Calpain 5 (CAPN5) is a non-classical member of the calpain family. It lacks the EF-hand motif characteristic of the classical calpains, calpain 1 and 2, but retains catalytic and Ca2+ binding non EF domains. Tra-3, an ortholog of CAPN5, is involved in necrotic cell death in C.elegans; although specific role of CAPN5 has not been investigated in the mammalian CNS. I compared relative mRNA levels of calpains in rat CNS, which revealed that CAPN5 is the second most highly expressed calpain. We examined relative levels of CAPN5 from late embryonic day 18 to postnatal day 90 and found lower mRNA but higher protein levels during CNS development. Using X –gal staining in Capn5 +/- mice, immunostaining of rat brain sections and SH-SY5Y cells, and subcellular fractionation of rat brain cortex, we found that CAPN5 is a non-cytoplasmic calpain localized in the nucleus and enriched in synaptic mitochondria. Proteinase K treatment of mitochondria and mitoplasts from B35 rat neuroblastoma cells and rat synaptic mitochondria revealed CAPN5 was localized on the inner mitochondrial membrane and released from mitochondria on membrane permeabilization with alamethicin. We used immunolabelling, confocal imaging, nuclear subfractionation and transient transfections to evaluate the subnuclear localization of CAPN5. CAPN5 was detected in punctate domains and associated with promyelocytic leukemia (PML) protein, a tumor suppressor protein. We further demonstrated that CAPN5 carries a nonconventional bipartite nuclear localization signal. Together, these findings demonstrate that CAPN5 is a non-cytosolic calpain, abundant in the CNS and localized to the mitochondria inner membrane and nuclear PML bodies.

轉譯後修飾作用 (post-translational modifications) 包含甲基化 (methylation)、磷酸化 (phosphorylation)、泛素化 (ubiquitination)、類小泛素 化修飾 (sumoylation) 等。過去有研究指出類小泛素化修飾可以調節目標蛋白 質的穩定度，進而調節許多細胞內反應，例如：細胞核運輸作用、 DNA 複 製、調節轉錄作用、染色體分離、訊息傳遞、細胞週期調控、DNA 修補作用等 現象。類小泛素化修飾是藉由一系列的酵素，使類小泛素這個蛋白質能夠修飾 目標蛋白質的 lysine 殘基。 類小泛素化修飾是一個可逆性動態修飾過程，類 小泛素化修飾連結途徑包含有三個主要的步驟： 活化 (activation)，結合 (conjugation)，連接 (ligation)，它們分別是藉由 E1、E2 和 E3 這三種不同的 酵素催化的。本篇研究主要是藉由類小泛素 E3 連接酶 PIAS1 進行修飾作用， 我們發現 Hairy and Enhancer of split 1 (Hes-1) 蛋白質可被類小泛素修飾。若 將類小泛素 E3 連接酶 PIAS1 突變，就無法讓野生型 Hes-1 進行類小泛素修 飾化，證實 PIAS1 的參與對於類小泛素化修飾扮演重要的角色。除此之外， 將類小泛素目標蛋白質 Hes-1 序列上第八個位置的 lysine 突變，會抑制 Hes-1 進行類小泛素化修飾。因此，透過 PIAS1 所進行的類小泛素化修飾可以 使目標蛋白質 Hes-1 蛋白質更為穩定。之後更進一步探討在空間學習與記憶 中，Hes-1 進行類小泛素化修飾與 GluR1 蛋白質表現的關係。實驗結果顯示， Hes-1 進行類小泛素化修飾使空間學習與記憶變差並使 GluR1 蛋白質表現下 降。 / There are several post-translational modifications including methylation、 phosphorylation、ubiquitination、sumoylation, etc. Previously studies indicated that sumoylation can regulate target protein stability. Sumoylation also modulates many cellular processes, including nuclear transport, DNA replication, transcription, chromosome segregation, signal transduction, cell cycle and DNA repair. Sumoylation is a process mediated by SUMOs which are attached to specific lysine residues of target proteins by the action of a series of enzymes. Sumoylation is a dynamically reversible process. Sumoylation consists of three steps：activation, conjugation and ligation, which are respectively mediated by E1, E2 and E3 ligase. This study focuses on SUMO modification by E3 ligase. Here, we identified a new target protein, Hairy and Enhancer of split 1 (Hes-1), for SUMO conjugation. The E3 ligase deficient mutant of PIAS1 that leads to failure of Hes-1 protein sumoylation. We demonstrared that PIAS1 is involved in SUMO modification of Hes-1. In addition mutantion of Hes-1 protein on lysine 8 residue that inhibits the sumoylation of Hes-1. Therefore, sumoylation of Hes-1 regulates the protein stability of Hes-1. Further study of the relationship between sumoylation of Hes-1 and GluR1 in spatial memory formation indicated that spatial memory is impaired and GluR1 protein expression is decreased upon sumoylation of Hes-1.

The regulation of cardiac-specific genes such as GATA-4 and its co-factor FOG-2 is paramount for normal heart development and function. Indeed, those mechanisms that regulate GATA-4 and FOG-2 function, such as nuclear transport and the post-translational modification of SUMOylation, are of critical importance for cardiogenesis. Therefore the aims of this study were to: i) elucidate the nuclear transport mechanisms of GATA-4; ii) determine the function of SUMOylation on the biological activity of both GATA-4 and FOG-2; and iii) examine how these mechanisms impact on the role of GATA-4 and FOG-2 in cardiac hypertrophy. Firstly, we characterised a non-classical nuclear localisation signal that mediates active import of GATA-4 in both HeLa cells and cardiac myocytes. Fine mapping studies revealed four crucial residues within this region that interacted with importin ?? to mediate GATA-4 import via the non-classical import pathway. In addition, a cardiac myocyte-specific CRM1-dependent nuclear export signal, which consists of three essential leucine residues, was identified. We also investigated the residues of GATA-4 that are responsible for its DNAbinding activity and therefore transcriptional control of cardiac-specific genes. Secondly, we demonstrated that SUMOylation of both GATA-4 and FOG-2 is exclusively carried out by SUMO-2/3. Moreover, SUMOylation is involved in the nuclear localisation of both GATA-4 and FOG-2 in cardiac myocytes as well as the transcriptional regulation of cardiac-specific genes, such as cardiac troponin I. Finally, and perhaps most biologically significant, we showed that nuclear transport as well as SUMOylation of GATA-4 is imperative for the ability of GATA-4 to induce cardiac hypertrophy. Moreover, it was determined that FOG-2 SUMOylation is involved in the ability of FOG-2 to protect against cardiac hypertrophy. In conclusion, the current study provides detailed information on the nuclear transport pathways of GATA-4 as well as the SUMOylation of both GATA-4 and FOG-2 and the role these two mechanisms play in gene transcription and cardiac hypertrophy.

La sumoylation représente, après l’ubiquitination, l’exemple le plus étudié de modification post-traductionnelle impliquant la liaison d’une protéine à une autre. Cependant, alors que l’ubiquitination est impliquée principalement dans la dégradation des protéines par le protéasome, la sumoylation semble réguler les propriétés biochimiques de ses substrats (localisation cellulaire, interaction protéique, activité, …). Pour venir lier une protéine appelée Sumo (Small Ubiquitin-like Modifier) sur un substrat, la sumoylation emprunte une voie enzymatique analogue à celle de l’ubiquitination mais utilise des enzymes différentes. A ce jour, bien que plusieurs centaines de substrats de la sumoylation aient été identifiés, seules 5 structures de protéines sumoylées ont été résolues. Elles ne sont vraisemblablement pas représentatives de l’ensemble des substrats de la sumoylation et mon travail de thèse vise à élargir les connaissances structurales sur la sumoylation pour permettre de dégager des concepts généraux. <p>Les études sur la sumoylation se heurtent généralement à la difficulté d’obtenir les substrats sumoylés. Ce projet a donc nécessité, au niveau technique, la mise au point d’un système de sumoylation in vivo en bactérie permettant de modifier des quantités importantes de protéines et de les purifier efficacement. <p>Des analyses bioinformatiques nous ont permis d’identifier des substrats de la sumoylation propices à une étude structurale de leur forme sumoylée. Au terme de ces analyses, nous avons retenu 3 protéines :DJ-1, PPARγ et IκBα. Bien que la complexité du sujet nous ait ensuite amené à écarter DJ-1 et PPARγ, nous sommes parvenus à purifier la forme sumoylée d’IκBα. Ce résultat nous a permis d’entreprendre une campagne de cristallogenèse d’IκBα complexé au facteur de transcription NF-κB. L’obtention d’IκBα sumoylé permettra également d’aborder des études fonctionnelles pour améliorer la compréhension du rôle de la sumoylation de ce substrat. <p>Nos analyses bioinformatiques ont également révélé que dans plus de 60% des cas, les sites de sumoylation des substrats se trouvent dans des zones prédites intrinsèquement désordonnées. L’importance du désordre dans le processus de sumoylation était jusqu’alors largement sous-estimée. A titre d’exemple, nous avons étudié par diffusion des rayons X aux petits angles la structure du domaine transactivateur du facteur de transcription ERM sous forme non modifiée et sous forme sumoylée. Cette étude indique que la sumoylation d’ERM n’induit pas le repliement de ce domaine transactivateur. De même, il apparait peu probable, au vu de la flexibilité de cette région, que la sumoylation empêche des interactions avec certains partenaires cellulaires. Dans ce contexte, la sumoylation semble servir de plateforme de recrutement de partenaires, reconnaissant de manière spécifique le Sumo. Ce mécanisme pourrait se généraliser à l’ensemble des sites de sumoylation prédits dans des zones intrinsèquement désordonnées. <p>Le système de sumoylation que nous avons développé permet de produire des protéines sumoylées pures en grande quantité et pourra également servir à identifier des protéines reconnaissant spécifiquement les substrats modifiés. Tous ces éléments devraient permettre de progresser dans la compréhension de cette modification post-traductionnelle impliquée dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La régulation des protéines par les modifications post-traductionnelles (PTMs) est un événement clé dans le maintien des fonctions biologiques de la cellule. Parmi elles, on retrouve les modifications causées par une famille de molécules appelées Ubiquitin Like Modifiers (UBls), incluant l’ubiquitination, la neddylation ou encore la SUMOylation. Au contraire des modifications classiques faisant intervenir des petits groupements chimiques, telles que la phosphorylation ou l’acétylation, les UBls sont eux-mêmes des protéines se greffant sur le groupement amine en position e des lysines des protéines ciblées, générant des protéines ramifiées. Alors que la principale fonction de l’ubiquitination est la dégradation des protéines par le protéasome, les autres UBls sont encore mal caractérisées. Dans ce contexte, le but de cette thèse était de développer de nouvelles approches protéomiques afin de définir le rôle de la SUMOylation dans des cellules humaines. En effet, l’identification des sites de SUMOylation par spectrométrie de masse (MS) est un défi. Ceci s’explique par la très faible abondance des protéines SUMOylées dans la cellule ainsi que par la longue chaine de 19 à 34 acides aminés laissés sur la protéine ciblée après digestion à la trypsine. Afin de pallier à ces deux problèmes, un mutant de la protéine SUMO a été généré au sein du laboratoire. La première altération sur ce mutant est l’insertion d’une séquence 6xHis à l’extrémité N-terminale de la protéine afin de faciliter l’enrichissement des protéines SUMOylés. La seconde altération de la protéine SUMO est la mutation d’une glutamine en arginine en position 6 à partir du C-terminal. Cette mutation a pour effet de libérer des peptides trypsiques ramifiés contenant seulement 5 acides aminés provenant de SUMO sur le peptide ciblé. Le premier but de cette thèse était de développer une méthode permettant de cibler spécifiquement les peptides SUMOylés lors d’une analyse par LC-MS. Cette méthode repose sur le patron de fragmentation propre de la chaine de 5 acides aminés commune à tous les peptides SUMOylés et utilise la technologie Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra (SWATH). Lors d’une telle analyse, l’échantillon est injecté une première fois en fragmentant de larges fenêtres de masses. Ceci permet d’obtenir des spectres MS/MS pour tous les peptides présents dans l’échantillon. Un algorithme est ensuite utilisé afin de détecter les fenêtres de masses contenant des peptides SUMOylés et de recalculer le rapport masse sur charge des peptides candidats. Les injections subséquentes permettent ensuite de fragmenter uniquement les peptides candidats. Cette méthode s’est avérée être complémentaire aux méthodes conventionnelles et a permis l’identification d’un total de 54 peptides SUMOylés à partir d’extraits protéiques enrichis sur billes NiNTA. La seconde approche envisagée était d’ajouter une étape d’enrichissement supplémentaire au niveau peptidique. Pour cela, un anticorps reconnaissant la chaine de 5 acides aminés laissée après digestion tryptique a été produit. Cette étape d’immuno-purification supplémentaire a permis l’identification d’un total de 954 sites de SUMOylation dans des cellules humaines lors d’une analyse à grande échelle. Afin de valider les nouvelles cibles identifiées, une étude fonctionnelle de la SUMOylation de la protéine CDC73 a été réalisée. Cette étude a montré que la SUMOylation de CDC73 était requise pour sa rétention nucléaire, confirmant ainsi un rôle important pour la SUMOylation de cette protéine. Cependant, le principal défaut de la précédente approche était la nécessité de cultiver 500 millions de cellules par condition étudiée. Cette approche a donc été optimisée afin de pouvoir réduire le nombre de cellules utilisées dans une analyse. L’optimisation de chacun des paramètres analytiques nous a permis de réduire ce nombre de 50 fois, permettant ainsi d’identifier plus de 1000 sites de SUMOylation à partir de seulement 10 millions de cellules. De plus, nous avons montré que cette approche permet l’identification concomitante des sites de SUMOylation et d’ubiquitination dans un seul échantillon biologique. Ceci a permis d’identifier un nouveau mécanisme de régulation des deubiquitinases par les UBls, ainsi que d’élucider les mécanismes de translocation du protéasome dans la cellule. Dans l’ensemble, nous avons développé des méthodes permettant de mieux caractériser la SUMOylation des protéines et avons prouvé que ces méthodes sont applicables à l’étude de plusieurs UBls en parallèle. Nous sommes certains que l’approche par immuno-purification permettra à l’avenir d’identifier la SUMOylation à un niveau endogène. / Protein regulation by post-translational modification (PTMs) is a key event in regulating cellular function. These modifications include a group termed Ubiquitin-Like modifiers (UBLs) that contain, but is not limited to, ubiquitylation, neddylation and SUMOylation. While conventional modifications, such as phosphorylation or acetylation, involve a small chemical group, UBLs are proteins attached from their C-terminus to the epsilon amine group of a lysine contained in the targeted protein, thus generating branched proteins. While the main function of ubiquitylation is protein degradation by the proteasome, other UBLs remain mostly unexplored. In this context, the aim of this thesis was to develop new proteomics strategies to characterize SUMOylation in human cells. Indeed, identification of SUMOylation sites by mass spectrometry (MS) is a challenge. This is due to the low abundance of SUMOylated proteins in the cells as well as the long 19 to 34 amino acid SUMO remnant left of the target after trypsin digestion. In this context, our research group has developed a mutant of SUMO containing two mutations. The first mutation consists of a 6xHis tag at the N-terminus of SUMO in order to facilitate SUMOylated substrates enrichment at the protein level. A second mutation was also introduced at the 6th position from the C-terminus and consists in a glutamine to arginine substitution in order to release shorter SUMOylated peptides after trypsin digestion. The first goal of this thesis was to develop a targeted approach to specifically fragment SUMOylated peptides during an LC-MS run. This was enabled by the common fragmentation pattern of all SUMOylated peptides arising from the five amino acid SUMO remnant. Digested peptides were first analyzed using SequentialWindow Acquisition of all THeoretical Mass Spectra (SWATH). In this experiment, large mass windows are fragmented. A custom algorithm is then used that detects mass windows in which candidates are located and determine their intact mass. In subsequent injections these peptides were then specifically targeted. This method was complementary to data dependent acquisition and enabled the identification of 54 SUMOylated peptides. In a second approach, we wanted to enrich for SUMOylated substrates at the peptide level. An antibody was raised against the five amino acid SUMO remnant and used for immunopurification of SUMOylated peptides. In total, we identified 954 SUMOylation sites in human cells. Moreover, functional analysis of the newly identified substrate CDC73 revealed that SUMOylation on K136 is required for its nuclear retention, thus showing a new role for the SUMOylation of this protein. Although this approach gave new insights into the characterization of SUMOylated substrates, high amounts of material were still required to obtain such results. The last goal of this thesis was to optimize the previously developed immunopurification. Systematic optimization of every analytical parameter was done and enabled the reduction of the number of cells required by a factor of 50, without affecting the number of SUMOylation sites identified. Moreover, we used this approach to profile for SUMOylation and ubiquitylation dynamics in human cells upon proteasomal inhibition with MG132. This revealed an unexpected regulation mechanism of deubiquitinating enzymes by UBLs and unraveled translocation mechanisms of the proteasome in the cell. Our SUMO proteomic approach demonstrates capability for the concomitant analysis of SUMOylation and ubiquitylation. In the future, we hope to extend this approach to endogenous SUMOylation.

Mamalian protein ubiquitination and SUMOylation are reversible post translational modifications, which are involved in a multitude of important complex regulatory processes within the cell. Current mass spectrometry approaches that involve bottom-up proteomics to comprehensively analyse these modifications, have proved to be problematic. In this work, analytical approaches are carried out to improve and enhance the comprehensive analysis of these modifications. Tryptic proteolysis of ubiquitinated proteins results in the generation of isopeptides bearing adi-glycine (GG) remnant. Current mass spectrometry approaches used to identify these isopeptides are predominantly reliant on detecting the signature mass shift of the GG remnant (114.043 Da). The lack of sequence information from the GG remnant post MS/MS acquisition results in database search algorithms falsely identifiying these isopeptides. Reductive methylation chemistry was employed to derivatize these isopeptides. Upon collision induced dissociation of the isopeptides two robust ions were released from the iso-N-terminus of the GG remnant ; i) an a1’ ion at m/z 62.09, corresponding to the G of the remnant and ii) a b2’ ion at m/z 147.11, corresponding to the full GG remnant. Post-acquisition data extraction of these unique diagnostic ions demonstrated enhanced selectivity towards identifying these isopeptides. Tryptic proteolysis of SUMOylated proteins results in the generation of isopeptides bearing a substantial iso-C-terminal SUMO remnant. The CRA(K) (Consecutive Residue Addition tolysines (K)) approach combined independant use of proteolytic enzymes and unbiased consecutive residue addition of amino acids pertaining to these iso-C-terminal SUMOremnants, on all lysine residues. This approach enabled the identification of analytically useful novel wildtype isopeptides derived from the proteolysis of SUMO(1/2/3)ylated proteins, bearing GG, TGG and QTGG remnants. The analytically useful isopeptides derived from proteolysis of SUMO(2/3)ylated proteins lacked robust diagnostic information from their iso-C-terminal bearing TGG and QTGG remnants. Reductive methylation chemistry was utilised to derivatize these isopeptides and enabled diagnostic a’ and b’ ions to be released from their iso-N-termini; i) a1’ (m/z 133.13),b2’ (m/z 262.17) and b4’ (m/z 376.22) ions, corresponding to the QTGG remnant and ii) (m/z106.10), b2’ (m/z 191.14) and b3’ (m/z 248.14) ions, corresponding to the TGG remnant. Post-acquisition data extraction of these unique diagnostic ions, enabled comprehensive structural elucidation of these isopeptides and enhanced selectivity towards identification.

L'ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7) est une maladie neurodégénerative due à une expansion de CAG traduit en polyQ dans la protéine ataxine-7. La SUMOylation, modification post-traductionnelle que nous avons identifiée moduler l'agrégation de la protéine mutante, est facilitée par une SUMO E3 ligase.Nous avons identifié RanBP2, une nucléoporine appartenant au complexe du pore nucléaire en tant que SUMO E3 ligase, via SUMO-1 de l'ataxine-7. En effet, le silencing de RanBP2 induit l'agrégation de l'ataxine-7 mutante, ce qui démontre l'implication de RanBP2 dans la physiopathologie de SCA7. Nous montrons également que l'ataxine-7 endogène est une cible modifiée par SUMO-1 et -2. L'ataxine-7 poly-SUMOylée, grâce à la présence de chaines SUMO2/3, est capable de recruter RNF4. Cette protéine conduit à la dégradation de l'ataxine-7 mutante par la voie du protéasome. La dégradation est abolie en présence d'un mutant de RNF4.Dans un modèle murin KI SCA7, nous avons quantifié l'expression des gènes impliqués dans la voie de la SUMOylation au niveau des régions les plus touchées du cerveau. Le niveau d'expression des ARNs messagers montre des altérations dépendantes des répétitions CAG du gène SCA7. A 6 mois (avant le début de la pathologie), les premières dérégulations sont observées; à 12 mois (à un stade avancé de la maladie), on note une diminution statistiquement significative de Sumo-1 dans le cervelet des souris Atxn7100Q/5Q. Ces résultats, alliés à l'observation de l'accumulation anormale des protéines SUMO-1 et RanBP2 dans le cervelet d'un patient SCA7, suggèrent que les voies de la SUMOylation in vivo peuvent être perturbées dans SCA7. / Spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7) is a neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (polyQ) in the protein ataxin-7. SUMOylation, a post-translational modification that we identified to modulate mutant protein aggregation in a SCA7 cellular model, is facilitated by a SUMO E3 ligase. Here, we identified RanBP2 (Nup358), a nucleoporin belonging to the nuclear pore complex, as the major E3 enzyme implicated in ataxin-7 modification by SUMO-1. Indeed, RanBP2 silencing renders mutant ataxin-7 more prone to aggregation, thus demonstrating the implication of RanBP2 in SCA7 pathophysiology. We also show that endogenous ataxin-7 is a target for both SUMO-1 and -2 modification. Poly-SUMOylated ataxin-7 presents a docking site composed of SUMO2/3 chains for the recruitment of RNF4: this protein is a SUMO E3 ubiquitin ligase that mediates degradation of mutant ataxin-7 by the proteasome pathway. The degradation is abolished in presence of a mutant form of RNF4. In a SCA7 knock-in mouse model we quantified expression of SUMO-pathway related genes in cerebellum and retina, the most affected regions using quantitative RT-PCR. SUMO-related genes show expanded repeat-dependent alterations in expression patterns. At 6 months (before onset), deregulations begin to occur; by 12 months (late stage of disease), there is a statistically significant impairment in Sumo-1 levels in Atxn7100Q/5Q cerebellum. These results, together with the observation that SUMO-1 and RanBP2 protein accumulate abnormally in the cerebellum of a SCA7 patient, suggest that in vivo SUMO-modifying pathways may be perturbed in SCA7.

DNA methylation regulates gene expression through a complex network of protein/protein and protein/DNA interactions in chromatin. The maintenance methylase, DNA methyltransferase 1 (DNMT1), is a prominent enzyme in the process that is linked to DNA replication and drives the heritable nature of epigenetic modifications in somatic cells. The mechanistic details that explain how DNMT1 catalytic action is directed in a chromatin setting are not well understood. We hypothesize that post translational modifications and a variety of protein-protein interactions processes are key regulatory elements that set the methylation of CpG elements essential for normal growth behavior in somatic cells. These fundamental processes can be disrupted by DNA damage leading to inappropriate gene silencing and loss of growth control in somatic cells. First, we show that DNMT1 is post-translationally modified by sumoylation and we have mapped these sumoylation sites by defined mutations. Sumoylated DNMT1 is catalytically active on genomic DNA in vivo and substantially increases the enzymatic activity of DNMT1 both in vitro and in chromatin. These data establish that sumoylation modulates the endogenous activity of a prominent epigenetic maintenance pathway in cells. Second, we investigated novel mechanisms whereby somatic cells can erase then reset DNA methylation events in somatic cells. In this study, the relationship between DNA damage and gene silencing was explored. To this end, we generated a HeLa cell line containing a specialized GFP reporter cassette (DRGFP) containing two mutated GFP genes and a unique ISceI restriction endonuclease site. These cells do not express GFP. A unique double strand break is then delivered by transfecting in the gene for I-SceI. About 4% of the cells produced a functional GFP by gene conversion and homologous recombination (HR); however roughly half iv of the GFP recombinants expressed the gene poorly and this was attributed to gene silencing. Silencing of the GFP expressing cell clones was due to DNA methylation and could be reversed using a drug that inhibits global methylation (5-aza-2'-deoxycytidine). Approximately half of the repaired genes were heavily methylated, and half were hypomethylated. That is, a key intermediate methylation state after HR repair is hemimethylated DNA, defined as methylation limited to one strand. Evidence is given that DNMT1 is acting as a de novo methylase at the HR repair patches in cells. Moreover, the DNA damage inducible protein, GADD45, interacts specifically with the catalytic domain of DNMT1 and GADD45 binds with extremely high affinity to hemimethylated DNA sites. Thus, GADD45 is a key regulatory element in silencing of HR repaired DNA segments and appears to inhibit the activity of DNMT1. Consistent with these results, we found that GADD45 increased the expression of recombinant GFP following HR repair, further suggesting its role in orchestrating strand specific DNA methylation by DNMT1. Since these experiments were performed in live cells, there is strong physiological relevance. We propose that DS DNA damage and the resulting HR process involves precise, strand selected DNA methylation mediated by the prominent methylase enzyme, DNMT1. Moreover, DS DNA break repair through HR and gene conversion, may potentially erase and reset DNA methylation patterns and therefore alter the expression of repaired genes. The overall process is tightly regulated by the DNA damage inducible protein GADD45, which may coordinate strand specific methylation by recruiting DNMT1 to HR repair templates. The ability of GADD45 to modulate DNMT1 catalytic activity may explain its role as a passive mediator of demethylation that has been reported by other groups. The overall process of silencing post DNA repair is a strong evolutionary force that may predispose cells to malignant transformation

<p dir="ltr"><i>Legionella pneumophila</i> strains harboring wild-type <i>rpsL</i> such as Lp02<i>rpsL</i>_WT cannot replicate in mouse bone marrow-derived macrophages (BMDMs) due to induction of extensive lysosome damage and apoptosis. The mechanism of this unique infection-induced cell death remains unknown. Using a genome-wide CRISPR/Cas9 screening, we identified <i>Hmg20a </i>and <i>Nol9</i> as host factors important for restricting strain Lp02<i>rpsL</i>_WT in BMDMs. Depletion of <i>Hmg20a</i> protects macrophages from infection-induced lysosomal damage and apoptosis, allowing productive bacterial replication. The restriction imposed by <i>Hmg20a</i> was mediated by repressing the expression of several endo-lysosomal proteins, including the small GTPase Rab7. We found that SUMOylated Rab7 is recruited to the bacterial phagosome via SulF, a Dot/Icm effector that harbors a SUMO-interacting motif (SIM). Moreover, overexpression of Rab7 rescues intracellular growth of strain Lp02<i>rpsL</i>_WT in BMDMs. Our results establish that <i>L. pneumophila</i> exploits the lysosomal network for the biogenesis of its phagosome in BMDMs.</p>

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs. / Estrogens play a pivotal role in reproductive physiology through direct interaction with the estrogen receptors ERα and ERβ, which belong to the nuclear hormone receptor family of ligand-activated transcription factors. Harbouring two activation domains (AF-1 and AF-2), gene expression can be controlled by ERs either in a hormone-dependent and/or independent manner. Disruption of ER transcriptional regulation is associated with pathological events such as breast and endometrial cancers. While ERα is considered a strong predictive factor in endocrine therapy of reproductive cancers, the clinical value of ERβ is still debated, although greater expression of ERβ has been associated with a favourable outcome since recent evidence has associated ERβ with anti-tumorigenic properties and a better response to anti-estrogenic compounds. Along with others studies, those individual outcomes indicate that even though the two receptors can exert similar roles by sharing resemblances in terms of structure and general response to hormone, they can also carry out distinct functions. These variations can be attributed to the fact that most of the structural domains shared by ERs exhibit a low level of homology, especially at the AF-1 domain. Consequently, the majority of the post-translational modifications sites (PTMs) on ERs are not shared between both isoforms. In fact, ligand-induced and ligand-independent activities of ERs are critically influenced by PTMs. PTMs controls the multiple aspects of ER-dependent activation by modulating ERs ligand binding, specificity, cellular localization, dimerization, interaction with their cognate DNA response element, combinatory recruitment of transcriptional coregulators, stability and transcriptional arrest. Hence, by their discrepancies, ERs will be differently influenced by the cellular environment. Furthermore, as the deregulation of different signalling pathway in cancers is associated with ER-dependant tumour progression and in the acquisition of a therapeutic resistant phenotype, it is crucial to understand the how PTMs affect ERs transactivation in order to eventually propose and/or develop adequate treatment. The results presented in this thesis were carried out with the objective of gaining a better understanding of PTM’s roles on ERβ transcriptional control which, as opposed to ERα, remain unclear. We demonstrate here a dynamic regulation of ERβ by phosphorylation, ubiquitination and sumoylation. Furthermore, as all the newly identified PTM are located within de AF-1 domain of ERβ, our results highlight the key role of this domain in the regulation of ligand-dependent and independent transcriptional properties of this receptor. The first study shows that in response to MAPK, specific serine residues in the AF-1 of ERβ are phosphorylated and play an important role in the regulation of ERβ ligand-independent activity by the ubiquitin-proteasome pathway. In fact, the activation-degradation cycle of ERβ induced by MAPK is regulated upon phosphorylation of these serines coordinating ERβ ubiquitination, subnuclear mobility and stability by promoting the recruitment of the ubiquitin ligase E6-AP. Moreover, this molecular process plays part in the differential regulation of ERα and ERβ activity upon proteasome inhibition. In the second paper, we demonstrate that ERβ activity and stability in presence of estrogen is closely regulated by the phosphorylation-dependent sumoylation of the AF-1 domain, amplified by GSK-3 action. SUMO-1 attachment prevents ERβ degradation by competing with ubiquitin at the same acceptor site and dictates ERβ transcriptional inhibition, as opposed to ERα, by altering estrogen-responsive target promoter occupancy and gene expression in breast cancer cells. Furthermore, these findings uncover a novel phosphorylated sumoylation motif (pSuM) and offer a valuable tool to predict novel SUMO substrates under protein kinase regulation. In combination to our better understanding on how intracellular signals controls ERβ transcriptional activity, our results highlight the significant role of PTMs in ERs isoforms discrepancies and allows supplementary comprehension of their respective physiopathologicals roles.