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A possible low-intermediate temperature proton conductor based on silicon oxide phosphateSaxin, Stefan January 2015 (has links)
The main material studied in this project is silicon oxide phosphate, often referred to in the literature as Si₅O(PO₄)₆. This material has highly unusual coordination of the silicon (octahedral, as well as the more common tetrahedral). The structure is hexagonal, it has been assigned to space group R -3 and lattice parameters a ≈ 7.85 Å, c ≈ 24.14 Å. This work's main focus is on understanding the interplay between structure and properties in order to enhance protonic conductivity for a fuel cell electrolyte. Silicon oxide phosphate was synthesised with the solid-state method, using a gel precursor made from H₃PO₄, water and SiO₂. Various compositions were made with different P/Si starting ratios, ranging between 0.57 - 1.5. There were small but significant differences in the a,b axes for the different compositions that corresponded to conductivity behaviour of hydrothermally treated P-Si compositions. This correlation was also found to appear in ³¹P NMR for the chemical shift at - 44 ppm for untreated P-Si compositions as well as in the temperatures of the DTA peaks for the hydrothermally treated compositions. This all implies that this particular P-Si system with the addition of water becomes a ternary system that enables protonic conductivity. A proposed mechanism for the protonic conductivity is given where it is suggested that protons flow along the internal channels of the structure using two waters that provide dual pathways for protons. This is possible through utilization of a proton thought to be in the structure (a P_OH bond of 1.57 Å). Protonic conductivity could further be increased in the system by incorporating 85% H₃PO₄ in the P-Si materials, thus these materials act as matrices for the phosphoric acid. Another composition, Ge₅O(PO₄)₆ with 5% extra germanium, was hydrothermally treated and found to have protonic conductivity at higher temperatures than the silicon oxide phosphate analogues.
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Migración de Plataforma Satelital DVB-S a DVB-S2 para el Servicio DTHValenzuela Quintallina, Juan Pablo 21 January 2010 (has links)
La transmisión vía satélite ha evolucionado notablemente debido a la introducción de nuevos esquemas de modulación y de protección de errores más eficaces. El estándar Digital Video Broadcasting- Satellite 2 (DVB-S2) perfecciona la generación anterior con una mayor eficiencia y mejores prestaciones en los servicios ofrecidos. Esto último es de vital importancia para generar modelos de negocios rentables debido a que en la actualidad el recurso de segmento satelital es escaso, por ende, el ancho de banda se transforma en un factor determinante para cualquier empresa que ofrece servicios satelitales.
El objetivo general del presente trabajo de título es determinar la conveniencia de efectuar una migración desde plataformas satelitales existentes DVB-S hacia DVB-S2 para un escenario de servicio Direct to Home (DTH). El estudio busca disponer de una evaluación técnico-económica de dichas tecnologías de manera de visualizar el beneficio asociado a la migración y proponer un plan de ingreso al estándar analizado, de manera tal que se obtenga la máxima rentabilidad y menor impacto para una empresa de televisión satelital, sujeto a una estrategia de cambio de los actuales Set Top Boxes.
El análisis de la norma DVB-S2 se realiza a través de las alternativas técnicas que establece el estándar para la transmisión de señales de televisión en calidad estándar (SDTV) y alta definición (HDTV), incorporando también la opción de la operación del servicio en modo compatible con la actual tecnología. La evaluación económica se efectúa mediante el estudio de tres escenarios que permiten generar nuevas propuestas de valor para el operador DTH.
Los resultados del trabajo ratifican los beneficios de esta nueva tecnología a través del uso eficiente de los recursos disponibles. La optimización del ancho de banda conlleva la integración de nuevas propuestas audiovisuales y servicios interactivos que aumenten la fidelización del cliente y atraigan a nuevos subscriptores.
Las conclusiones del análisis técnico-económico llevan a recomendar la implementación del estándar DVB-S2 a través del modo compatible con la tecnología actual, debido a la fuerte inversión asociada al recambio de receptores de los abonados. Adicionalmente, se propone una estrategia de intercambio gradual de los actuales Set Top Boxes y promociones que ayuden a efectuar este objetivo.
En relación al trabajo futuro se sugiere el desarrollo de un canal de retorno para la plataforma DTH que permita una mayor interacción entre usuario y sistema. Además de incorporar nuevos servicios interactivos aprovechando la optimización del ancho de banda debido a la incorporación de la tecnología DVB-S2. Conjuntamente, utilizar este estudio como base para la incorporación de IPTV vía satélite. Finalmente, el aprovechamiento con fines tanto docentes como privados del balance de enlace desarrollado para el nuevo estándar.
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Comparison of Two Eye Trackers for the Visualization of Eye Tracking Data in Node-Link DiagramsNazli, Bilgic, Vulgari, Sofia Kiriaki January 2016 (has links)
The usage of eye trackers is becoming more and more popular in the field of information visualization. In this project two eye trackers, The Eye Tribe nd Mirametrix S2, are used to obtain eye tracking data for visualizations. It is planned to use the eye trackers with OnGraX, a network visualization system, where they will provide data for the implementation of visualizations, specifically, heatmaps. OnGraX already uses heatmaps to show regions in a network that have been in the viewport of the user. One aim of this thesis will be the comparison between the two eye trackers, and if the use of eye tracking data gives better results thatn the already existing viewport-based approach. At the same time, we provide the foundation for adaptive visualizations with OnGraX. Our research problem is also of interest for visualization in general, because it will help to improve and develop eye tracking technology in this context. To support the outcome of our implementation, we carried out a user study. As a result, we concluded that one of the two eye trackers appears to have more capabilities than the other, and that using the eye tracking data is a more preferred way of depicting the heatmaps on OnGraX.
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Etude des performances et optimisation d'un réseau d'accès par satellite pour les communications / Satellite access performances assessment and optimization for aeronautical communicationsTao, Na 10 July 2009 (has links)
La croissance rapide du trafic aérien et les besoins en nouveaux services notamment pour les passagers imposent l'introduction de nouveaux moyens de communication pour les avions avec une bande passante globale fortement accrue. Les satellites sont appelés à jouer un rôle important dans ce contexte, non seulement en complément des systèmes terrestres pour les services « cockpit » (services ATM, Air Traffic Management) mais aussi pour les services « cabine » (In-Flight Entertainment). L'objectif de la thèse est d'étudier l'architecture d'un système satellite supportant l'ensemble de ces services, en se focalisant sur l'architecture du terminal embarqué à bord des aéronefs. L'architecture retenue repose sur des liaisons DVB-S2/DVB-RCS normalisées par l'ETSI. Cette option permet d'utiliser efficacement l'importante bande passante disponible en bande Ka pour les services mobiles aéronautiques (allocation primaire) ou en bande Ku (allocation secondaire). Ces normes ont été conçues pour les applications multimédia (Broadband Satellite Multimedia). Le défi est alors d'utiliser de telles liaisons satellite pour des services aux caractéristiques et besoins fortement hétérogènes. Par ailleurs, l'utilisation de la bande Ka n'est pas concevable sans l'activation de techniques de lutte contre les affaiblissements (FMT – Fade Mitigation Techniques). L'utilisation d'une marge statique conduit à une perte importante de capacité. Les techniques FMT reposent sur une évaluation dynamique du bilan de liaison et permettent une modification de la forme d'onde. Le système utilise ainsi la forme d'onde la plus efficace spectralement pour chaque terminal et maximise la capacité globale du système. Par contre, chaque terminal observe une modification de la ressource allouée au fil du temps. L'objectif de la thèse est de concevoir une architecture au niveau terminal qui permette d'exploiter les liaisons DVB-S2/RCS afin de fournir les services passagers (Internet et téléphonie mobile de type GSM/UMTS) et un canal haute fiabilité pour les services aéronautiques. Deux approches ont été retenues. La première repose sur une application du modèle ETSI BSM (Broadband Satellite Multimedia) en couches séparant strictement les couches dépendantes satellite et les couches indépendantes satellite. Les simulations de cette architecture montrent que les liaisons ne peuvent être utilisées de façon efficace sans une interaction entre couches afin de tenir compte de l'évolution de la capacité disponible. La seconde approche consiste en la concentration de la gestion de la ressource et la gestion de la qualité de service dans la même couche protocolaire. L'idée de départ est d'utiliser la méthode d'encapsulation générique Generic Stream Encapsulation (GSE). GSE a été conçu pour la projection des paquets de couches supérieures à l'intérieur des trames DVB-S2. GSE tient compte de la taille variable des trames DVB-S2 et introduit une capacité de multiplexage entre différents flux (identification de fragments). Sur cette base, une gestion de l'accès est introduite pour gérer la liaison DVB-RCS au format MF-TDMA. Nous introduisons ainsi une utilisation conjointe de GSE, d'une politique de service différentiée et de flux de signalisation inter-couches (« cross-layer »). Les performances des deux approches sont étudiées à l'aide d'un modèle de simulation développé à l'aide du logiciel OPNET Modeler (simulations à événements discrets). Les résultats obtenus démontrent le meilleur comportement de la seconde architecture avec une meilleure utilisation de la ressource et des performances de transmission satisfaisant les objectifs. / The rapid growth of air traffic needs a new communication infrastructure with increased bandwidth, high speed services and applications to satisfy expected air-ground communication requirements. Satellite communication systems play a significant role in this context, not only as a complement to terrestrial systems for Air Traffic Management (ATM) by offering global coverage but also as a promising solution to enrich In-Flight Entertainment (IFE) for passengers. DVB-S2/RCS technology is an attractive proposition to provide the cost-effective broadband services for both ATM and IFE, mainly because a large radio bandwidth is primarily allocated to aeronautical mobile communications in Ka-band, where the open standards DVB are implemented. However, such system design with convergence of heterogeneous traffics involves two main challenges. Firstly, using Ka-band means the implementation of Fade Mitigation Techniques (FMT) in order to cope with deep fades caused by atmospheric attenuation. Otherwise, the waste of capacity would be excessively high in a constant link margin design. FMT adapt in real time the link budget to the propagation conditions, this adaptivity has an impact not only on physical layer but also on upper layers. An efficient ressource management strategy with dynamic bandwidth allocation is required in this case, especially in DVB-RCS return link where FMT are not natives. Secondly, the proposed system must be able to multiplex the trafic flows with highly different characteristics and Quality of Service (QoS) expectations into a single link, the corresponding capacity management and QoS support seem with higher complexity. In this paper, we present an adaptive system design using a single DVB-S2/RCS based satellite link to provide Internet access and mobile telephony (GSM/UMTS) for passengers and a high-reliability channel for ATM. Concerning the airborne terminal architecture, two approaches are investigated. The first one is in compliance with ETSI Broadband Satellite Multimedia (BSM) architecture and based on a layering paradigm. The conducted simulation experiments highlight the need of dynamic interactions and adaptations among the layers to achieve an overall performance optimization. We propose then an enhanced approach with the concentration of both resource allocation and QoS management at the same interface – adaptation layer. The idea comes from the success of the recent Generic Stream Encapsulation (GSE) protocol, which carries the network protocol packets over DVB-S2 forward link in a simple, flexible and efficient way, especially when used with Adaptive Coding and Modulation (ACM). Furthermore, GSE can be easily extended to use in our design for DVB-RCS return link thanks to a proper design of MF-TDMA structure in which the suitable FMT (ACM and Dynamic Rate Adaptation) are context-aware configured. With the combined use of GSE, service policy and the interactions between adaptation and access layers, incoming heterogeneous traffics can be dynamically scheduled, segmented and encapsulated at the same adaptation layer. Performance evaluation of two proposed approaches is derived by a network-level simulation model developed using OPNET. Results prove the enhanced approach outperforms the first one leading to better resource utilization and satisfactory performance.
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Simulace přenosu DVB-S2 / Simulation of the DVB-S2 TransmissionKlíma, Jindřich January 2011 (has links)
This thesis is focusing on the second satellite digital TV standard, DVB-S2. It deals with the principle of the digital TV and the first standard DVB-S. It also describes the very beginning and characteristics of the DVB-S2, new technologies in use, architecture and the individual topics are then explained more in detail. The thesis also contains the program of transmission simulation of DVB-S2 in MATLAB. In the laboratory of television technology UREL, two standards were measured and compared with the values obtained from the program. The functionality of the program and the benefits of DVB-S2 were verified afterwards.
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Étude de la voie de signalisation de l’insuline chez la drosophile par une approche phosphoprotéomiqueBridon, Gaëlle 04 1900 (has links)
La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats.
Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase.
L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance. / Phosphorylation is a reversible post-translational modification that modulates protein activity, and can impart conformational changes and affect translocation of their protein substrates. Kinases and phosphatases are responsible for the dynamic of changes in protein phosphorylation and act in a coordinated manner. Abnormal activation or misregulation of kinase activity can lead to the development of cancers and metabolic disorders. Tyrosine kinase receptor (RTK) associated signaling pathways are often implicated in numerous diseases and the further understanding of mechanisms affecting their regulation is necessary to determine their activity and effects anticipated on their substrates.
In this context, the primary objective of this thesis is to study the phosphorylation events arising from the activation of the insulin receptor (InR) following stimulation of drosophila S2 cells with insulin. The phosphorylation cascade triggered after InR activation is conserved in mammals. In order to study the phosphoproteome of drosophila S2 cells, we enriched phosphopeptides on titanium dioxide (TiO2) stationary phase prior to their separation by liquid chromatography (LC) and ion mobility (FAIMS) mass spectrometry (MS). Phosphopeptides were then analysed by tandem MS at high resolution. We first compared the benefits of FAIMS to conventional LC-MS, and observed a 50% increase in the number of identified phosphopeptides when using ion mobility. FAIMS enables the separation of phosphoisomers that are typically unresolved by LC, enabling high confidence assignment of modification sites via distinct MS/MS spectra. This approach was used to profile phosphorylation changes taking place between control and insulin-treated drosophila cells and enabled the identification of 32 phosphopeptides (out of 2 660 quantified) showing differential regulation. Interestingly, 50% of the regulated targets have a CK2 consensus site. These preliminary experiments were followed-up by RNAi mediated inhibition of CK2 and revealed that 6 phosphoproteins (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 and mu2) were positively modulated after insulin stimulation and negatively regulated after CK2 RNAi treatment. Using in vitro kinase assay, we identified 29 direct CK2 targets, of which 15 were correlated with results from the CK2 RNAi experiment. We demonstrated specifically that the su(var)205 (S15) is regulated by insulin and is a direct CK2 target based on RNAi and kinase assays.
Our phosphoproteomics data also highlighted the presence of isomeric phosphopeptides, several of which could be distinguished using FAIMS. We developed two algorithms to determine the occurrence of phosphoisomers in large scale studies. The first algorithm based on differences in retention times between isomers identified 64 candidates in mouse and rat phosphoproteome datasets corresponding to less than 1% of all identified phosphopeptides. We also identified 117 isomer candidates in drosophila using a targeted LC-MS/MS approach with inclusion lists. The second algorithm is based on the presence of characteristic fragment ions present in MS/MS spectra of co-eluting or partially resolved species and allowed the identification of 23 isomeric pairs. The ability to distinguish phosphoisomers in large-scale phosphoproteome datasets is of significance to correlate phosphorylation events taking place on specific residues with biological activities.
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Modelo cinético não-estruturado para crescimento e produção de glicoproteína recombinante do vírus da raiva em linhagem S2 de células de Drosophila melanogaster. / Unstructured kinetic modelling for growth and recombinant rabies virus glycoprotein production in a S2 strain cell line of Drosophila melanogaster.Barral, Manuel Filgueira 12 November 2010 (has links)
Linhagem de células de inseto S2 foram cultivadas em meio TC100 suplementado em reator bubble free de 1.5 L e para estudar o seu crescimento e expressão da glicoproteína G do vírus da raiva (RVGP). Os dados permitiram propor um modelo matemático que reproduz o crescimento e produção da glicoproteína e que considera oito variáveis de estado e vinte parâmetros cinéticos. O modelo considera a velocidade específica de crescimento limitada por glicose, glutamina e glutamato e inibida por NH4+; consumo e formação de glutamina; velocidade específica de morte limitada por NH4+ e inibida por glicose; velocidade específica de produção de NH4+ e de GPV associada ao crescimento e a degradação de GPV. As concentrações de oxigênio dissolvido (pO2), glicose e glutamina foram modificadas para se avaliar a sua influência na velocidade específica de crescimento máxima e nos fatores de conversão. Os parâmetros do modelo foram ajustados usando a técnica de otimização dos poliedros flexíveis e as equações diferenciais do modelo foram integradas pelo método de Gear. / S2 cell strain from Drosophila melanogaster were cultivated in supplemented TC100 media in reactor \"bubble free\" to study their growth and expression of glycoprotein G of rabies virus (RVGP). The data allowed proposing a mathematical model that reproduces the growth and production of glycoprotein and that consider eight state variables and twenty kinetic parameters. The model considers the specific growth rate limited by glucose glutamine and glutamate and inhibited by NH4+ consumption and formation of glutamine, specific death rate limited by NH4+ and inhibited by glucose; production specific rate of NH4+ and RGPV associated with growth and degradation of RGPV. The concentrations of dissolved oxygen (pO2), glucose and glutamine were varied to evaluate their influence on maximum specific growth rate and conversion factors. The model parameters were adjusted using the flexible polyhedron optimization method and the differential equations of the model were integrated by the method of Gear.
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Der Effekt des Alterns auf funktionelle Deaktivierung im somatosensorischen System / Eine fMRT-Studie / Effects of age on functional deactivation in the somatosensory system / fMRI studySohns, Jan Martin 09 December 2009 (has links)
No description available.
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Étude de la voie de signalisation de l’insuline chez la drosophile par une approche phosphoprotéomiqueBridon, Gaëlle 04 1900 (has links)
La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats.
Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase.
L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance. / Phosphorylation is a reversible post-translational modification that modulates protein activity, and can impart conformational changes and affect translocation of their protein substrates. Kinases and phosphatases are responsible for the dynamic of changes in protein phosphorylation and act in a coordinated manner. Abnormal activation or misregulation of kinase activity can lead to the development of cancers and metabolic disorders. Tyrosine kinase receptor (RTK) associated signaling pathways are often implicated in numerous diseases and the further understanding of mechanisms affecting their regulation is necessary to determine their activity and effects anticipated on their substrates.
In this context, the primary objective of this thesis is to study the phosphorylation events arising from the activation of the insulin receptor (InR) following stimulation of drosophila S2 cells with insulin. The phosphorylation cascade triggered after InR activation is conserved in mammals. In order to study the phosphoproteome of drosophila S2 cells, we enriched phosphopeptides on titanium dioxide (TiO2) stationary phase prior to their separation by liquid chromatography (LC) and ion mobility (FAIMS) mass spectrometry (MS). Phosphopeptides were then analysed by tandem MS at high resolution. We first compared the benefits of FAIMS to conventional LC-MS, and observed a 50% increase in the number of identified phosphopeptides when using ion mobility. FAIMS enables the separation of phosphoisomers that are typically unresolved by LC, enabling high confidence assignment of modification sites via distinct MS/MS spectra. This approach was used to profile phosphorylation changes taking place between control and insulin-treated drosophila cells and enabled the identification of 32 phosphopeptides (out of 2 660 quantified) showing differential regulation. Interestingly, 50% of the regulated targets have a CK2 consensus site. These preliminary experiments were followed-up by RNAi mediated inhibition of CK2 and revealed that 6 phosphoproteins (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 and mu2) were positively modulated after insulin stimulation and negatively regulated after CK2 RNAi treatment. Using in vitro kinase assay, we identified 29 direct CK2 targets, of which 15 were correlated with results from the CK2 RNAi experiment. We demonstrated specifically that the su(var)205 (S15) is regulated by insulin and is a direct CK2 target based on RNAi and kinase assays.
Our phosphoproteomics data also highlighted the presence of isomeric phosphopeptides, several of which could be distinguished using FAIMS. We developed two algorithms to determine the occurrence of phosphoisomers in large scale studies. The first algorithm based on differences in retention times between isomers identified 64 candidates in mouse and rat phosphoproteome datasets corresponding to less than 1% of all identified phosphopeptides. We also identified 117 isomer candidates in drosophila using a targeted LC-MS/MS approach with inclusion lists. The second algorithm is based on the presence of characteristic fragment ions present in MS/MS spectra of co-eluting or partially resolved species and allowed the identification of 23 isomeric pairs. The ability to distinguish phosphoisomers in large-scale phosphoproteome datasets is of significance to correlate phosphorylation events taking place on specific residues with biological activities.
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Étude des voies de signalisation qui régulent l’homéostasie du PI(4,5)P2Babouder, Maïssa 01 1900 (has links)
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