Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348746.pdf: 2398591 bytes, checksum: ee1248fe883b7567941bdb7d90ef2176 (MD5) Previous issue date: 2017 / A produção de etanol de segunda geração depende muito da fermentação da xilose, o segundo açúcar mais abundante nos hidrolisados lignocelulósicos, pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Mas essa levedura é incapaz de fermentar essa pentose, uma vez que não dispõe de enzimas e transportadores eficientes para a sua metabolização. Assim, é importante identificar enzimas e transportadores de xilose de diferentes organismos para a expressão em células de S. cerevisiae. Contudo, pesquisadores têm demonstrado que essa levedura requer modificações genéticas adicionais para uma efetiva fermentação de xilose; entre elas, a sobre-expressão do gene XKS1 (que codifica a xilulocinase) e a deleção do gene PHO13 (que codifica uma fosfatase alcalina) melhoram a fermentação de xilose em linhagens recombinantes. Assim sendo, o presente trabalho se propôs a desenvolver linhagens de S. cerevisiae recombinantes por meio da sobre-expressão do gene XKS1 e/ou deleção do gene PHO13, com o intuito de que essas linhagens possam ser utilizadas como plataformas para a análise de enzimas e transportadores heterólogos envolvidos no metabolismo da xilose. Primeiramente, foi construída a linhagem ASY-1, com a finalidade de servir como plataforma para testes de enzimas heterólogas, já que esta linhagem foi obtida a partir da sobre-expressão do gene XKS1 na linhagem wild-type CEN.PK2-1C. A seguir, foi construida a linhagem ASY-2, a partir da deleção do gene PHO13 na linhagem ASY-1. As linhagens CEN.PK2-1C, ASY-1 e ASY-2 foram transformadas com plasmídeos contendo genes que codificam as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase provenientes das leveduras Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum, respectivamente, e a performance fermentativa das linhagens transformantes foi avaliada. Nossos resultados mostram que a sobre-expressão do gene XKS1 foi necessária para haver consumo de xilose em crescimentos aeróbios e para a produção de etanol a partir dessa pentose em fermentações microaeróbias, indicando que essa sobre-expressão é crucial para o metabolismo da xilose em S. cerevisiae. A deleção do gene PHO13 permitiu um consumo mais rápido e maior da xilose, tanto em crescimentos aeróbios quanto em fermentações microaeróbias, além de ter aumentado a produção de xilitol e alterado a produção de glicerol em todos os ensaios. Ainda, os efeitos vantajosos causados pela deleção do gene PHO13 no consumo de xilose e na produção de etanol se mostraram mais evidentes em meios contendo alta concentração (100 g.L-1) de xilose. Paralelamente, contruímos também a linhagem ASY-3, com a finalidade de servir como plataforma para testes de transportadores heterólogos, sendo que esta linhagem foi construída a partir da deleção do gene PHO13 na linhagem DLG-K1, uma linhagem hxt-null (hxt1-hxt7 e gal2) que possui os genes necessários à metabolização de xilose sobre-expressos mas incapaz de transportar monossacarídeos. As linhagens DLG-K1 e ASY-3 foram transformadas com plasmídeos contendo genes que codificam os transportadores Sut4 e Xut1 provenientes das leveduras Spathaspora arborariae e Scheffersomyces stipitis, respectivamente, e a performance fermentativa das linhagens transformantes foi avaliada. Em ensaios de crescimento aeróbios, nossos resultados mostraram que a deleção do gene PHO13 permitiu consumo mais rápido e maior da xilose, além de maior produção de etanol. No entanto, em fermentações microaeróbias, não houve diferença no consumo de xilose entre as linhagens contendo ou não o gene PHO13 e expressando os transportadores heterólogos. A deleção do gene PHO13 também alterou a produção de glicerol pelas cepas em todos os ensaios fermentativos realizados utilizando transportadores heterólogos. Portanto, as linhagens recombinantes desenvolvidas constituem importantes ferramentas para a clonagem e identificação de novos genes envolvidos no transporte e fermentação de xilose por S. cerevisiae. / Abstract : Second-generation ethanol production depends greatly on the xylose fermentation, the second most abundant sugar in the lignocellulosic hydrolysates, by the yeast Saccharomyces cerevisiae. But this yeast is incapable of fermenting this pentose, since it does not have efficient enzymes and transporters for its metabolization. Therefore, it is important to identify xylose enzymes and transporters of different organisms for the expression in S. cerevisiae cells. However, researchers have shown that this yeast requires additional genetic modifications for an effective xylose fermentation; among them, XKS1 gene (which encodes xylulokinase) overexpression and PHO13 gene (encoding alkaline phosphatase) deletion to improve xylose fermentation in recombinant strains. Thus, the present work aimed to develop recombinant S. cerevisiae strains by XKS1 gene overexpression and/or PHO13 gene deletion, so that these strains could be used as platforms for the analysis of enzymes and transporters involved in xylose metabolism. Firstly, the ASY-1 lineage was constructed to serve as a platform for heterologous enzyme tests, since this lineage was obtained from the XKS1 gene overexpression in the wild-type strain CEN.PK2-1C. The ASY-2 yeast was then constructed by PHO13 gene deletion in the ASY-1 strain. The CEN.PK2-1C, ASY-1 and ASY-2 strains were transformed with plasmids containing genes for xylose reductase and xylitol dehydrogenase from Spathaspora arborariae and Spathaspora passalidarum yeasts, respectively, and the fermentative performance of transformants was evaluated. Our results show that XKS1 gene overexpression was required for xylose consumption in aerobic growths and for ethanol production from this pentose in microaerobic fermentations, indicating that this overexpression is crucial for xylose metabolism in S. cerevisiae. PHO13 gene deletion allowed a faster and greater xylose consumption, both in aerobic growth and microaerobic fermentations, in addition to increasing the production of xylitol and altering the production of glycerol in all the assays. Furthermore, the advantageous effects caused by PHO13 gene deletion on xylose consumption and ethanol production were more evident in media containing high xylose concentrations (100 g.L-1). At the same time, we also built the ASY-3 lineage, in order to serve as a platform for heterologous transporter tests. This strain was constructed by the PHO13 gene deletion in the DLG-K1 strain, a hxt-null yeast (hxt1-hxt7 and gal2) which has the genes necessary for xylose metabolization overexpressed, but incapable of transporting monosaccharides. The DLG-K1 and ASY-3 yeast were transformed with plasmids containing genes encoding the Sut4 and Xut1 transporters from Spathaspora arborariae and Scheffersomyces stipitis yeasts, respectively, and the fermentative performance of the transformants was evaluated. In aerobic growth assays, our results showed that PHO13 gene deletion allowed for faster and greater xylose consumption, in addition to higher ethanol production. However, in microaerobic fermentations, there was no difference in xylose consumption between strains containing or not the PHO13 gene and expressing the heterologous transporters. PHO13 gene deletion also altered glycerol production by the strains in all fermentative assays performed using heterologous transporters. Thus, the developed recombinant strains are an important tool for cloning and identification of new genes involved in xylose transport and fermentation by S. cerevisiae.

Com o aumento de pacientes imunocomprometidos nas últimas décadas, os fungos têm emergido como uma das causas de doenças humanas. Leveduras ubíquas e/ou comensais como Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. estão sendo descritas como importantes causadoras de infecções. Com o objetivo de avaliar clinicamente os casos de infecções por leveduras emergentes, foi realizado um estudo de 101 casos diagnosticados da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre nos últimos anos, revisando a apresentação clínica, condição predisponente, terapia utilizada e evolução dos pacientes. A doença de base mais frequente foi insuficiência renal. A manifestação clínica principal foi febre. Os fatores de risco mais frequentes foram uso de cateter venoso central e internação em unidade de terapia intensiva. O antifúngico mais utilizado no tratamento das infecções por S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri e Trichosporon sp. foi o fluconazol e no tratamento das infecções por Rhodotorula sp. foi a anfotericina B. Aproximadamente 32% dos pacientes apresentaram melhora clínica após o tratamento com antifúngico e 26% foram a óbito. O diagnóstico rápido e específico destas leveduras é importante para a decisão terapêutica e o melhor prognóstico. / With the increase of immunocompromised patients in recent decades, fungi have emerged as a major cause of human diseases. Ubiquitous yeast and/or commensal as Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. are described as important causative agents of infections. Faced with this, the identification of yeast is important for therapeutic decisions and for epidemiological studies. In order to clinically evaluate the cases of yeast infections emerging, a study of the major cases diagnosed at Irmandade Santa Casa de Misericordia de Porto Alegre in recent years, reviewing the clinical presentation, predisposing condition, therapy and patients’s progress. The underlying disease frequently was renal failure. The major clinical manifestation was fever. The most frequent risk factors were: use of central venous catheter and intensive care unit stay. The most used antifungal in the treatment of infections caused by S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri and Trichosporon sp. was fluconazole and in the cases of infections by Rhodotorula sp. was amphotericin B. Most patients showed clinical improvement after treatment with antifungal. Approximately 32% of patients showed clinical improvement after treatment with antifungal and 26% died.The rapid and specific diagnosis of these yeasts is important for the therapeutic decision and a better prognosis.

Saccharomyces cerevisiae é uma levedura que possui papel fundamental na transformação do mosto em vinho. Durante a fermentação, a levedura selecionada transfere para o meio, componentes resultantes de seu metabolismo como etanol, aldeídos, enzimas, proteínas, entre outros. Existem algumas que possuem ação definida, como a proteína killer. Este trabalho teve como objetivo determinar as condições necessárias para a detecção e expressão do fator killer produzido por linhagens de levedura Sacch. cerevisiae isoladas de mosto de uva. Como linhagens killer, foram utilizadas as linhagens Sacch. cerevisiae Embrapa 91B, Sacch. cerevisiae Embrapa 1B, e uma linhagem comercial Sacch. cerevisiae K1 (Lallemand). Como linhagem sensível, foi empregada Sacch. cerevisiae Embrapa 26B. Para detecção do fator killer foram avaliados meios de cultura sólidos, preparados com diferentes concentrações de mosto de uva e extrato de levedura não comercial (ELNC). Para a produção do fator killer foram avaliados meios líquidos com diferentes concentrações de mosto de uva, ELNC e sacarose. Foi avaliada a produção do fator em condições aeróbicas e anaeróbicas de crescimento. O meio de cultura definido para detecção do fator killer foi o meio contendo 80 % de mosto de uva e 20 % de ELNC em sua composição. O meio líquido que proporcionou melhores condições de síntese do fator killer foi o meio preparado com 5% de mosto e 95 % de ELNC contendo 100 g/L de sacarose. A expressão do fator killer foi inibida em condições aeróbicas, exceto quando as linhagens foram cultivadas em meio líquido com elevada concentração de sacarose. / The yeast Saccharomyces cerevisiae has a key role in the process of converting must into wine. During fermentation the selected yeast transfers to the medium compounds resulting from metabolism such as ethanol, aldehyde, enzymes and proteins. Some compounds have an antibiotic effect like killer proteins. The aim of this work was to verify the conditions for detection and expression of killer factor produced by Sacch. cerevisiae isolated from grape must. The killer yeast strains used for the experiments were Sacch. cerevisiae Embrapa 91B, Sacch. cerevisiae Embrapa 1B and a commercial yeast Sacch. cerevisiae K1 (Lallemand). The yeast Sacch. cerevisiae Embrapa 26B was used as sensitive strain. Solid media prepared with different concentrations of grape must and non-commercial yeast extract (ELNC), were used to detect the killer factor. Culture media prepared with different concentrations of grape must, ELNC and sucrose, were employed for killer factor expression. Synthesis of killer protein was evaluated under anaerobic and aerobic growth conditions. Detection of killer protein presented better results when using a culture medium prepared with 80 % of grape must and 20 % of ELNC. The liquid medium that provided the best conditions for killer factor expression was prepared with 5 % of grape must and 95 % of ELNC supplemented with 100 g/L of sucrose. Killer factor expression was inhibited under aerobic conditions, except when strains were growth in liquid media prepared with high concentrations of sucrose.

Cádmio (Cd²+) é um metal pesado tóxico para os sistemas biológicos e que pode competir com íons essenciais como Zn²+, Ca²+ e Mg²+ por seus respectivos sistemas de transporte. Em S. cerevisiae, íons Cd²+ podem ser conjugados com GSH formando complexos Cd.[GS]2 - os quais são internalizados no vacúolo pelo transporatador Ycf1p. Neste trabalho, foi feita uma análise comparativa da atuação de Ycf1p na desintoxicação de Cd²+ durante o metabolismo fermentativo e respiratório de S. cerevisiae. Adicionalmente, foi realizada uma investigação sobre a contribuição de transportadores de cálcio (Ca²+) para a tolerância ao Cd²+. Os resultados mostram que, durante o metabolismo respiratório, o mutante ycf1Δ é mais tolerante à Cd²+ e aos oxidantes t-BOOH e H2O2 do que a linhagem selvagem. Esta tolerância possivelmente está relacionada com o maior conteúdo de GSH presente nas células ycf1Δ. Na linhagem selvagem BY4741, a atividade do promotor YCF1 sofre uma queda gradual durante a transição do metabolismo fermentativo para o respiratório e a sua indução em resposta à Cd²+ depende da disponibilidade de GSH. Estes dados indicam que a atividade de Ycf1p pode, direta ou indiretamente, influenciar a homeostase de GSH e que as células de S. cerevisiae devem possuir mecanismos independentes de Ycf1p para conter a toxicidade do Cd²+ em situações nas quais a disponibilidade de GSH esteja comprometida. Neste contexto, os resultados do trabalho mostram também que as ATPases de Ca²+ Pmr1p e Pmc1p podem contribuir para a tolerância ao Cd²+. Na linhagem selvagem BY4741 o tratamento com Cd²+ promove aumento da expressão de PMC1 e este aumento é ainda maior nos mutantes ycf1Δ. O gene PMR1 só é induzido por Cd²+ na ausência do gene YCF1 funcional. Entretanto, no mutante pmr1Δ a expressão basal de YCF1 e PMC1 é maior do que na linhagem selvagem (70% e 200%, respectivamente). Adicionalmente, a ausência de Pmr1p funcional está associada a um acúmulo crescente, tempo dependente, de Cd²+ intracelular. Por outro lado, a linhagem selvagem BY4741 alterna fases de captação e exportação do metal. Os resultados apontam para Pmr1p e Pmc1p como proteínas auxiliares na desintoxicação de Cd²+ em S. cerevisiae, as quais possivelmente são ativadas em situações onde a formação e posterior importação de complexos Cd-[GS]2 por Ycf1p não é adequada ao metabolismo celular. / Cadmium (Cd²+) is a heavy metal highly toxic to biological systems, which can compete with essential ions like Zn²+, Ca²+ e Mg²+ for their respective transport systems. In the yeast S. cerevisiae, Cd²+ can be conjugated with GSH generating complexes of Cd - [GS]2 which, in turn, are removed from the cytosol to the vacuole by specific transmembrane proteins such as the glutathione-conjungated transporter Ycf1p. In this work the role of Ycf1p in Cd²+ detoxification during respiratory metabolism of S. cerevisiae was investigated. In addition, the contribution of Ca²+ transporters for Cd²+ detoxification was analized. The results showed that in respiratory condition the mutant ycf1Δ is more tolerant to Cd²+ and to the oxidants t-BOOH and H2O2 than the wild-type strain. This tolerance is probably related to the high content of GSH present in the ycf1Δ mutant. Expression of the YCF1 promoter in the wild type strain is naturally downregulated after the transition from fermentative to respiratory metabolism (diauxic shift), and its induction in response to Cd²+ is dependent on GSH availability. These data indicate that Ycf1p activity can, in some way, influence GSH intracellular homeostasis. Therefore, yeast cells may have an Ycf1p-independent mechanism to cope with Cd²+ toxicity when GSH availability is compromised. Accordingly, the results of this work point also to the contribution of the Ca²+-ATPases Pmc1p and Pmr1p to Cd²+ detoxification. In the BY4741 wild-type strain, Cd²+ treatment triggers an increase in PMC1 expression, and this increase is even greater in the ycf1Δ mutant strain. The PMR1 gene is induced by Cd²+ only in the absence of the functional YCF1 gene. However, the basal expression of YCF1 and PMC1 is higher in the pmr1Δ mutant than in wild-type cells (70% and 200%, respectively). In addition, the absence of the functional Pmr1p is associated with a crescent, timedependent, Cd²+ uptake by the cells. Unlikely, alternating phases of uptake and export of metal are observed in BY4741 wild-type cells. The results indicate that Pmr1p and Pmc1p can act as accessory proteins for Cd²+ detoxification, which possibly are activated when the formation and subsequent import of Cd-[GS]2 by Ycf1p is not adequate to cellular metabolism.

Os alcalóides β-carbolínicos possuem uma ampla distribuição, sendo encontrados em várias famílias de plantas, além de estarem presentes na fumaça do cigarro, bebidas alcoólicas, alimentos excessivamente cozidos e em mamíferos. Estes alcalóides são conhecidos por apresentarem várias ações farmacológicas sobre os sistemas nervoso central, muscular e cardiovascular, causando alucinações, tremores, convulsões, hipotensão e bradicardia. Possuem também atividade antioxidante e imunossupressora, além de ligarem-se a receptores de serotonina, dopamina, benzodiazepina; são também inibidores das enzimas monoamino-oxidase-A (MAO-A) e DNA topoisomerases. Os objetivos do presente estudo foram avaliar os possíveis efeitos antioxidantes, antimutagênicos, antigenotóxicos e neurocomportamentais dos alcalóides β-carbolínicos: harmano, harmina, harmol, harmalol e harmalina, utilizando teste de sensibilidade e antimutagênese em Saccharomyces cerevisiae, ensaio cometa em cultura de células de pulmão de hâmster chinês (V79) e avaliação do comportamento, através da tarefa de reconhecimento de novo objeto, em camundongos, respectivamente. Em testes de sensibilidade, todos os alcalóides protegeram as linhagens deficientes em sistemas de defesa antioxidante de S. cerevisiae contra danos induzidos pelos oxidantes H2O2 e paraquat. De maneira geral, os alcalóides β-carbolínicos protegeram mais as células dos danos gerados pelo H2O2 e o aumento da viabilidade foi mais significativo para as linhagens sod1Δ, sod2Δ e sod1Δsod2Δ. Também, possivelmente por uma ação seqüestradora de espécies reativas de oxigênio, os alcalóides β-carbolínicos mostraram forte atividade contra danos no DNA induzidos pelo H2O2, no teste de antimutagênese com a linhagem N123 de S. cerevisae e no teste de antigenotoxicidade, utilizando o ensaio cometa com células V79. As dihidro-β-carbolinas harmalina e harmalol mostraram um efeito mais pronunciado que as β-carbolinas nos ensaios citados acima. Quanto à avaliação dos efeitos neurocomportamentais em camundongos, a administração sistêmica dos alcalóides β-carbolínicos facilitou a formação de memória de curta duração, no caso da harmina, harmol e harmalina e, também a memória de longa duração (harmalina) em camundongos, verificada com uso da tarefa de reconhecimento de novo objeto.

Orientador: Ana Marisa Fusco de Almeida / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattas / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Resumo: A produção de bioetanol industrial pela levedura Saccharomyces cerevisiae continua em crescimento devido à demanda energética e ambiental. Considerando a importância da produção de bioetanol para a economia nacional é importante conhecer a levedura Saccharomyces cerevisiae, bem como as diversas formas de estresse que estas podem sofrer, suas respostas, os tipos de processos de fermentação, desta forma, foram testados a resistência dos isolados aos principais fatores de estresse (osmótico, térmico e etanólico) e a sua capacidade de produzir etanol. Estas informações serão necessárias para selecionar novas linhagens de leveduras, no intuito de melhorar a produção de etanol. Para tanto, foram selecionadas de uma safra de cana-de-açúcar que utiliza fermento de panificação como inóculo inicial, 34 leveduras da cuba e da dorna de fermentação de uma usina da região de Araraquara. Dessas, 28 isolados foram identificados como Saccharomyces cerevisiae a partir das técnicas moleculares de PCR e PCR-RFLP. Três isolados foram caracterizados e selecionados como resistentes a alta temperatura, alta concentração de açúcares e alta concentração de etanol. Porém somente o isolado denominado ZFC4 pode ser considerado como um bom inóculo para iniciar um processo fermentativo para a produção de bioetanol, pois este apresenta um alto rendimento de etanol, resistência a alta temperatura e às altas concentrações de etanol, mostrando-se mais tolerante que a linhagem de referencia PE-2. Para uma discriminação genética dos isolados selecionados foi realizado sequenciamento do gene rRNA da região 25S, 18S e 5.8S, porém os resultados não puderam elucidar sobre os seus diferentes comportamentos fenotípicos. Linhagens industriais apresentam uma constituição genética complexa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bio-ethanol production by yeast Saccharomyces cerevisiae continues a growing industry due to energy and environmental demands. Considering the importance of bioethanol to the national economy is important to know the yeast Saccharomyces cerevisiae, as well as various forms of stress they may suffer, their responses, types of processes of fermentation, thus, we tested the resistance of the isolates the main factors of stress (osmotic, thermal and ethanol) and the ability to produce ethanol. To somewhat of a crop of cane sugar were isolated 34yeasts from the vat and a tank of fermentation of the plant. These, 28 isolates were identified as Saccharomyces cerevisiae from PCR and PCR-RFLP. Three isolates were characterized as resistant to high concentration of sugar (20% glucose and sucrose) and 39°C in presence 12% ethanol. However, only the isolated ZFC4 can be considered as a good inoculum to start a fermentative process for the production of ethanol because it has a high ethanol yield and greater resistance to high temperature and high ethanol concentrations and proved to be more tolerant than the reference strain of Pe-2. For a genetic discrimination of selected isolates was performed sequencing gene rRNA of the region 25S, 18S and 5.8S, however the results could not elucidate their different phenotypic behavior. Industrial strains have a complex genetic constitution, molecular tools that are needed to understand the survival capacity of these strains to stress throughout the fermentation process. To that end, after the characterization of genotypes and phenotypes of Saccharomyces cerevisiae isolates selected genes differentially expressed during the fermentation test, were identified by technique known as RDA (Representational Difference Analysis). In this context, 196 clones were... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Érico Tosoni Costa / Banca: Dirce Maria Carraro / Resumo: Ácido retinóico (AR) regula a transcrição de uma série de genes envolvidos em proliferação celular, diferenciação celular e apoptose através de sua ligação com o receptor de ácido retinóico (RAR) ligado com o receptor de retinóide X (RXR) na forma de heterodímero. A proteína ligante de ácido retinóico celular (CRABP2) é envolvida no transporte do AR do citoplasma para o núcleo, atuando assim como uma proteína coativadora dos receptores retinóides nucleares. Com o objetivo de melhor entender o mecanismo de sinalização celular por ácido retinóico envolvendo CRABP2, foi utilizado o sistema de duplo-híbrido em levedura como uma ferramenta para identificação de interações físicas proteína-proteína. Um total de 20 proteínas candidatas ligantes de CRABP2 foram identificadas no rastreamento de duplo-híbrido, das quais cinco são relacionadas com regulação da transcrição, mais especificamente com o processo de remodelagem da cromatina: polipeptídeo do complexo T (TCP1), histona H3/família 3A (H3F3A), histona H3/família 3B (H3F3B), tubulina beta (TUBB) e fator associado ao CTD relacionado com SR (SCAF1). Esses resultados sugerem um papel mais direto de CRABP2 na remodelagem de cromatina e poderá revelar novos aspectos da regulação da transcrição mediada por receptores de ácido retinóico. Além disso, também foi abordado neste trabalho um estudo dos níveis de expressão dos receptores de ácido retinóico em resposta a agentes desmetilantes / Abstract: Retinoic acid (RA) regulates the transcription of a series of genes involved in cell proliferation, differentiation and apoptosis by binding to RA Receptor (RAR) and Retinoid X Receptor (RXR) heterodimers. The cellular retinoic acid-binding protein 2 (CRABP2) is involved in the transport of RA from the cytosol to specific RA receptors in the nucleus, acting as a coactivator of nuclear retinoid receptors. In order to have a better understanding of the mechanism of cellular signaling by retinoic acid involving CRABP2, we used the yeast two-hybrid system as a tool for the identification of physical protein-protein interactions. A total of twenty putative CRABP2-interacting proteins were identified in the two-hybrid screen, out of which five are related to transcription regulation, more specifically to the process of chromatin remodeling: t-complex 1 (TCP1); H3 histone, family 3A (H3F3A); H3 histone, family 3B (H3F3B); tubulin beta (TUBB) and SR-related CTD-associated factor 1 (SCAF1). These results suggest a more direct role for CRABP2 in chromatin remodeling and may reveal new aspects of the control of transcription by RA receptors. Furthermore, we have also investigated the expression levels of the retinoic acid receptors, in mammalian cells in response to demethylating agents / Doutor

Piper gaudichaudianum Kunth é uma planta da família Piperaceae, que se desenvolve abundantemente em toda a Mata Atlântica, sendo popularmente conhecida como pariparoba, jaborandi ou iaborandi. Na medicina popular suas raízes frescas são mastigadas e utilizadas como antiflamatório no alívio de dores de dente e contra distúrbios hepáticos. Um dos componentes mais estudados desta planta é o óleo essencial, cujas análises fitoquímicas revelaram o (E)-nerolidol como um dos compostos majoritários. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas e mutagênicas, bem como investigados os mecanismos de citotoxicidade do óleo essencial de P. gaudichaudianum e de seu componente majoritário nerolidol, utilizando diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae. Foram empregadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em genes de reparo para excisão de bases (BER), excisão de nucleotídeos (NER), recombinação homóloga (HR), recombinação não-homóloga (NHEJ), reparo pós-replicativo (PRR) e síntese translesão (TLS). A influência do sistema redox foi avaliada em linhagens de S. cerevisiae deficientes em superóxido dismutase e/ou catalase. Os resultados dos tratamentos das linhagens XV185-14c e N123 de S. cerevisiae demonstram que, tanto o óleo essencial de P. gaudichaudianum, quanto o nerolidol induzem citotoxicidade de maneira dose dependente, sendo essa citotoxicidade mais pronunciada nos tratamentos com nerolidol. Nas avaliações de mutagênese o óleo essencial induziu efeito mutagênico na linhagem XV185-14c na concentração mais alta, entretanto o nerolidol não induziu qualquer tipo de efeito mutagênico. Os ensaios com as linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em reparo revelaram um importante papel da via BER no efeito citotóxico, tanto para os tratamentos com óleo essencial, o qual induziou uma grande sensibilidade na linhagem deficiente na DNA glicosilase Ntg2, quanto para o nerolidol, que induziu sensibilidade nas mutantes para a endonuclease Apn1 e glicosilase Ntg1. Curiosamente, linhagens deficientes em TLS e PRR não apresentaram sensibilidade aos tratamentos com o óleo essencial de P. gaudichaudianum, entretanto os simples mutantes rev1, rad30 e rad18 demonstraram notável resistência ao nerolidol. Além disso, verificou-se em linhagens deficientes na enzima superóxido dismutase (sod1 e sod2) um aumento de sensibilidade nos tratamentos com o óleo essencial e com o nerolidol. No ensaio de detecção de radicais livres, por 2’7’-diclorofluoresceína (DCFH-DA), verificou-se que ambos tratamentos induzem aumento de espécies reativas de oxigênio. Considerando a resposta das diferentes linhagens de S. cerevisie utilizadas neste estudo, o conjunto destes resultados leva-nos a sugerir que tanto o óleo essencial quanto o nerolidol não são mutagênicos e que a citotoxicidade induzida pelo óleo essencial está relacionada com a formação de lesões oxidativas, sendo o nerolidol o principal responsável pelos efeitos biológicos induzidos pelo óleo essencial de P. gaudichaudianum. / Piper gaudichaudianum Kunth is a plant of the Piperaceae family, which develops abundantly throughout the Atlantic Forest, popularly known as pariparoba, jaborandi or iaborandi. In popular medicine the fresh roots are chewed and used as antinflamatory to relief of toothaches, and against liver disorders. One of the most studied components of the plant is the essential oil, which the phytochemical analysis revealed (E)-nerolidol as major compound. In the present study, we have evaluated the cytotoxicity and mutagenicity, as well as investigated the mechanism of cytotoxicity of essential oil of P. gaudichaudianum and its major component nerolidol using different strains S. cerevisiae. Strains deficient in DNA repair mechanisms such as base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ), post-replication repair (PRR) and translesion synthesis (TLS) were employed. The influence of the redox system was evaluated in superoxide dismutase and/or catalase defective strains. The results of treatment of XV185-14 and N123 S. cerevisiae strains demonstrated that the essential oil and nerolidol induced cytotoxicity in a dose dependent manner, and this cytotoxicity is more pronounced with nerolidol treatments. In the mutagenicity assay only P. gaudichaudianum essential oil, but not nerolidol was able to induce mutagenic effect at highest concentration in XV185-14c strain. Employing S. cerevisiae strains proficient and deficient in DNA repair treated with P. gaudichaudianum essential oil and neroliodol, it was observed an important role of the BER pathway in the cytotoxic response, since the essential oil induced a great sensitivity in strain deficient in DNA glycosylase Ntg2, and nerolidol in mutants deficient in Apn1 endonuclease and glycosylase Ntg1. Interestingly, deletion of TLS and PRR proteins had no influence on sensitivity to the essential oil, however single mutants rev1, rad30 and rad18 exhibited a remarkable resistance to nerolidol. Besides, the absence of superoxide dismutase enzyme increases the sensitivity to essential oil and nerolidol. In the 2`,7`-dichlorofluorescin (DCFH-DA) assay for detection of free radical generation, both treatments were able to increase ROS production. Considering the response of the different S. cerevisiae strains used in this study, our results demonstrate that P. gaudichaudianum essential oil and its major compound nerolidol are not mutagenic but do induce significant cytotoxic effects in S. cerevisiae that might be related to ROS generation. The cytotoxicity observed is mainly related to the generation of oxidative lesions. Moreover, nerolidol is the major compound responsible for the biological effects induced by P. gaudichaudianum essential oil.

Com o aumento de pacientes imunocomprometidos nas últimas décadas, os fungos têm emergido como uma das causas de doenças humanas. Leveduras ubíquas e/ou comensais como Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. estão sendo descritas como importantes causadoras de infecções. Com o objetivo de avaliar clinicamente os casos de infecções por leveduras emergentes, foi realizado um estudo de 101 casos diagnosticados da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre nos últimos anos, revisando a apresentação clínica, condição predisponente, terapia utilizada e evolução dos pacientes. A doença de base mais frequente foi insuficiência renal. A manifestação clínica principal foi febre. Os fatores de risco mais frequentes foram uso de cateter venoso central e internação em unidade de terapia intensiva. O antifúngico mais utilizado no tratamento das infecções por S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri e Trichosporon sp. foi o fluconazol e no tratamento das infecções por Rhodotorula sp. foi a anfotericina B. Aproximadamente 32% dos pacientes apresentaram melhora clínica após o tratamento com antifúngico e 26% foram a óbito. O diagnóstico rápido e específico destas leveduras é importante para a decisão terapêutica e o melhor prognóstico. / With the increase of immunocompromised patients in recent decades, fungi have emerged as a major cause of human diseases. Ubiquitous yeast and/or commensal as Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. are described as important causative agents of infections. Faced with this, the identification of yeast is important for therapeutic decisions and for epidemiological studies. In order to clinically evaluate the cases of yeast infections emerging, a study of the major cases diagnosed at Irmandade Santa Casa de Misericordia de Porto Alegre in recent years, reviewing the clinical presentation, predisposing condition, therapy and patients’s progress. The underlying disease frequently was renal failure. The major clinical manifestation was fever. The most frequent risk factors were: use of central venous catheter and intensive care unit stay. The most used antifungal in the treatment of infections caused by S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri and Trichosporon sp. was fluconazole and in the cases of infections by Rhodotorula sp. was amphotericin B. Most patients showed clinical improvement after treatment with antifungal. Approximately 32% of patients showed clinical improvement after treatment with antifungal and 26% died.The rapid and specific diagnosis of these yeasts is important for the therapeutic decision and a better prognosis.

Os alcalóides β-carbolínicos possuem uma ampla distribuição, sendo encontrados em várias famílias de plantas, além de estarem presentes na fumaça do cigarro, bebidas alcoólicas, alimentos excessivamente cozidos e em mamíferos. Estes alcalóides são conhecidos por apresentarem várias ações farmacológicas sobre os sistemas nervoso central, muscular e cardiovascular, causando alucinações, tremores, convulsões, hipotensão e bradicardia. Possuem também atividade antioxidante e imunossupressora, além de ligarem-se a receptores de serotonina, dopamina, benzodiazepina; são também inibidores das enzimas monoamino-oxidase-A (MAO-A) e DNA topoisomerases. Os objetivos do presente estudo foram avaliar os possíveis efeitos antioxidantes, antimutagênicos, antigenotóxicos e neurocomportamentais dos alcalóides β-carbolínicos: harmano, harmina, harmol, harmalol e harmalina, utilizando teste de sensibilidade e antimutagênese em Saccharomyces cerevisiae, ensaio cometa em cultura de células de pulmão de hâmster chinês (V79) e avaliação do comportamento, através da tarefa de reconhecimento de novo objeto, em camundongos, respectivamente. Em testes de sensibilidade, todos os alcalóides protegeram as linhagens deficientes em sistemas de defesa antioxidante de S. cerevisiae contra danos induzidos pelos oxidantes H2O2 e paraquat. De maneira geral, os alcalóides β-carbolínicos protegeram mais as células dos danos gerados pelo H2O2 e o aumento da viabilidade foi mais significativo para as linhagens sod1Δ, sod2Δ e sod1Δsod2Δ. Também, possivelmente por uma ação seqüestradora de espécies reativas de oxigênio, os alcalóides β-carbolínicos mostraram forte atividade contra danos no DNA induzidos pelo H2O2, no teste de antimutagênese com a linhagem N123 de S. cerevisae e no teste de antigenotoxicidade, utilizando o ensaio cometa com células V79. As dihidro-β-carbolinas harmalina e harmalol mostraram um efeito mais pronunciado que as β-carbolinas nos ensaios citados acima. Quanto à avaliação dos efeitos neurocomportamentais em camundongos, a administração sistêmica dos alcalóides β-carbolínicos facilitou a formação de memória de curta duração, no caso da harmina, harmol e harmalina e, também a memória de longa duração (harmalina) em camundongos, verificada com uso da tarefa de reconhecimento de novo objeto.