O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito protetivo da adição de biomassa de Saccharomyces cerevisiae (SC) residual, obtida da fermentação alcoólica de cana e cerveja contra a passagem de aflatoxina M1 para o leite. Para tanto, foi realizado ensaio preliminar in vitro de remoção de AFB1 em solução tampão fosfato pelas diferentes fontes de biomassa de SC (levedura de cana-de-açúcar seca e inativada, LCSI; levedura autolizada, LA; parede celular, PC; e co-produto de cervejaria parcialmente desidratado, CCPD), em temperatura ambiente pelos tempos de contato de 05, 10, 20 e 30 min. O ensaio in vivo foi realizado por meio de 20 vacas multíparas da raça holandesa que foram selecionadas em estágio médio de lactação. O delineamento experimental consistiu em dez tratamentos, um controle negativo, um controle positivo e dois tratamentos (com e sem inclusão de AFB1) para cada uma das quatro diferentes fontes de SC, durante um período de 10 dias para avaliar a produção e a composição do leite, escore de condição corporal e bioquímica sérica. A análise de amostras de leite para quantificação de AFM1 foi realizada empregando-se coluna de imunoafinidade para purificação associada a CLAE acoplada a espectrômetro de massa triplo quadrupolo. O valor do limite de quantificação de AFM1 foi 0,5 µg kg-1. Amostras de ração foram analisadas para quantificação de AFB1 por meio de coluna de imunoafinidade para purificação associada a CLAE. O valor do limite de quantificação de AFB1 foi de 0,5 µg.kg-1. Através do estudo in vitro foi possível observar que a viabilidade celular não é pré requisito para adsorção e que o tempo de incubação não interfere na capacidade de adsorção de AFB1. No estudo in vivo, não foi observado efeito da AFB1 e nem das diferentes fontes de biomassa de SC sobre o escore de condição corporal, produção e composição do leite. A bioquímica sérica (AST, ALT e PT) avaliada foi similar entre os grupos não intoxicados e intoxicado com AFB1. Os tratamentos LA e PC apresentaram maior capacidade de adsorção de AFB1 em vacas leiteiras previamente intoxicadas. / The aim of this study was to evaluate the protective effect of adding residual biomass of Saccharomyces cerevisiae (SC), obtained from the fermentation of sugarcane and beer against aflatoxin M1 passage into milk. Therefore, preliminary in vitro test of AFB1 removal in phosphate buffer solution by SC different biomass sources (inactive dry yeast sugarcane, IDYS, autolyzed yeast, AY; cell wall, CW and co- brewery partially dehydrated product, CBPDP) at room temperature for contact times of 05, 10, 20 and 30 min was performed. The in vivo assays were performed using 20 multiparous Holstein cows that were selected in mid lactation stage. The experimental design consisted of ten treatments, a negative control, a positive control and two treatments (with and without inclusion of AFB1) for each of four different sources of SC, over a period of 10 days to evaluate the milk yield and composition, body condition score and serum biochemistry. Milk sample analysis for quantification of AFM1 were carried out using an immunoaffinity column for purification associated with HPLC coupled to triple quadrupole mass spectrometer. The limit of quantification for AFM1 was 0.5 µg. kg-1. Feed samples were analyzed for AFB1 quantification by immunoaffinity purification column associated with HPLC. The limit of quantification for AFB1 was 0.5 µg.kg-1. For in vitro study it was observed that the cell viability is not prerequisite for adsorption and the incubation time does not interfere with AFB1 adsorption capacity. For in vivo study, there was no effect of AFB1 nor the different SC biomass sources on body condition score, milk yield and composition. There was no significant difference between the originated AFB1 levels from food samples in different days of the experimental period. Serum biochemical (AST, ALT, TP) evaluated was similar between the control group and intoxicated with AFB1. The AY and CW treatments had higher adsorption capacity in dairy cows previously intoxicated.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade EStadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T07:34:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zeidler_AneFernandaBeraldi_M.pdf: 15352916 bytes, checksum: 8a3454e1ab7cf3b1ea1dded67030f592 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A demanda por processos alternativos para produção de compostos químicos tem aumentado nas ultimas décadas em decorrência da necessidade da utilização de fontes renováveis e do desenvolvimento de processos menos agressivos ao meio ambiente. Nesse contexto os processos de fermentação microbiana são cada vez mais considerados passiveis de serem empregados industrialmente. A produção de monômeros petroquímicos por via biológica tem sido tema de diversos estudos e, dentre os compostos produzidos por fermentação, ácidos e alcoóis de três e quatro carbonos estão entre as moléculas mais promissoras. O glicerol, alem de ser utilizado na fabricação de diversos produtos, tem tido sua utilização estudada como substrato para biotransformação em compostos mais reduzidos e de maior valor agregado, como precursores de polímeros. A produção de glicerol por via fermentativa em leveduras já foi estudada, entretanto, sempre são utilizados organismos de laboratório, mais suscetíveis a estresses. A utilização de leveduras selvagens, mais robustas, isoladas de processos industriais de fabricação de etanol, pode resultar em maiores rendimentos de glicerol e maior adaptabilidade ao processo industrial. Com o intuito de aumentar a produção de glicerol foram deletados os genes: ADH1 e TPI1 na linhagem industrial de S. cerevisiae PE-2 (JAY270). Essas deleções foram realizadas por recombinação homologa em linhagens haplóides de diferentes mating-type. Essas linhagens foram cruzadas gerando mutantes diplóides para cada um dos genes e para o duplo mutante. Alem disso, a complementação do gene ADH1, estudada através da construção e inserção de um plasmídeo, foi bem sucedida: apos a complementação, os mutantes ?adh1 alcançaram um rendimento em etanol significativamente igual ao da linhagem selvagem. As deleções dos genes ADH1 e TPI1 geraram os resultados esperados, aumentando a produção de glicerol e diminuindo a de etanol, modificando assim o perfil de produção de metabolitos das linhagens. As linhagens selvagens apresentaram rendimentos em glicerol ao redor de 0,01 g glicerol/g glucose, rendimento esperado para linhagens de levedura produtoras de etanol. As linhagens ?adh1 apresentaram um aumento de aproximadamente 10 vezes no rendimento em glicerol, chegando a 0,24 gramas de glicerol por grama de glucose. A linhagem que apresentou maior rendimento foi a AZY773, linhagem industrial com os genes ADH1 e TPI1 deletados, atingindo um rendimento de 0,38 gramas de glicerol por grama de glucose. A linhagem de laboratório com a mesma modificação teve um rendimento de 0,31 gramas de glicerol por grama de glucose, significativamente menor que o rendimento da linhagem industrial. Demonstrou-se neste trabalho, portanto, que a produção de glicerol metabólico com altos rendimentos para bioconversão em compostos mais reduzidos pode ser conseguida através de modificações metabólicas e do uso de organismos robustos. / Abstract: In the past few decades the demand for alternative processes for the production of chemical compounds has increased due to the need for utilization of renewable resources and development of less harming processes to the environment. In this context, large scale microbial fermentative processes are being considered as a viable alternative. The production of petrochemical monomers through biological pathways has been a major research theme and, among the compounds produced by fermentation, three and four carbon acids and alcohols are among the most promising molecules. Glycerol, besides being used for the manufacture of several products, has had its utilization studied as substrate for biotransformation into more reduced and higher added value compounds, e. q. polymers precursors. Glycerol production by yeast fermentation has already been studied, but, only in laboratory strains, which are more stress sensitive. The utilization of wild yeasts, more robust, isolated from the fuel ethanol production process, may result in higher glycerol yields and better adaptability to industrial processes. Aiming to increase glycerol production the ADH1 and TPI1 genes from PE-2 (industrial strain of S. cerevisiae) were deleted through homologue recombination in haploid strains of different mating-types. These strains were mated generating diploid mutants for ?adh1, ?tpi and ?adh1?tpi1 deletions. Complementation of ADH1 gene, carried out through the construction of a plasmid, was successful in allowing the ?adh1 strains to reach ethanol yields as high as the one reached by wild strains. ADH1 and TPI1 deletion increased glycerol and decreased ethanol production, modifying the strains'metabolite production profile, as expected. The wild strains presented glycerol yields of 0,01 g of glycerol per g of glucose, which is a regular yield for ethanol producing yeasts. ?adh1 strains presented a tenfold increase in glycerol yield, reaching 0,24 g of glycerol per g of glucose. AZY773 strain, industrial strain with both ADH1 and TPI1 genes deleted, presented the highest glycerol yield, reaching 0,38 g of glycerol per g of glucose. The laboratory strain with the same genetic modification yielded 0.3 g of glycerol per g of glucose, significantly lower than the industrial strain. This work demonstrated that metabolic glycerol production with high yields for bioconversion in more reduced compounds may be reached through metabolic modification and utilization of robust organisms. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Uma das razões que fazem de Saccharomyces cerevisiae um organismo modelo é o grau de conservação dos mecanismos celulares que existe entre esta levedura e eucariotos superiores. Porém, mesmo após 21 anos do seqüenciamento do seu genoma, ainda existem mais de 600 ORFs com função desconhecida. Neste trabalho, selecionamos quatro delas para o estudo detalhado. MRPL34 (YDR115w) está presente na subunidade maior do ribossomo mitocondrial de levedura e apresenta similaridade com o gene L34 de E. coli e MRP-L34 de humanos. O mutante Δmrpl34 apresenta DNA mitocondrial (mtDNA) instável e para estudá-lo foram gerados alelos sensíveis à temperatura (ts). Com os ensaios de síntese protéica mitocondrial in vivo foi possível identificar clara diminuição da síntese de proteínas do mutante condicional. Mrpl34p foi identificada no extrato ribossomal, conforme esperado. A desestruturação da subunidade maior do ribossomo mitocondrial, utilizando os mutantes ts, nos forneceu indícios sobre intermediários existentes no seu processo de montagem. Verificamos que a porção N-terminal da proteína é responsável pelo endereçamento à mitocôndria. YPR116w também apresenta alta instabilidade do DNA mitocondrial, desta forma, mutantes termossensíveis foram utilizados nos experimentos. Uma das estratégias utilizadas visou a busca de parceiros genéticos. Verificamos que ylr091wp aumenta a estabilidade do mtDNA de ts- ypr116w, sugerindo atividade supressora. Também averiguamos que o alelo ts-ypr16w apresenta menor quantidade de tRNA mitocondrial, através de ensaios de Northen blot. Duas das ORFs escolhidas (YDL119c e YOR022c) tiveram sua caracterização inicial publicada em 2016, refletindo a importância deste tipo de pesquisa. Vimos que a proteína codificada por YDL119c está localizada na membrana interna da mitocôndria e que o mutante Δyor022c apresenta quantidades reduzidas de cardiolipina, quando crescido à 37ºC. / One of the reasons that turn Saccharomyces cerevisiae a model organism is the degree of conservation of cellular mechanisms that exist between this yeast and higher eukaryotes. However, even after 21 years of sequencing their genome, there are still more than 600 ORFs with unknown function. In this work, we selected four of them for the detailed study. MRPL34 (YDR115w) is present in the major subunit of the yeast mitochondrial ribosome and bears similarity to the L34 gene of E. coli and MRP-L34 from humans. The Δ mrpl34 mutant shows unstable mitochondrial DNA (mtDNA) and to study it, temperature sensitive alleles (ts) were generated. With the mitochondrial protein synthesis assays in vivo, it was possible to identify a clear decrease in the protein synthesis of the conditional mutant. Mrpl34p was identified in the ribosomal extract as expected. The disassembly of the major subunit of the mitochondrial ribosome, using the ts mutants, provided us some clues about intermediates in its assembly process. We have verified that the N-terminal portion of the protein is responsible for addressing the mitochondria. YPR116w also shows high mitochondrial DNA instability, in this way, thermosensitive mutants were used in the experiments. One of the strategies used was the search for genetic partners. We verified that ylr091wp increases the stability of ts-ypr116w mtDNA, suggesting suppressor activity. We also found that the ts-ypr16w allele has a smaller amount of mitochondrial tRNA, through Northen blot assays. Two of the chosen ORFs (YDL119c and YOR022c) had their initial characterization published in 2016, reflecting the importance of this type of research. We have seen that the protein encoded by YDL119c is located on the inner membrane of the mitochondria and that the Δyor022c mutant presents reduced amounts of cardiolipin when grown at 37 ºC.

O etanol se consagrou como o principal biocombustível e o Brasil detém o processo mais econômico e ambientalmente adequando. O processo industrial brasileiro é único, pois utiliza o reciclo de células de leveduras na fermentação permitindo uma ótima velocidade de fermentação, porém o mesmo ato potencializa os efeitos tóxicos presentes no processo. O substrato de fermentação é composto pela mistura de caldo e melaço de cana-de-açúcar, porém a vantagem econômica do açúcar sobre o etanol faz com que o caldo seja priorizado para a produção de açúcar e o seu subproduto seja mais utilizado na fermentação, nesse caso o melaço. O melaço apresenta diversos compostos inibitórios como sulfitos, excesso de sais, fenóis, furfurais e metais. Devido à larga escala do processo, o substrato não pode ser esterilizado antes da fermentação, logo a presença de microrganismos contaminantes se torna um problema sempre presente. As bactérias contaminantes consomem o substrato e produzem substâncias tóxicas como ácidos orgânicos, fatos que prejudicam o rendimento fermentativo do processo. Quando se considera o longo período de reciclos (aproximadamente 250 dias por safra e pelo menos 2 ciclos por dia) a maioria das linhagens de leveduras empregadas não são capazes de perdurar no processo, seja pela toxicidade do processo e ou pela competição com contaminantes. Portanto há um esforço contínuo no sentido de se buscar novas linhagens mais aptas ao processo industrial. Para tal é imperiosa a disponibilidade de uma metodologia para simular o processo industrial de modo a permitir uma avaliação de pretensas linhagens quanto ao seu desempenho no processo industrial com reciclo de células. No presente trabalho é proposto um protocolo, simulando as várias condições estressantes de uma fermentação industrial com reutilização de células, para a avaliação de linhagens de levedura com diferentes capacidades de colonizarem as dornas de fermentação. Os resultados obtidos mostraram que o protocolo empregado foi capaz de reproduzir o comportamento fisiológico e tecnológico das linhagens quando submetidas no processo industrial, se constituindo numa ferramenta útil para a seleção de leveduras. / The ethanol became entrenched as the main biofuel and Brazil owns the most economic and environmentally appropriate process. The Brazilian industrial process is unique, since it utilizes the yeast cell recycle, what allows a great fermentation velocity, but the same process enhances the toxics effects presents on the process. The fermentation subtract is composed by the mixture of sugar cane juice and molasses, however the economic advantages of the sugar over the ethanol makes that the juice get prioritized to the production of sugar and it\'s by-product, the molasses, go into the fermentation process. The molasses contain several toxic compounds, like sulfites, salts excess, phenols, furfural and metals. Due to the large scale of the process, the substrate cannot be sterilized before the fermentation and this cause the presence of contaminant microorganisms an always present problem. The contaminant bacteria consumes the substrate and produce toxics products like organic acids, facts that can hinder the yield of the fermentation process. When the long recycle period (approximately 250 days per season, with at least 2 cycles per day) is take in consideration, most of the yeast strains aren\'t capable to endure the process because of the toxicity of it and or by the competition with the contaminants. Therefore there is a continuous effort in the search of new strains best suited for the industrial process. To do so, it`s imperative the availability of a methodology that can simulate the industrial process and the alleged strains can be evaluated in terms of their performance in the industrial process with cell recycle. It`s proposed a protocol on this work, that simulates several stressful conditions of an industrial fermentation with cell recycle, to evaluate the yeast strains with different capabilities in colonize the fermentation tanks. The results indicate that the protocol utilized was capable of reproduce the physiological and technological behavior of the strains when they were submitted to the industrial process, making it a useful tool for yeast selection.

O Experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a substituição parcial e total de plasma bovino por levedura hidrolisada na dieta de leitões desmamados no período de 21 a 47 dias de idade. Foram utilizados 1600 leitões da linhagem PIC, distribuídos em blocos ao acaso, com quatro tratamentos. As dietas foram divididas em quatro fases (pré-inicial I 22 a 28 dias; pré-inicial II 29 a 35 dias; inicial I - 36 a 47 dias e inicial II 48 a 63 dias). A inclusão percentual, Plasma: Levedura, nas dietas foi: T1 (6:0; 4:0; 2:0 e 0:0); T2 (3: 4; 2: 3; 1: 2 e 0: 0); T3 (1,5: 6; 1: 4,5; 0,5: 3 e 0: 0) e T4 (0: 8; 0: 6; 0: 4 e 0: 0). Cada tratamento teve 10 repetições (cinco de machos e cinco de fêmeas) totalizando 40 unidades experimentais com 40 animais cada. As variáveis zootécnicas avaliadas durante o período experimental foram: consumo de ração, ganho de peso, e conversão alimentar. Foram tomadas amostras de sangue de 5 animais por tratamento no dia de início do experimento, e de 10 animais por tratamento 25 dias depois. Foram quantificadas a IgA e a IgG. Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância ANOVA, utilizando-se o teste Tukey para comparação das médias ao nível de significância de 5% utilizando o pacote estatístico SAS. Não houve diferença estatística nas quantidades de Ig A e Ig G circulante, nem na variação destas imunoglobulinas no tempo, entre os tratamentos. Considerando a análise dos dados conclui-se que nas condições estudadas, a utilização da relação percentual de (1,5: 6; 1: 4,5; 0,5: 3 e 0: 0) de plasma: levedura hidrolisada resultou um maior consumo de ração e ganho de peso dos animais, em comparação às outras proporções, e consequentemente podendo trazer um maior lucro para o produtor / The experiment was performed with the objective of evaluating the partial and complete substitution of bovine plasma for hydrolyzed yeast in the diet of weaned piglets from 21 to 47 days old. 1600 piglets of PIC lineage were used and randomly distributed in blocks where they received four treatments. Their diets were divided into four phases (pre-initial I: 22 to 28 days; pre-initial II- 29 to 35 days; initial I- 36 to 47 days and initial II-48 to 63 days). The percentage inclusion Plasma:Yeast in the diets were: T1 (6:0; 4:0; 2:0 and 0:0); T2 (3: 4; 2: 3; 1: 2 and 0: 0); T3 (1.5: 6; 1: 4.5; 0.5: 3 and 0: 0) and T4 (0: 8; 0: 6; 0: 4 and 0: 0). Each treatment had 10 repetitions (five times with the males and five times with the females), totaling 40 experimental units with 40 animals each. Husbandry variables evaluated during the trial period were: feed intake, body weight gain and feed conversion. Blood samples of 5 animals per treatment were taken at the beginning of the experiment day, and 10 animals per treatment 25 days later. IgA and IgG were quantified. The data obtained were analyzed by ANOVA analysis of variance, using the Tukey test to compare means at the 5% significance level, using the statistical package SAS. There was no statistical difference in the quantities of Ig A and Ig G circulating, or the variation of these immunoglobulins in the time, between treatments. Considering the analysis of the data it was concluded that the conditions studied, the percentage utilization ratio of (1.5: 6; 1: 4.5: 0.5: 3 and 0: 0) plasma: hydrolyzed yeast resulted in a higher feed intake and weight gain of animals compared to other proportions, and consequently can bring higher profits to the producer

Não consta resumo na publicação. / The biological value of the proteins of Saccharomyces cerevisiae grown in sugar cane molasses was studied in rats during 3 generations. The animals were fed two levels of yeast protein either 10% or 25% and compared with casein fed controls. In the first generation the PER and body weight were significantly lower for the animals receiving the yeast in their diet. In the 2rd and 3rd generation the growth was retarded even more in relation to what had been observed for the first one, specially at 10% protein level. A decreased male fertility was also observed at litter born from rats fed either 10% or 25% protein. The digestibility for casein was 90% and 80% for single cell protein.

Orientador: José Augusto Rosário Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T20:09:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chaves_MichelRicardodeBarros_M.pdf: 6595019 bytes, checksum: 834b04f04c23dc9c48e6103fda01f3ae (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A redução microbiológica de a-metileno-b-cetoésteres é capaz de fornecer produtos com redução quimio, enantio e diasterosseletiva da ligação C=C, da ligação C=O, ou mesmo de ambas, fazendo uso das enoato redutases e álcool desidrogenases presentes nos microrganismos. Sendo assim, os substratos em estudo foram sintetizados empregando diferentes protocolos, entretanto, o que mostrou ser mais eficiente consistiu do preparo a-metileno-b-hidroxi-ésteres, conhecidos como adutos de Morita-Baylis-Hillman, seguido de oxidação com ácido 2-iodoxibenzóico. Os substratos 2-(benzoil)-prop-2-enoato de metila, 2-[(4-clorofenil)carbonil]-prop-2-enoato de metila e 2-[(4-bromofenil)carbonil]-prop-2-enoato de metila foram biorreduzidos com Saccharomyces cerevisiae tipo II (Sigma-Aldrich®), Pichia stiptis CCT 2617, Rhodotorula glutinis CCT 2182 e Pichia kluyveri CCT 3365 como biocatalisadores. Os a-metil-b-hidróxi-ésteres foram formados tendo Saccharomyces cerevisiae tipo II como melhor biocatalisador, com rendimentos de 70 a 79% além de apresentarem razões syn/anti de até 9:1 com excessos enantioméricos de 99% para ambos diastereoisômeros e predominância do diastereoisômero syn (2S,3S) sobre o anti (2R,3S). Foram avaliados como suporte para o substrato a resina polimérica XAD7HP, que, apesar de fornecer incrementos na diastereosseletividade, apresentou resultados insatisfatórios para a conversão dos a-metil-b-hidroxi-ésteres. A alternativa empregada para contornar os baixos rendimentos apresentados foi o uso de papéis de filtro como suporte para o substrato, realizando o fornecimento do substrato ao meio reacional. O produto 3-(p-bromofenil)-3-hidroxi-2-metil-propanoato de metila teve sua configuração absoluta determinada por RMN de H empregando o método de Mosher, obtendo a configuracao (2S,3S). / Abstract: The microbial reduction of a-methylene-b-ketoesters can furnish products with chemio, enantio and diasteroselective reduction of C=C, C=O or both bonds, making use of the enoate reductases and alcohol dehydrogenases present on microorganisms. Thus, the substrates studied here were prepared using different protocols, but, the one that showed better results consisted of the preparing of Morita-Baylis-Hillman aducts followed by their oxidation with 2-iodoxybenxoic acid. Methyl 2-benzoylprop-2-enoate, methyl 2-[(4-chlorophenyl)carbonyl]prop-2-enoate and methyl 2-[(4-bromophenyl)carbonyl]prop-2-enoate were bioreduced by type II Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich®), Pichia stiptis CCT 2617, Rhodotorula glutinis CCT 2182 and Pichia kluyveri CCT 3365 as biocatalysts and the first one showed better activity. The a-methyl-b-hydroxy-esters were obtained up to 79% yield, showing syn/anti ratio up to 9:1 and e.e. of 99% for both diastereoisomers, also was observed that the syn (2S, 3S) prevailed over its anti diastereoisomer (2R,3S). The use of the polymeric resin XAD7HP as substrate reservoir was evaluated, obtaining good improvement on the diastereoselectivity, although the conversion was unsatisfactory. The chosen alternative to achieve the presented yields was the use of filter paper as substrate reservoir, performing the substrate feeding to the medium. Assignment of the absolute configuration of methyl 3-(p-bromophenyl)-3-hydroxy-2-methyl propanoate was determined by Mosher Ls method, obtaining the configuration (2S,3S). / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

O exossomo é um complexo constituído por até 11 subunidades (Rrp4p, Rrp6p, Rrp40p, Rrp41p, Rrp42p, Rrp43p, Rrp44p, Rrp45p, Rrp46p, Csl4p, Mtr3p) que possui atividade exorribonucleolítica 3`→5` e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs na célula eucariótica. O complexo tem sido estudado em diversos organismos, como leveduras, insetos, plantas, humanos e também em várias espécies de archaea. Apesar da conservação da estrutura do exossomo ao longo da evolução e de oito subunidades do exossomo eucariótico apresentarem domínios de RNase, apenas duas proteínas, Rrp6p e Rrp44p têm atividade catalítica. A despeito da importância do exossomo para a célula, ainda não está claro o papel de cada subunidade na atividade do complexo. Neste trabalho foram utilizados mutantes da subunidade Rrp43p a fim de avaliar como mutações pontuais nesta subunidade afetam a montagem e estabilização do complexo do exossomo de Saccharomyces cerevisiae. Ensaios de purificação do exossomo com TAP-Rrp43p revelaram que os mutantes co-purificam Mtr3p e Rrp44p menos eficientemente. Além disso, os mutantes também apresentam atividade exorribonucleolítica 3`→5` reduzida, indicando que o defeito na montagem do complexo pode afetar a sua atividade enzimática. / The exosome is a protein complex comprised of up to eleven subunits (Rrp4p, Rrp6p, Rrp40p, Rrp41p, Rrp42p, Rrp43p, Rrp44p, Rrp45p, Rrp46p, Csl4p and Mtr3p) that has 3`→5` exoribonucleolytic activity and is involved in degradation and processing pathways of several kinds of RNA in eukaryotes. This complex has also been identified in several organisms, such as yeast, insects, plants, humans and also many species of archaea. Despite the overall structure conservation of the complex throughout evolution and eight of the eukaryotic exosome subunits displaying RNase domains, only two proteins, Rrp6p and Rrp44p have catalytic activity. Although the exosome has been shown to be involved in many different aspects of RNA metabolism, the role that each subunit plays in the activity of the complex has not yet been determined. In this work we used of TAP-purified exosome complexes to study the effect of Rrp43p mutations on the assembly and stabilization of the complex in Saccharomyces cerevisiae. Co-immunoprecipitation assays revealed that Rrp43p mutants co-purify Mtr3p and Rrp44p subunits less efficiently. Besides, Rrp43p mutants also present decreased activity, indicating that an assembly defect may affect its enzymatic activity

Saccharomyces cerevisiae est l’acteur principal de la fermentation du moût de raisin, mais l’influence de facteurs sur sa distribution dans les vignobles est peu connue. La région bordelaise, par son histoire et ses appellations, est une région d’intérêt pour étudier la diversité de S.cerevisiae. Au total, 2422 isolats de S.cerevisiae provenant de prélèvements de raisins et de cuves en fermentation spontanées sur deux années consécutives ont été analysés par 15 à 17 marqueurs microsatellites. Une très grande diversité génétique est mise en évidence, supérieure en mode de conduite conventionnel par rapport au mode biologique. Le mode de conduite influence faiblement la structure de la population de S.cerevisiae au vignoble. L’appellation et le domaine impactent significativement la structure de population, sans que des gradients de diversité n‘apparaissent, mais nos analyses révèlent des connections importantes dans le sens Pessac-Léognan vers les autres appellations du Bordelais, en particulier le Médoc. Des flux importants bidirectionnels sont mis en évidence entre les compartiments vigne et chai, illustrés par la présence de 25% de souches apparentées à des levures commerciales au vignoble, retour des souches du chai au vignoble jusqu’alors sous-estimé, alors qu’un flux d’importance similaire est observé entre le vignoble et le chai. La présence de populations ancestrales communes dans des prélèvements anciens (plus de 20 ans) et récents révèle la stabilité des populations sur le long terme à l’échelle d’une appellation. Une succession temporelle des populations du chai pourrait être favorisée par la mise en œuvre de pied de cuve avec repiquages successifs. / Saccharomyces cerevisiae is the main actor of wine fermentation but still little is known about the factors impacting its distribution in the vineyards. Bordeaux region, by its history and its appellations, is one of the regions of interest to study S. cerevisiae diversity. A total of 2422 isolates of S.cerevisiae sampled from grapes and spontaneous fermentation tanks during two consecutive years were analyzed by 15 to 17 microsatellite markers. A very high genetic diversity is demonstrated, greater in conventional farming system than in organic one. The type of farming system weakly influences the population structure of S.cerevisiae in the vineyard. The appellation and the wine estate significantly impact the population structure, without appearance of diversity gradients, but our analyses reveal important connections from the Pessac-Léognan to other Bordeaux appellations, especially to the Medoc. Bidirectional strong flows are highlight between the vineyard and the cellar compartments as illustrated by the presence of 25% of commercial related strains in the vineyard, due to the unexpected return of strains through cellar to the vineyard, while a flow of similar magnitude is observed between the vineyard and the cellar. The presence of common ancestral populations in old (over 20 years) and recent samples showed population stability over the long-term at an appellation scale. A temporal succession of cellar populations was highlighted that could be link with the implementation of the Pied de Cuve method through successive inoculations.

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