scheinen späte Metabolite von 1 Androsteron mit unterschiedlicher Sensitivität zu detektieren. Im dritten Ausscheidungsversuch mit der Substanz Methyltestosteron konnte ebenfalls eine sehr unterschiedliche Sensitivität beider konstruierter Hefeassays gegenüber Methyltestosteron und seiner Metabolite festgestellt werden. Die Ergebnisse der Ausscheidungsversuche scheinen die Annahme zu bestätigen, dass eine Kombination beider Assays den Aktivitätsnachweis eines weiten Spektrums von androgenen Substanzen gewährleistet. Vor allem in der Dopinganalyse wäre dies von großem Vorteil, um bisher unbekannte Substanzen, wie neue so genannte Designer-Steroide, in Kombination mit der MS-Analytik nachzuweisen. Die Hefeassays bieten dabei die Möglichkeit zum einfachen, schnellen und kostengünstigen Doping-Prescreening. Auch der hier erstmals untersuchte direkte Einsatz von unbehandelten Urinproben in Hefeassays ist ein deutlicher Vorteil im Vergleich zu den klassischen Methoden, bei denen die Urinproben aufwendig gereinigt werden müssen. Ein weiteres aus unseren Ergebnissen resultierendes Anwendungsgebiet für die konstruierten Hefeassays könnte der Nachweis der biologischen Aktivität von Antiandrogenen sein.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Lignocellulosic biomass is a potential feedstock for production of sugars, which can be fermented into ethanol. The work presented in this thesis proposes some solutions to overcome problems with suboptimal process performance due to elevated cultivation temperatures and inhibitors present during ethanol production from lignocellulosic materials. In particular, continuous processes operated at high dilution rates with high sugar utilisation are attractive for ethanol fermentation, as this can result in higher ethanol productivity. Both encapsulation and membrane bioreactors were studied and developed to achieve rapid fermentation at high yeast cell density. My studies showed that encapsulated yeast is more thermotolerant than suspended yeast. The encapsulated yeast could successfully ferment all glucose during five consecutive batches, 12 h each at 42 °C. In contrast, freely suspended yeast was inactivated already in the second or third batch. One problem with encapsulation is, however, the mechanical robustness of the capsule membrane. If the capsules are exposed to e.g. high shear forces, the capsule membrane may break. Therefore, a method was developed to produce more robust capsules by treating alginate-chitosan-alginate (ACA) capsules with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) to get polysiloxane-ACA capsules. Of the ACA-capsules treated with 1.5% APTES, only 0–2% of the capsules broke, while 25% of the untreated capsules ruptured within 6 h in a shear test. In this thesis membrane bioreactors (MBR), using either a cross-flow or a submerged membrane, could successfully be applied to retain the yeast inside the reactor. The cross-flow membrane was operated at a dilution rate of 0.5 h-1 whereas the submerged membrane was tested at several dilution rates, from 0.2 up to 0.8 h-1. Cultivations at high cell densities demonstrated an efficient in situ detoxification of very high furfural levels of up to 17 g L-1 in the feed medium when using a MBR. The maximum yeast density achieved in the MBR was more than 200 g L-1. Additionally, ethanol fermentation of nondetoxified spruce hydrolysate was possible at a high feeding rate of 0.8 h-1 by applying a submerged membrane bioreactor, resulting in ethanol productivities of up to 8 g L-1 h-1. In conclusion, this study suggests methods for rapid continuous ethanol production even at stressful elevated cultivation temperatures or inhibitory conditions by using encapsulation or membrane bioreactors and high cell density cultivations. / <p>Akademisk avhandling som för avläggande av teknologie doktorsexamen vid Chalmers tekniska högskola försvaras vid offentlig disputation den 4 april 2014, klockan 9:30 i KE-salen, Kemigården 4, Göteborg.</p>

Genome-wide studies in Saccharomyces cerevisiae have revealed that the majority of the genome is transcribed on both strands, producing both coding and non-coding RNAs (ncRNAs). Initially, these ncRNAs were regarded as spurious transcripts but some have since been shown to have important roles as transcriptional regulators. Very little is understood about how ncRNAs are initiated, terminated and processed or how this influences their function. To address these questions, the expression, stability, and subcellular localization of the ncRNAs at the endogenous GAL locus was analysed. This revealed a complex interleaved transcript map, challenging the conventional view of a transcription unit (TU) flanked by 5’ sequences or promoters (P) that initiate transcription and 3’ regions, known as terminators (T), which control events such as transcript cleavage, polyadenylation, export and transcription termination. By creating conventional (PGAL-T) or unconventional (PGAL-P) hybrid TUs at the GAL locus, in which a promoter or terminator is positioned downstream of a galactose-inducible promoter, this work shows that both promoters and terminators are able to initiate antisense transcription to yield stable antisense transcripts. The data suggest that terminators contribute to efficient but variable expression from the promoter. An unconventional P-P TU, lacking a terminator, is transcribed on both strands but the sense transcript remains at low levels, through the repressive action of antisense transcription, and is retained in the nucleus. In contrast, the conventional P-T bi-directional TUs are plastic, with the Rrp6 component of the nuclear exosome and TATA-like sequences in the 3’ UTR determining whether the predominant transcript is antisense or sense. By relieving the repressive action of antisense transcription, this allows high levels of sense transcript to accumulate in the cytoplasm, contributing to gene expression, supporting a novel mode of gene regulation involving components of RNA quality control pathways acting through the 3’ region of genes.

"Fungal infections have large implications in agriculture and medicine, and there are few interventions available in the form of antifungal agents due to their toxicity to the host. Saccharomyces cerevisiae is an excellent model for pathogenic fungi because it is a well-studied, tractable organism and shares some traits with pathogenic fungi. Like most pathogenic fungi, S. cerevisiae is dimorphic and transitions from the benign yeast form to a filamentous form in which it produces psuedohyphae. Finding novel routes of suppressing dimorphic transition in a model like S. cerevisiae could lead to the discovery of new antifungal agents. Recently, quorum-sensing mechanisms have been under investigation as new avenues for microbial control. Quorum sensing is a signaling phenomenon that is well described in bacteria. It is the regulation of gene expression in response to cell density via the accumulation of small signaling molecules in the immediate environment. Indole-3-acetic acid (IAA) demonstrates some of the criteria for being a quorum-sensing molecule in S. cerevisiae. The purpose of this thesis was to further explore IAA as a quorum-sensing molecule in S. cerevisiae by demonstrating IAA production by the organism in culture. Radio-labeled tryptophan incorporation experiments followed by Thin Layer Chromatograph (TLC) analysis demonstrated that IAA is produced in culture by S. cerevisiae. A screen of a commercially available gene deletion library using the radio-labeled trypophan incorporation assay identified genes implicated in the IAA biosynthetic pathway. Some of these genes are homologous to those in an IAA pathway in the fungus Ustilago maydis. Further investigation of deletion strains of these candidate genes shows that Ald2 and Ald3, two aldehyde dehydrogenases, are involved in IAA production. The double mutant, ald2∆ald3∆, makes less IAA than wild type and is unable to demonstrate haploid invasive growth. This supports the idea that IAA biosynthesis in S. cerevisiae is necessary for morphological transition and that IAA could serve as a quorum-sensing molecule in S. cerevisiae with dimorphic transition as the quorum-sensing phenotype."

The budding yeast S. cerevisiae is widely used as a model organism to study biological processes that are conserved among eukaryotes. Di fferent genomic approaches have been applied successfully to interrogate the mode of action of small molecules and their combinations. In this thesis, these technologies were applied to di fferent sets of chemical compounds in the context of two collaborative projects. In addition to insight into the mode of action of these molecules, novel approaches for analysis of chemical-genetic pro files to integrate GO annotation, genetic interactions and protein complex data have been developed. The fi rst project was motivated by a pressing need to design novel therapeutic strategies to combat infections caused by opportunistic fungal pathogens. Systematic screens of 1180 FDA approved drugs identifi ed 148 small molecules that exhibit synergy in combination with uconcazole, a widely used anti-fungal drug (Wright lab, McMaster University, Canada). Genome-wide chemical-genetic profiles for 6 of these drugs revealed two di fferent modes of action of synergy. Five of the compounds a ffected membrane integrity; these chemical-genetic interactions were supported by microscopy analysis and sorbitol rescue assays. The sixth compound targets a distinct membrane-associated pathway, sphingolipid biosynthesis. These results not only give insight into the mechanism of the synergistic interactions, they also provide starting points for the prediction of synergistic anti-fungal combinations with potential clinical applications. The second project characterised compounds that aff ected melanocytes in a chemical screen in zebra fish (Patton lab, Edinburgh). Chemical-genetic screens in S.cerevisiae enabled us to show that melanocyte pigmentation reducing compounds do so by interfering with copper metabolism. Further, we found that defects in intracellular AP1 and AP3 trafficking pathways cause sensitivity to low copper conditions. Surprisingly, we observed that the widely-used MAP-kinase inhibitor U0126 a ffects copper metabolism. A nitrofuran compound was found to speci fically promote melanocyte cell death in zebrafi sh. This enabled us to study off -target eff ects of these compounds that are used to treat trypanosome infections. Nifurtimox is a nitrofuran prodrug that is activated by pathogen-specifi c nitroreductases. Using yeast and zebra fish we were able to show that nitrofurans are also bioactivated by host-specifi c aldehyde dehydrogenases suggesting that a combination therapy with an aldehyde dehydrogenase inhibitor might reduce side e ffects associated with nifurtimox.

El hierro es un elemento imprescindible para los seres vivos. En la naturalezase encuentra fundamentalmente en forma de Fe(lll) formando parte de sales ehidróxidos de muy baja solubilidad, lo que lo hace biológicamente inaccesible para losseres vivos mediante mecanismos simples de asimilación. En su forma reducida, elFe(ll) es mucho más soluble, pero también muy inestable, pasando immediatamentea Fe(lll) en presencia de oxígeno. Por otro lado, el hierro puede resultar tóxico para lacélula a concentraciones superiores a las requeridas por ésta, hecho éste que haforzado en la célula el desarrollo de mecanismos de incorporación del hierroaltamente regulados. El primer paso en la asimilación del hierro por S. cerevisiaeimplica la reducción del Fe(lll) extracitoplasmático a Fe(ll), estado en el cual el hierroes captado y transportado al citoplasma celular. En S. cerevisiae se han descrito dossistemas para la entrada de hierro en la célula. El sistema de baja afinidad, pococaracterizado hasta el momento, funciona cuando el hierro extracelular es abundante,siendo FET4 el gen que codifica para el transportador del hierro en estascondiciones, el único elemento genético de este sistema que ha sido caracterizado.Cuando el hierro es deficiente en el medio entra en funcionamiento el sistema de altaafinidad, en el que intervienen dos ferro-reductasas de membrana, productos de losgenes FRE1 y FRE2, que reducen el Fe(lll) extracitoplasmático a Fe(ll), el cual escaptado por una oxidasa de membrana, producto del gen F£T3, que se encarga depasarlo de nuevo a Fe(lll) y transportarlo al citoplasma. Resultados nuestros y deotros autores demuestran que la expresión de estos tres genes depende del productodel gen RCS1 (también denominado AFT1). RCS1 es un gen de S. cerevisiae quehabía sido parcialmente secuenciado con anterioridad; mutantes con una delecciónparcial en el mismo tenían un tamaño celular superior al de la cepa salvaje. En estetrabajo se ha completado la secuencia del gen RCS1 y se han construido mutantesnulos, esto es, portadores de una delección total del gen. Las células carentes deRCS1 no crecen en fuentes de carbono respirables como el etanol/glicerol, lo cualhizo pensar ¡nicialmente que RCS1 tuviese un papel en la desrepresión por glucosa.El análisis de la expresión de genes como ADH2 e ICL1, sometidos a represión porglucosa y necesarios para el crecimiento en este medio, ha revelado que dichaexpresión no está afectada en el muíante. La identidad de RCS1 con el gen AFT1implicado en la asimilación de hierro por otros autores nos llevó a intentar relacionarla incapacidad de los mutantes RCS1 para crecer sobre fuentes de carbonorespirables con su deficiente asimilación de hierro. Así, se ha comprobado que laausencia de crecimiento del muíante en etanol/glicerol como únicas fuentes decarbono puede suprimirse adicionando hierro en exceso al medio. Por otro lado, elcrecimiento en etanol/glicerol no requiere la inducción del sistema de alta afinidad,hecho que permite sugerir un papel adicional para RCS1 al anteriormente descrito,bien como responsable de mantener unos niveles de actividad ferro-reductasa y deentrada de hierro suficientes para el crecimiento en dicho medio, bien comoresponsable de la inducción de nuevos elementos implicados en la entrada de hierroque serían necesarios en esas condiciones, o bien porque sea necesario para unfuncionamiento eficiente del sistema de baja afinidad. La sobreexpresión de RCS1produce una detención homogénea del crecimiento celular en la fase G1 del ciclocelular, efecto no suprimible ni por privación ni por adición de hierro. El uso de lagenética de dominancia para contrarrestar este efecto podrá dar luz acerca de otrosgenes con interacción funcional con RCS1. En este trabajo se demuestra que Rcs1es o forma parte de un factor transcripcional activo sobre el promotor de FRE1. Así, laproteína Rcs1 unida al dominio de unión a DNA de la proteína Gal4 es capaz detransactivar dos sistemas reporteros (GAL1-HIS3 y GAL1-lacZ). En relación con ello,mediante estudios de retardamiento en gel, se ha podido comprobar que Rcs1 esnecesaria, en condiciones deficitarias de hierro, para la estabilidad del complejo quereconoce la zona del promotor de FRE1 responsable de su regulación por hierro. Laobtención de anticuerpos anti-Rcsl para su immunodetección ha permitido hacer unseguimiento de la proteína en diferentes condiciones. Así, se ha podido comprobarque dicha proteína está sujeta a una modificación postraduccional por fosforilación,que se produce en situaciones de detención del crecimiento celular. Estudios concepas portadoras de mutaciones en diferentes elementos de la vía Ras han permitidodescartar una implicación de la proteína quinasa A dependiente de cAMP en lafosforilación de Rcsl Asimismo, se ha visto que ósta es también independiente delas proteína quinasas producto de los genes YAK1 (que codifica para una quinasaantagónica de la proteína quinasa A) o SNF1 (quinasa necesaria para la desrepresiónpor glucosa). La fosforilación de Rcs1 parece corresponderse con una inactivación dela proteína y podría constituir un mecanismo para adaptar la entrada de hierro alestado metabólico de la célula.

A study of how mediators interact with the catabolic pathways of microbes was undertaken with a view towards improving the performance of microbial fuel cells. The use of mediators is known to improve the power density in microbial fuel cells, but this work suggests that no single mediator is ideally suited to the task. Instead, a carefully selected mixture of two targeted mediators (Methylene Blue and Neutral Red) might be optimal. To test this hypothesis, a yeast-catalyzed microbial fuel cell was built and empirically evaluated under different mediation conditions while keeping all other parameters constant. The results clearly show that an appropriate mix of the two mediators mentioned could indeed achieve significantly superior performance, in terms of power-density, than when either mediator is used singly. All tests were carried out using the same overall mediator concentration.

<p>In diploid yeast cells, mitotic recombination is very important for repairing double-strand breaks (DSB). When repair of a DSB results in crossovers, it may cause loss of heterozygosity (LOH) of markers centromere-distal to the DSB in both daughter cells. Gene conversion events unassociated with crossovers cause LOH for an interstitial section of a chromosome. Alternatively, DSBs can initiate break-induced replication (BIR), causing LOH in only one of the daughter cells. Mapping mitotic LOH contributes to understanding of mechanisms for repairing DSBs and distribution of these recombinogenic lesions. Methods for selecting mitotic crossovers and mapping the positions of crossovers have recently been developed in our lab. Our current approach uses a diploid yeast strain that is heterozygous for about 55,000 SNPs, and employs SNP-Microarrays to map LOH events throughout the genome. These methods allow us to examine selected crossovers on chromosome V and unselected mitotic recombination events (crossovers, gene conversion events unassociated with crossovers, and BIR events) at about 1 kb resolution across the genome.</p><p>Mitotic recombination can be greatly induced by UV radiation. However, prior to my research, the nature of the recombinogenic lesions and the distribution of UV-induced recombination events were relatively uncharacterized. Using SNP microarrays, we constructed maps of UV-induced LOH events in G1-synchronized cells. Mitotic crossovers were stimulated 1500-fold and 8500-fold by UV doses of 1 J/m2 and 15 J/m2, respectively, compared to spontaneous events. Additionally, cells treated with 15 J/m2 have about eight unselected LOH events per pair of sectors, including gene conversions associated and unassociated with crossovers as well as BIR events. These unselected LOH events are distributed randomly throughout the genome with no particular hotspots; however, the rDNA cluster was under-represented for the initiation of crossover and BIR events. Interestingly, we found that a high fraction of recombination events in cells treated with 15 J/m2 reflected repair of two sister chromatids broken at roughly the same position. In cells treated with 1 J/m2, most events reflect repair of a single broken sister chromatid (Chapter 2). </p><p>The primary pathway to remove pyrimidine dimers introduced by UV is the nucleotide excision repair (NER) pathway. In NER, the dimer is excised to generate a 30-nucleotide gap that can be replicated to form DSBs if not filled in before DNA replication. The NER gap can also be expanded by Exo1p to form single stranded gaps greater than one kilobase. Alternatively, in the absence of NER, unexcised dimers could result in blocks of DNA replication forks. Resolving the stalled replication fork could lead to recombinogenic breaks. In Chapter 3 and Chapter 4, we analyzed recombination events in strains defective in various steps of processing of UV-induced DNA damage, including exo1 and rad14 mutants. </p><p>In Chapter 3, I show that Exo1p-expanded NER gaps contribute to UV-induced recombination events. Interestingly, I also found that Exo1p is also required for the hotspot activity of a spontaneous crossover hotspot involving a pair of inverted Ty repeats. In addition to its role of expanding a nick to a long single-stranded gap, Exo1p is also a major player in DSB end resection. Therefore, I examined the gene conversion tract lengths in strains deleted for EXO1. I found that, although crossover-associated gene conversion tracts become shorter in the exo1 mutant as expected, noncrossover tract lengths remained unaffected. As a result, noncrossover tracts are longer than crossover tracts in the exo1 mutant while the opposite result was observed in the wild-type strains. I proposed models to rationalize this observation.</p><p>In Chapter 4, to investigate whether the substantial recombinogenic effect in UV in G1-synchronized cells requires NER, we mapped UV-induced LOH events in NER-deficient rad14 diploids treated with 1 J/m2. Mitotic recombination between homologs was greatly stimulated, which suggests that dimers themselves can also cause recombination without processing by NER. We further show that UV-induced inter-homolog recombination events (noncrossover, crossover and BIR) depend on the resolvase Mus81p, and are suppressed by Mms2p-mediated error-free post-replication repair pathway. </p><p>The research described in Chapters, 2, 3, and 4 are in the publications Yin and Petes (2013), Yin and Petes (2014), and Yin and Petes (2015), respectively.</p> / Dissertation