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Construção de linhagens atenuadas de Salmonella enterica Enteritidis : avaliação do potencial imunogênico e protetor / Cosntruction of attenuated Salmonella enterica Enteritidis strains : evaluation of its immunogenic and protective potential

Moraes, Marcos Henrique de, 1986- 06 April 2012 (has links)
Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T03:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_MarcosHenriquede_M.pdf: 1961086 bytes, checksum: 56f96f9d1cad5160a5c9417fc809b09e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Salmonella enterica é uma bactéria Gram-negativa classificada em diferentes sorovariedades que podem causar desde gastroenterites a infecções sistêmicas. A sorovariedade Enteritidis é predominante nos casos de salmonelose em humanos, tendo produtos derivados do frango como principal fonte de infecção. Uma forma de se controlar infecções por Enteritidis é através da vacinação de frangos, uma estratégia já utilizada, porém com limitações, pois estas vacinas muitas vezes são inativadas ou possuem origem de atenuação desconhecida. Outra limitação é a falta de estudos específicos para Enteritidis, pois maior parte dos estudos feitos com S. enterica se baseiam na sorovariedade Typhimurium. Um alvo para a construção de linhagens vacinais são os genes codificadores de Nucleoid Associated Proteins que são proteínas que se ligam ao DNA alterando sua topologia, afetando a transcrição global dos genes. Neste projeto realizamos a construção de mutantes nulos de S. enterica Enteritidis para alguns destes genes com a finalidade de avaliar seu potencial vacinal e papel na patogênese. As linhagens foram testadas no modelo de infecção sistêmica e de inflamação do ceco. No modelo de infecção sistêmica, a linhagem selvagem e ?fis se apresentaram virulentas ou pouco atenuadas enquanto as linhagens ?ihfA e ?ihfB foram atenuadas. Os testes de proteção foram feitos com os dois mutantes atenuados que induziram 100% de proteção. A linhagem selvagem e o mutante pouco atenuado induziram inflamação neste modelo, mas o mutante induziu de forma mais amena. Analises morfométricas futuras irão elucidar com mais clareza o papel deste gene na inflamação. Este projeto teve como principais realizações: (i) a construção de duas linhagens atenuadas, com alto potencial para uso vacinal e (ii) abriu novas possibilidades para o estudo nas NAP's durante a patogênese de diferentes sorovariedades / Abstract: enterica is a Gram-negative bacterium classified in different sorovars which may causes gastroenteritis and systemic infections. The serovar Enteritidis is responsible for most of the cases of salmonellosis in humans and have poultry based products as its main source of infection. Poultry vaccination has been and effective strategy to control Enteritidis infections and it's already applied, but with limitations, because the vaccines sometimes are inactivated or are attenuated by unknown mechanisms. Another limitation is the lack of studies especific to Enteritidis, most of the research related to S. enterica is based on serovar Typhimurium. A target to vaccine strains development are the genes members of the group called Nucleoid Associeted Proteins, which are proteins that bind to DNA changing its topology and affecting global gene transcription. In this project, we constructed S. enterica null mutants to some of these genes aiming the evaluation of their vaccine potential and and role in pathogenesis. The strains were tested with the systemic infection model and cecum inflamation. In the systemic infection model, the wild and ?fis strain were virulent while the ?ihfA and ?ihfB were attenuated. The protection essays were made with attenuated mutants and provided 100% of protection. The wild and ?fis strains lead to inflammation in this model, but the mutant induced a mild inflammation, morfometrics analysis will clarify the role of this gene in inflammation. This project have as main outcomes: (i) the construction of strains, ?ihfA and ?ihfB, with good potential to be used as vaccines; (ii) New possibilities to the role of fis gene during inflammation / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular
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Role of the Cpx pathway in Salmonella pathogenesis

Subramaniam, Sivaraman January 2009 (has links)
Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2009
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Improvement of Salmonella vaccine strains for cancer immune therapy based on secretion or surface display of antigens

Hotz, Christian January 2008 (has links)
Würzburg, Univ., Diss., 2008
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Étude de la survie et de la virulence de Salmonella enterica ssp. enterica dans des modèles gastro-intestinaux humains

Cavestri, Camille 04 February 2021 (has links)
Salmonella enterica spp. enterica est un pathogène omniprésent responsable de toxi-infection alimentaire pouvant potentiellement être mortelle pour l’humain. Afin de déclencher une infection, le pathogène doit survivre aux conditions stressantes rencontrées lors de son passage dans le tractus gastro-intestinal humain et coordonner l'expression de plusieurs facteurs de virulence. L’objectif de cette thèse est d’étudier le comportement de différentes souches de S. enterica dans le tractus gastro-intestinal humain en utilisant des approches in vitro. Les souches ont été sélectionnées en fonction de leur potentiel de virulence et de leur origine (clinique, alimentaire, animale, environnementale). En simulant le tractus gastro-intestinal supérieur avec le modèle in vitro TIM-1, une mortalité bactérienne est observée en compte viable dans l'estomac comparé aux résultats au PMA-qPCR. Cette différence suggère la présence de cellules viables mais non cultivables dans l’estomac. Une reprise de croissance est par la suite observée dans le duodénum et l’iléon. Après le passage dans le TIM-1, toutes les souches ont bien survécu, mais la survie de S. enterica dépendait de sa virulence. En effet, les souches de virulence élevée avaient significativement une survie plus élevée que celles de faible virulence. En condition iléale simulée dans le modèle PolyfermS, S. enterica est progressivement éliminée du milieu durant les douze premières heures, mais certaines souches maintiennent leur présence avec le lavage continu après 24 h. Les souches de S. enterica varient donc dans leur capacité à coloniser le système en présence du microbiote iléal. Par ailleurs, l’ajout de S.enterica n’a eu aucun impact sur la composition du microbiote iléale ou sur son activité métabolique. S. enterica ne peut utiliser le système immunitaire pour provoquer une dysbiose dans ce modèle, ce qui limite les mécanismes compétitifs. L’exposition des souches de S. enterica à une digestion gastro-intestinale en présence du microbiote iléal a induit l'expression de facteurs de virulence liés à l'adhésion et au gène ssaB du SPI-2, malgré l'absence de tissus hôtes. Cette induction était plus importante pour les souches à virulence élevée que pour les souches à faible virulence. Ces résultats approfondissent les connaissances sur le comportement de S. enterica dans le tractus gastro-intestinal humain pour pouvoir établir des stratégies de prévention contre ce microorganisme pathogène et pour mieux gérer le risque lié à Salmonella. / Salmonella enterica subsp. enterica is a ubiquitous pathogen responsible for food-borne infection, potentially life-threatening to humans. In order to trigger infection, the pathogen must survive the stressful conditions of the human gastrointestinal tract and coordinate the expression of several virulence factors in response to this environment. The objective of this thesis is to study the behavior of S. enterica in the human gastrointestinal tract using in vitro approaches. S. enterica strains were selected according to their virulence potential and their origin (clinical, food, animal and environmental). By simulating the upper gastrointestinal tract with the in vitro model TIM-1, bacterial mortality was observed by viable count in the stomach, compared to PMA-qPCR results. This difference suggests the presence of viable but non-cultivable cells. A resumption of growth was subsequently observed in the duodenum and the ileum. After passage through the TIM-1, all strains survived but high virulence S. enterica strains had significantly higher survival than low virulence strains. In simulated ileal conditions in the PolyfermS model, S. enterica was gradually eliminated from the medium during the first twelve hours. After 24 h, most strains maintained their presence with continuous wash-out. S.enterica strains vary in their capacity to colonize the system in the presence of the ileal microbiota. Furthermore, S. enterica had no impact on the composition of the ileal microbiota or on its metabolicactivity. S. enterica cannot use the immune system to induce dysbiosis in this model, limiting the competitive mechanisms. The exposure of S. enterica strains to gastrointestinal digestion in the presence of ileal microbiota induced expression of virulence factors linked to adhesion and SPI-2 gene (ssaB), despite the absence of host tissues. This induction was greater for high virulence strains than low virulence strains.These results deepen our knowledge on the behavior of S. enterica in the human gastrointestinal tract, in order to establish prevention strategies against the pathogen and to better manage the risk linked to Salmonella.
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Comparación de los perfiles genéticos de resistencia a antimicrobianos de cepas de Salmonella enterica obtenidas de distintos hospederos en Chile

Benavides Vicencio, María Belén January 2015 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En la actualidad la detección de cepas bacterianas resistentes a múltiples agentes antimicrobianos parece ir en aumento y se atribuye principalmente a la inadecuada utilización de ellos. Estos fármacos han permitido la selección de genes de resistencia en bacterias zoonóticas, como Salmonella, los cuales pueden diseminarse a los seres humanos a través de la cadena alimentaria. Además cobra importancia el rol de las aves silvestres como reservorios y agentes diseminadores de genes de resistencia a antibióticos hacia los seres humanos y otros animales. El objetivo de esta Memoria de Título fue comparar los perfiles genéticos de resistencia antimicrobiana de cepas de S. enterica ser. Enteritidis aisladas desde aves silvestres, aves comerciales y seres humanos en Chile, y determinar su relación con el hospedero de origen de estas cepas. Se analizaron 96 cepas en total, de las cuales 33 fueron aisladas desde aves silvestres, 31 de aves comerciales y 32 de seres humanos. Se utilizó la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para determinar los perfiles de resistencia antimicrobiana. Los genes seleccionados fueron: tet(A), tet(B), tet(G) (resistencia a tetraciclinas), blaPSE-1, blaTEM, blaCMY (resistencia a β-lactámicos), aadB, aacC (resistencia a aminoglicósidos) y además se detectó la presencia de integrones clase 1. Para determinar la asociación de los perfiles genéticos de resistencia con su hospedero de origen se utilizó el programa Infostat®. De las 96 cepas analizadas en esta Memoria, se encontraron 13 perfiles genéticos de resistencia antimicrobiana diferentes, los cuales resultaron estar asociados con el hospedero de origen de las cepas. Adicionalmente, los datos obtenidos fueron analizados con la finalidad de determinar la asociación de genes de resistencia antimicrobiana con hospedero de origen de las cepas, siendo tet(A) el único gen asociado a cepas obtenidas de aves silvestres. Los resultados de esta Memoria proporcionan evidencia sobre los efectos colaterales que provoca la sobreutilización de antimicrobianos en el medio ambiente, impactando indirectamente en la fauna silvestre
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Detección de Salmonella enterica en mamíferos y aves acuáticas del Parque Zoológico Buin Zoo

Espinoza Reyes, Karen Alejandra January 2013 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Conocer la condición sanitaria de animales silvestres en cautiverio permite determinar el riesgo a enfermar al que se encuentran expuestos estos animales, pudiendo incluso producirse mortalidad en aquellos casos más extremos. Por otro lado, estos antecedentes también son necesarios para poder determinar el riesgo de infección de enfermedades zoonóticas al que se encuentra expuesta la población humana, que asiste a los recintos donde se encuentran estos animales. Esta información permite establecer las medidas sanitarias necesarias para asegurar el buen estado de salud tanto de los animales como de aquellos humanos que permanezcan en contacto directo o indirecto con ellos. El objetivo de este trabajo fue detectar Salmonella enterica en muestras de animales pertenecientes al Parque Zoológico Buin Zoo (Región Metropolitana, Chile), para lo cual se colectaron tórulas rectales desde 201 mamíferos y tórulas cloacales desde 121 aves. Las tórulas fueron cultivadas y luego sometidas a PCR del gen invA. Dentro de la clase Mammalia se muestrearon 51 animales pertenecientes al orden Carnivora, 33 al orden Primates y 117 al orden Ungulata, lográndose aislar S. enterica a partir del 10,44% de las muestras, de las cuales un 42,21% perteneció al orden Ungulata. Dentro de la clase Aves, se obtuvieron muestras a partir de 9 animales pertenecientes al orden Pelecaniformes, 5 al orden Charadriiformes y 107 al orden Anseriformes, aislándose S. enterica a partir del 0,83% de las muestras / Financiamiento: Departamento de Conservación e Investigación del Parque Zoológico Buin Zoo y Proyecto Fondecyt No. 11110398
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Resistencia a antibióticos en cepas de Salmonella enterica y su asociación con distintos hospederos en Chile

Lillo Lobos, Pilar Fernanda January 2014 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La aparición de la resistencia antimicrobiana por parte de bacterias zoonóticas es una preocupación actual en la salud pública. Salmonella enterica es un patógeno emergente que ha cobrado mayor importancia en este último tiempo y se desconoce su impacto en especies acuáticas. El objetivo de este estudio fue determinar fenotipos de resistencia a antibióticos en cepas de Salmonella enterica y su asociación con distintos hospederos en Chile. Se analizaron 111 cepas correspondientes 49 de aves acuáticas, 30 de aves comerciales y 32 humanas. Se utilizó el método de difusión en placa Kirby Bauer según las normas recomendadas por el Clinical Laboratory Standards Institute (2007) para determinar los fenotipos de resistencia. Los antibióticos utilizados fueron 10: enrofloxacino, amoxicilina - ácido clavulánico, cefotaxima, gentamicina, tetraciclina, sulfametazol - trimetoprim, ceftofiur, cefradina, ampicilina y cefradroxilo. Para analizar la asociación de los fenotipos de resistencia con su hospedero de origen se utilizó el programa Infostat versión 2010. Del total de cepas de S. enterica analizadas se encontraron 42 cepas resistentes en aves acuáticas, 16 en aves comerciales y 10 en humanos. Dentro de las cepas de aves acuáticas 33 demostraron resistencia al antimicrobiano tetraciclina. En el caso de aves comerciales y humanos los valores absolutos de resistencia no fueron significativos. En relación a la asociación de los fenotipos de resistencia con su hospedero de origen, se demostró en aves acuáticas en relación a 4 agentes antimicrobianos: Tetraciclina, amoxicilina + ácido clavulánico, ampicilina y gentamicina. De acuerdo al estudio realizado, se demuestra el efecto del uso de antimicrobianos en la fauna silvestre como es el caso de las aves acuáticas y de qué manera se ve desfavorecido el medio ambiente con los altos niveles de resistencia. Los resultados sugieren que las infecciones con Salmonella en aves acuáticas podría tener un gran impacto en la salud pública y animal. / Proyecto Fondecyt 11110398
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Role of Salmonella enterica serovar Typhimurium effectors proteins SopB and SifA in the intracellular survival and modification of the vacuolar compartment in Dictyostelium discoideum

Valenzuela Montenegro, Camila 01 1900 (has links)
Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias con Mención Microbiología. / Salmonella Typhimurium is an enteric pathogen able to infect different animal hosts, including humans. In immunocompetent humans, S. Typhimurium mainly causes gastroenteritis, a disease characterized by an inflammatory diarrhoea with massive neutrophil infiltration in the ileum and colon. The infective cycle of Salmonella starts with the ingestion of bacteria that reach the small intestine and invade epithelial cells by its apical face. After crossing the epithelial barrier, bacteria are captured by phagocytic cells of the immune system present in the sub-epithelium, such as macrophages, neutrophils and dendritic cells, being contained within a membrane bound compartment. Here, Salmonella subverts the endocytic route, avoiding the fusion of this compartment with the lysosomes and generating the Salmonella-containing vacuole (SCV). In this compartment, Salmonella is able to survive and replicate. The ability to modify this intracellular niche explains the ability of this pathogen to survive intracellularly. To carry out this process, Salmonella employs two Type Three Secretion Systems (T3SS) and an arsenal of secreted effector proteins in order to take control over the eukaryotic cell. An important aspect of Salmonella’s life cycle that has not been studied in detail is its survival in the environment, where bacteria are exposed to predation by protozoa, and specially by amoebae. These organisms are specialized phagocytes that feed on bacteria and fungi. To address this interaction, we and other groups use amoeba models to characterise the molecular processes involved in the survival of intracellular pathogens within environmental protozoa. Among these model organisms, the social amoeba Dictyostelium discoideum is amenable for molecular analyses in laboratory settings and several tools have been developed in this organism for the study of different aspects of its interaction with bacterial pathogens. Recently, our group described that S. Typhimurium is able to survive intracellularly in the social amoeba Dictyostelium discoideum, and that mutants in genes required for virulence in other infection models present survival defects in this host. Despite of this, the mechanisms that allow the intracellular survival of this pathogen in this kind of organism have not been studied in detail. This Thesis proposed the characterization at the cellular level of this interaction, with a focus on two secreted effector proteins of S. Typhimurium that are directly related to SCV generation and modification in other cell models: SopB and SifA. Our results show that these effectors are needed for intracellular survival of S. Typhimurium in D. discoideum. Furthermore, by means of a combination of microscopy and proteomic analyses we were able to characterise the protein composition of the vacuolar compartment containing Salmonella in this host. Our results show that known markers linked to this compartment in other cell types and the autophagy machinery play a role in the biogenesis of this intracellular niche in D. discoideum. / Salmonella Typhimurium es un patogeno enterico que tiene la capacidad de infectar diversos hospederos animals, incluyendo el ser humano. En individuos inmunocompetentes, S. Typhimurium provoca gastroenteriris, una enfermedad diarreica inflamatoria caracterizada por la masiva infiltracion de neutrofilos en el ileon y el colon. El ciclo infectivo de Salmonella comienza con la ingestion de las bacterias que al llegar al intestino delgado invaden las celulas epiteliales por la cara apical. Luego de cruzar la barrera epitelial, las bacterias son capturadas por las celulas fagociticas del sistema inmune que residen en el sub-epitelio, como macrofagos, neutrofilos y celulas dendriticas, quedando contenida en un compartimento membranoso. En esta etapa, Salmonella interviene la ruta endocitica, evitando la fusion de este compartimento con el lisosoma y generando la vacuola contenedora de Salmonella (Salmonella-containing vacuole: SCV). En este compartimento, Salmonella es capaz de sobrevivir y replicarse. La habilidad de modificar este nicho intracelular explica la habilidad de este patogeno de sobrevivir intracelularmente. Para esto, Salmonella utiliza dos Sistemas de Secrecion Tipo Tres (Type Three Secretion Systems: T3SS) y un arsenal de proteinas efectoras secretadas para tomar control sobre la celula eucarionte. Por otra parte, un importante aspecto del ciclo de vida de Salmonella que no ha sido estudiado en detalle es su supervivencia en el ambiente, donde las bacterias se encuentran expuestas a la depredacion por protozoos y en particular, amebas. Estos organismos son fagocitos profesionales que se alimentan de bacteria y hongos. Recientemente, nuestro grupo describio que S. Typhimurium es capaz de sobrevivir intracelularmente en la ameba social Dictyostelium discoideum y que mutantes en genes requeridos para la virulencia en numerosos modelos de infeccion tambien presentan defectos de supervivencia en este hospedero. A pesar de esto, los mecanismos que le permiten a este patogeno en este tipo de organismo no han sido estudiado en detalle. Para entender esta interaccion, nosotros y otros grupos usamos modelos de ameba a fin de caracterizar los procesos moleculares involucrados en la supervivencia de patogenos intracelulares en el interior de protozoos ambientales. Dentro de estos organismos modelo, la ameba social Dictyostelium discoideum es sencilla para el analisis molecular en condiciones de laboratorio. Por otra parte, numerosas herramientas se han desarrollado en este organismo para el estudio de diversos aspectos de su interaccion con patogenos bacterianos. Esta Tesis propuso caracterizar a nivel cellular esta interaccion, enfocandonos en dos proteinas efectoras secretadas de S. Typhimurium que estan directamente relacionadas a la formacion y modificacion de la SCV en otros modelos celulares: SopB y SifA. Nuestros resultados muestran que estos efectores son necesarios para que S. Typhimurium sobreviva intracelularmente en D. discoideum. Adicionalmente, mediante una combinacion de tecnicas de microscopia y analisis proteomicos pudimos caracterizar la composicion proteica de este compartimento vacuolar que contiene a Salmonella en este hospedero. Nuestros resultados muestran que marcadores asociados a la SCV en otras lineas celulares se encuentran en elcompartimento que se genera en D. discoideum y que la maquinaria de autofagia juega un rol importante en la biogenesis de este nicho intracelular en D. discoideum. / FONDECYT grants 1140754 y 1171844, CONICYT Doctoral Fellowship 21140615. / Enero 2020.
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Ribotipificação de sequências intergênicas de isolados de Salmonella enterica subspecie enterica provenientes de produtos avícolas do Brasil, Colombia e Estados Unidos.

Landinez, Martha Pulido January 2013 (has links)
Para avaliar a diversidade de Salmonella enterica, foram analisados os sorovares presentes em amostras de Salmonela isoladas de aves e seu ambiente do Sul do Brasil (n=155), Colômbia (n=141) e Mississippi (EUA, n=50). No total, foram examinados 346 isolados de Salmonela pela técnica de ribotipificação de sequências Intergênicas (ISR) usando PCR convencional (para bactérias vivas isoladas no Estado de Mississippi) ou nested PCR (para o DNA de Salmonelas do Brasil e da Colômbia, em cartões FTA). O sequenciamento da região intergênica do gene dkgB avalia polimorfismos de nucleotídeos simples que ocorrem em torno do gene ribossomal 5S. A concordância geral entre o esquema Kauffman-White-LeMinor (KWL) e a ISR foi de 85,2% em isolados do Brasil, e de 89,58% em isolados do Mississippi. É possível que a divergência seja devida à capacidade da ISR de detectar as misturas de sorovares numa cultura. Os sorovares de Salmonella enterica identificados nos isolados brasileiros foram: Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo e Senftenberg. Três sorovares ISR únicos foram detectados (UN0041, UN0042, UN0043). Nos isolados colombianos, foram identificados os sorovares Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen, Braenderup, Yoruba e um sorovar ISR Único (UN0048). Já no tocante aos isolados de Mississippi, foram identificados os sorovares Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg e um ISR Único (UN0094). Em geral, a ISR forneceu mais informações do que KWL sobre a ecologia de Salmonella enterica das aves comerciais. Em 73 isolados da Colômbia e 50 isolados de Mississippi, foram estabelecidas as resistências para 15 e 17 agentes antimicrobianos, respectivamente. Não foram identificados isolados pansusceptíveis. Todas as amostras analisadas foram classificadas como multirresistentes. Os resultados deste estudo mostram uma grande diversidade entre os isolados analisados, não só com respeito aos sorovares identificados em cada país, mas também sobre a sua resistência aos antimicrobianos. Os resultados desta pesquisa irão beneficiar a indústria avícola do sul do Brasil, da Colômbia e de Mississippi, porque a caracterização de cepas isoladas de aves comerciais poderá ser usada no futuro para o desenvolvimento e adaptação de programas de controle. / To assess diversity of Salmonella enterica serotypes present in poultry and their environment from Southern Brazil (n=155), Colombia (n=141) and Mississippi (EUA, n=50); 346 isolates were examined with conventional PCR (live bacteria from Mississippi) or nested PCR (Brazilian and Colombian Salmonella DNA in FTA cards) and sequencing of the dkgB-linked intergenic sequence ribotyping (ISR) region that assesses single nucleotide polymorphisms occurring around a 5S ribosomal gene. Overall agreement between Kauffman-White-LeMinor (KWL) scheme and ISR was 85.2% in Brazilian Salmonella isolates, and 89.58% in Mississippi´s isolates. It is possible that the disagreement was due to the ability of ISR to detect mixtures of serotypes in culture. Salmonella enterica serotypes identified among Brazilian isolates were Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo, and Senftenberg. Three unique ISRs were detected (UN0041, UN0042, UN0043). Regarding the Colombian isolates, serotypes Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen Braenderup, Yoruba, and One Unique ISR (UN0048) were identified and among Mississippian isolates, serotypes Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg, and one Unique ISR (UN0094). Overall, ISR provided more information than KWL about the ecology of on-farm Salmonella enterica. In 73 isolates from Colombia and 50 isolates from Mississippi, there were established the antimicrobial resistance against 15 and 17 antimicrobial agents, respectively. No pansusceptible isolate was identified. All analyzed isolates were classified as Multidrug resistant. The results of this study show a great diversity among analyzed isolates, not only in respect to the serotypes, but also about their antimicrobial resistance. The results of this research will benefit the poultry industries of Southern Brazil, Colombia and Mississippi, because the characterization of strains isolated from poultry can be used in the future to the development and adaptation of Salmonella control programs.
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Dual RNA-seq of pathogen and host / Duale RNA-Sequenzierung eines Pathogens und seines Wirts

Westermann, Alexander J. January 2014 (has links) (PDF)
The infection of a eukaryotic host cell by a bacterial pathogen is one of the most intimate examples of cross-kingdom interactions in biology. Infection processes are highly relevant from both a basic research as well as a clinical point of view. Sophisticated mechanisms have evolved in the pathogen to manipulate the host response and vice versa host cells have developed a wide range of anti-microbial defense strategies to combat bacterial invasion and clear infections. However, it is this diversity and complexity that makes infection research so challenging to technically address as common approaches have either been optimized for bacterial or eukaryotic organisms. Instead, methods are required that are able to deal with the often dramatic discrepancy between host and pathogen with respect to various cellular properties and processes. One class of cellular macromolecules that exemplify this host-pathogen heterogeneity is given by their transcriptomes: Bacterial transcripts differ from their eukaryotic counterparts in many aspects that involve both quantitative and qualitative traits. The entity of RNA transcripts present in a cell is of paramount interest as it reflects the cell’s physiological state under the given condition. Genome-wide transcriptomic techniques such as RNA-seq have therefore been used for single-organism analyses for several years, but their applicability has been limited for infection studies. The present work describes the establishment of a novel transcriptomic approach for infection biology which we have termed “Dual RNA-seq”. Using this technology, it was intended to shed light particularly on the contribution of non-protein-encoding transcripts to virulence, as these classes have mostly evaded previous infection studies due to the lack of suitable methods. The performance of Dual RNA-seq was evaluated in an in vitro infection model based on the important facultative intracellular pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium and different human cell lines. Dual RNA-seq was found to be capable of capturing all major bacterial and human transcript classes and proved reproducible. During the course of these experiments, a previously largely uncharacterized bacterial small non-coding RNA (sRNA), referred to as STnc440, was identified as one of the most strongly induced genes in intracellular Salmonella. Interestingly, while inhibition of STnc440 expression has been previously shown to cause a virulence defect in different animal models of Salmonellosis, the underlying molecular mechanisms have remained obscure. Here, classical genetics, transcriptomics and biochemical assays proposed a complex model of Salmonella gene expression control that is orchestrated by this sRNA. In particular, STnc440 was found to be involved in the regulation of multiple bacterial target mRNAs by direct base pair interaction with consequences for Salmonella virulence and implications for the host’s immune response. These findings exemplify the scope of Dual RNA-seq for the identification and characterization of novel bacterial virulence factors during host infection. / Die Infektion einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem bakteriellen Pathogen ist eines der komplexesten Beispiele einer Domänen-überschreitenden Wechselwirkung zweier Organismen. Infektionsprozesse sind in höchstem Maße relevant, sowohl in der Grundforschung als auch von einem klinischen Blickwinkel aus betrachtet. Im Laufe der Evolution entstanden komplizierte Mechanismen, die es einem Pathogen erlauben, die Wirtsantwort zu manipulieren. Umgekehrt haben potentielle Wirtszellen eine Reihe von anti-mikrobiellen Verteidigungsstrategien entwickelt, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen und letztlich zu beseitigen. Es sind jedoch genau diese Verschiedenheit und Komplexität, welche die Infektionsforschung so anspruchsvoll und technisch schwer analysierbar machen. Gängige Analysemethoden wurden zumeist entweder für bakterielle oder aber eukaryontische Organismen entwickelt. Dagegen werden Techniken benötigt, welche es erlauben, mit den mitunter extremen Unterschieden zwischen Wirt und Pathogen umzugehen, die sich in etlichen zellulären Eigenschaften und Prozessen manifestieren. Eine Klasse zellulärer Makromoleküle, die diese Heterogenität zwischen Wirt und Pathogen widerspiegelt, sind ihre jeweiligen Transkriptome: Bakterielle Transkripte unter-scheiden sich von ihren eukaryontischen Pendants in vielerlei Hinsicht, was sowohl quantitative als auch qualitative Aspekte miteinschließt. Die Gesamtheit zellulärer Transkripte ist von größter Bedeutung, da sie den physiologischen Zustand der jeweiligen Zelle unter den gegebenen Bedingungen reflektiert. Aus diesem Grund werden Genom-weite Transkriptom-techniken wie etwa die RNA-Sequenzierung seit etlichen Jahren erfolgreich angewandt, um biologische Prozesse zu untersuchen – jedoch ist deren Eignung für Infektionsstudien in starkem Maße limitiert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines neuartigen Ansatzes, „Duale RNA-Sequenzierung“ genannt, der Transkriptomstudien mit der Infektionsbiologie kompatibel macht. Mithilfe dieser Technologie wurde hier im Besonderen versucht, die Rolle nicht-proteinkodierender RNA-Moleküle für die Virulenz zu beleuchten, da die Charakterisierung dieser RNA-Klassen bisherigen Infektionsstudien weitgehend verwehrt blieb. Die Anwendbar-keit der Dualen RNA-Sequenzierung wurde innerhalb eines In-vitro-Infektionsmodells getestet, welches auf dem wichtigen, fakultativ intrazellulären Pathogen Salmonella enterica serovar Tyhimurium und verschiedenen humanen Zelllinien basiert. Die Duale RNA-Sequenzierung zeigte sich dabei in der Lage alle wesentlichen bakteriellen sowie humanen Transkriptklassen zu erfassen und erwies sich als reproduzierbar. Im Zuge dieser Experimente wurde ein Gen für eine zuvor kaum beschriebene kleine nicht-kodierende RNA (STnc440) als eines der am stärksten induzierten Gene intrazellulärer Salmonellen identifiziert. Interessanterweise hatten vorherige Studien gezeigt, dass die Inaktivierung dieses Gens zu einem Virulenzdefizit innerhalb unterschiedlicher Tiermodelle für Salmonellose führt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen blieben jedoch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden genetische, Transkriptom- sowie biochemische Analysen eingesetzt um das komplexe Regulationsnetzwerk dieser kleinen RNA erstmals näher zu beleuchten. Im Einzelnen konnte gezeigt werden, dass STnc440 die Expression mehrerer bakterieller mRNAs durch das Ausbilden zwischen-molekularer Basenpaarungen reguliert, was weitreichende Konsequenzen sowohl für die Virulenz des Pathogens als auch die Immunantwort des Wirts hat. Diese Ergebnisse veranschaulichen das Potential der Dualen RNA-Sequenzierung für das Auffinden und Charakterisieren neuer bakterieller Virulenzfaktoren während der Wirtsinfektion.

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