Die Semaphorine Sema3A und Sema3C sowie Netrin-1 und deren Rezeptoren, die Neuropiline und DCC wurden in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich ihrer Expression und auf ihre funktionellen Eigenschaften bezüglich des Auswachsens von Axonen, die die intrinsischen und afferenten hippokampalen Projektionen bilden, untersucht. Während die Expressionsmuster von Sema3A schon gut bekannt waren, wurde in der hier vorliegenden Arbeit die Expression des Rezeptors von Sema3A, Neuropilin-1 (NP-1), untersucht. NP-1 wird von Embryonaltag E17 an im entorhinalen Kortex, dem Subiculum und der hippokampalen Anlage exprimiert. Es konnte eine starke postnatale Expression von NP-1 in der CA3-Region und eine schwächere Expression in der CA1-Region, dem Gyrus dentatus und dem entorhinalen Kortex gezeigt werden. Außerdem wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster von Sema3C und Neuropilin-2 (NP-2) genauer analysiert. Etwa zum Zeitpunkt der Geburt (P0) wurde Sema3C im Gyrus dentatus und in der Cornu ammonis Region exprimiert. Der Sema3C-Rezeptor Neuropilin-2 wurde zu diesem Zeitpunkt ebenso im Gyrus dentatus und CA3-Region, schwächer auch in der CA1-Region exprimiert. Es wurde keine Expression dieser beiden Faktoren im entorhinalen Kortex detektiert. In Kokulturstudien zwischen mit Sema3A bzw. Sema3C transfizierten Zellaggregaten und Explantaten aus den hippokampalen Subregionen wurden für spezifische Explantate ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Sekretion der Semaphorine und dem Auswachsen der jeweiligen Explantate in einer drei-dimensionalen Kollagenmatrix deutlich. Sema3A besitzt repulsive Eigenschaften auf Explantate vom Gyrus dentatus, der CA1- und der CA3-Region sowie dem entorhinalen Kortex. Die Interaktion zwischen Sema3A und NP1 beeinflußt das Einwachsen bzw. die Terminierung entorhinaler Fasern in der Molekularschicht des Gyrus dentatus, indem Sema3A eine repulsive Barriere für einwachsende Fasern und Moosfasern, die in Richtung der CA3-Region auswachsen, darstellt. Sema3C besitzt repulsive Eigenschaften auf Fasern des medialen Septums und beeinflußt dadurch das Einwachsen dieser Fasern entlang der Cornu ammonis Region in den Hippokampus. Weiterhin wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster von Netrin-1 und DCC im Hippokampus sowie die funktionellen Eigenschaften von Netrin-1 untersucht. Netrin-1 wird bereits zum Zeitpunkt E17 im Neokortex exprimiert, konnte im Hippokampus jedoch erst ab dem postnatalen Entwicklungsstadium P1 detektiert werden. Während im Gyrus dentatus nur ein schwaches und im entorhinalen Kortex kein Signal gefunden werden konnte, wird Netrin-1 stark in der Cornu ammonis Region exprimiert. Der Rezeptor DCC wird dagegen schon früher in der Embryonalentwicklung, ab E15, diffus in der hippokampalen Anlage exprimiert. Ab P1 lassen sich diese Signale im Gyrus dentatus und in den CA1-CA3-Regionen unterscheiden. Von den untersuchten Explantaten der hippokampalen Region zeigte Netrin-1 nur auf die Fasern von Gyrus dentatus und CA3, welche die hippokampale Kommissur bilden, einen attraktiven Wachstumseffekt. Dies bestätigt Befunde aus Netrin-1- und DCC-defizienten Tieren, in denen die hippokampale Kommissur aufgrund des fehlenden axonalen Leitmoleküls bzw. seines Rezeptors nicht ausgebildet wird. / In this work, the semaphorins Sema3A and Sema3C as well as Netrin-1 and their receptors, the neuropilins and DCC, were investigated regarding their expression and functional properties on outgrowing axons, which are forming the intrinsic and afferent hippocampal projections. Because of the already well known expression patterns of Sema3A, this work focused on the expression of the receptor of Sema3A, NP-1. From embryonic stage E17 on, NP-1 is expressed in the entorhinal cortex, the subiculum and the hippocampal Anlage. A strong postnatal expression of NP-1 in the CA3-region could be detected, while the expression pattern in the CA1-region, the dentate gyrus and the entorhinal cortex was weaker. Additionally, the expression patterns of Sema3C and NP-2 were investigated in greater detail. At birth (P0), Sema3C was expressed in the dentate gyrus and the cornu ammonis region. The expression of its receptor NP-2 could be detected at the same timepoint P0 in the dentate gyrus and the CA3-region and, less pronounced, in the CA1-region.There could not be detected any expression of Sema3C or NP-2 in the entorhinal cortex. In functional coculture studies between with Sema3A or Sema3C transfected cell clusters and neuronal explants from subregions of the hippocampal formation, these factors were investigated for their influence on axonal outgrowth within a three-dimensional collagen gel matrix. Sema3A has repulsive properties on explants from the dentate gyrus, the CA1- and CA3- regions and the entorhinal cortex. I the resulting model, the interaction between Sema3A and NP-1 influences the ingrowth and/or the termination of entorhinal fibers into the molecular layer of the dentate gyrus by a repulsive barrier formed by Sema3A. The same barrier also acts on mossy fibers to allow them to grow only in direction of the CA3-region. Sema3C has repulsive properties on fibers from the medial septum and shapes the ingrowth of these fibers along the cornu ammonis region into the hippocampus. Additionally, the expression patterns of Netrin-1 and DCC and their functional properties in the hippocampus were investigated. Netrin-1 is already expressed in the cortex at E17, although the onset of expression in the hippocampus is at P1. In the dentate gyrus, a weak signal could be detected, but no signal was found in the entorhinal cortex. In the cornu ammonis region, however, Netrin-1 showed a strong expression signal. The Netrin-1 receptor DCC could be detected as early as E15 with a diffuse distribution in the hippocampal Anlage. From P1 on, these signals could be distinguished in the dentate gyrus and the CA1-CA3-regions. Netrin-1 showed attractive properties only on fibers from explants of the dentate gyrus and the CA3-region, which form the hippocampal commissure. These results confirm previous findings from Netrin-1 and DCC deficient animals in which the absence of the hippocampal commissure was described.

The vascular system is critical for maintaining homeostasis in all vertebrates. Structural studies of Neuropilin (Nrp), an essential angiogenic receptor, have defined its role in regulating angiogenesis, the formation of new vessels from the existing vasculature. Utilizing biochemical and biophysical tools we describe the ability of Nrp to function as a co-receptor for the VEGFR receptor tyrosine kinase. Two families of Nrp-1 ligands, Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) and Semaphorin3F (Sema3F), physically compete for binding to the Nrp-1 b1 domain, and have opposite roles. VEGF-A is a potent pro-angiogenic cytokine while Sema3F is an angiogenesis inhibitor. Using coupled structural and functional studies, we have discovered the basis for potent competitive binding of Sema3F to Nrp1 requires engagement of two distinct binding sites. These data provide a basis for understanding the rational design of novel high affinity Nrp-1 inhibitor.

Une des questions fondamentales en neurobiologie du développement est de comprendre quels sont les mécanismes responsables de la formation des circuits neuronaux. Alors que les circuits de neurones projecteurs ont fait l'objet d'études intensives, aujourd'hui encore peu de chose est connu sur les molécules et les voies de signalisation impliquées dans la croissance et la différentiation axonale des interneurones GABA. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la molécule de guidage axonal Semaphorine 3a (Sema3A) dans le développement des axones des interneurones GABA du cervelet. Pour mener à bien cette étude, j'ai développé de nouvelles approches expérimentales in vitro et in vivo. En utilisant ces nouveaux outils, j'ai montré que la SEMA3A était capable d'attirer l'axone des interneurones GABA. In vitro, la SEMA3A induit une augmentation locale de la formation de branches axonales et l'apparition précoce d'un marqueur présynaptique (GAD65). Nous avons également montré que la combinaison d'expression de SEMA3A avec une molécule d'adhésion de la famille L1CAM dans les cellules hétérologues était capable d'induire l'innervation de cette cellule de manière spécifique par les interneurones GABA du cervelet. Cette étude nous a permis de montrer que la combinaison entre une molécule de guidage axonal et une molécule d'adhésion cellulaire spécifique était suffisante pour induire des mécanismes de reconnaissance cellulaire par les interneurones GABA du cervelet. / GABAergic interneurons are fundamental component in neural processing and their specific innervation patterns are though to be the building block for physiological brain function and computing. However the molecular and cellular mechanisms that assemble inhibitory local circuits remain largely unknown. In cerebellar cortex, molecular layer GABAergic interneurons are key regulators of cerebellar signal coding and memory formation by sending specifically their axons to innervate the Purkinje cells. Here, we show that a combination of both secreted axon guidance and recognition molecules of L1CAM family is sufficient to trigger target cell recognition by molecular layer GABAergic interneuron˙s in vivo. Using BAC transgenic reporter mice for cell-type specific gene-expression profiling of secreted SEMAPHORIN molecules, we identified that SEMAPHORIN3A (SEMA3A) expression picked precisely at relevant time-point of GABAergic local circuit formati on. In vitro, in a co-culture model, we found that semaphorin3A (SEMA3A) secreted by CHO cells attracts GABAergic interneurons axons and triggers their local specific branching. In vivo, the injection of these heterologous cells expressing SEMA3A ectopically in the granule cell layer is able to disrupt the « crystal »like organization of molecular GABAergic interneurons and attracts their axons in this ectopic territory. Moreover we found that both in vitro and in vivo, the co-expression of SEMA3A and the L1CAM family recognition molécules, Neurofascin, but not their respective expression alone, are able to induced heterologous cells innervation by molecular GABAergic interneurons. These results suggest that specific combination between axon guidance molecules and L1CAM family is sufficient to specify cell type recognition in a space and timely dependent manner.

L'expansion d'une tumeur résulte d'une multiplication non contrôlée des cellules tumorales, de l'acquisition de leur capacité à migrer, ainsi que de la genèse du réseau vasculaire nécessaire à leur survie. Ces propriétés reposent en partie sur la mise en jeu de molécules impliquées dans le guidage cellulaire telles que les sémaphorines, initialement décrites pour leur implication dans le guidage axonal au cours du développement du système nerveux. Leurs fonction s'étendent actuellement au contrôle de l'angiogénèse de la migration des précurseurs nerveux ainsi que du cycle cellulaire. Les voies de signalisation intra-cellulaires des sémaphorines ne sont que partiellement connues. Les CRMP (CollapsinResponse Mediator Protein) font partie de leurs médiateurs intracytoplasmiques, décrites au cours de la rétraction du cône de croissance induit par la sémaphorine 3A (Sema3A). L'implication en pathologie tumorale de ces voies de signalisation a été découverte par l!étude de gènes tel que celui de la sémaphorine 3F (Sema3F), présents dans les régions délétées du chromosome 3 de certains types de tumeurs non neuroendocrines du poumon L'implication des CRMP a été également révélée par les syndromes neurologiques paranéoplasiques (SNP). Ces syndromes résultent d'une auto-immunisation humorale des patients contre des antigènes exprimés par la tumeur dont ils sont atteints. C'est le cas de CRMP5, protéine, identifiée dans notre laboratoire comme cible des auto-anticorps anti-CV2/ CRMP5 dans le cadre des SNP associés à des tumeurs neuroendocrines du poumon, les carcinomes à petites cellules (CPC) ainsi qu'à des thymomes. Alors que les thymomes sont des tumeurs bénignes, les CPC représentent 20% des carcinomes pulmonaires et sont, avec les carcinomes neuroendocrines à grandes cellules, les formes les plus agressives des tumeurs du poumon. Notre objectif était d'étudier l'implication physiopathologique des CRMP dans les différents types de carcinomes du poumon et dans les thymomes ainsi que dans les tumeurs du système nerveux central en relation avec la signalisation des sémaphorines. Nous avons ainsi démontré une expression exclusive de CRMP5 par les carcinomes neuroendocrines du poumon et les gliomes de haut grade par comparaison aux carcinomes non neuroendocrines et aux thymomes. CRMP5 n'est pas exprimée dans les carcinomes non neuroendocrines du poumon desquels sont dérivés les lignées H460 et H157. Ces observations ont été complétées par deux collaborations à des études portant sur les voies de signalisation des sémaphorines dans des modèles cellulaires de ces tumeurs. La première étude a montré que Sema3F, surexprimée dans la lignée H157 possède un effet anti-tumoral. La voie de signalisation de Sema3F nécessite neuropiline 2, l'inactivation de la MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) Erk 1/2 et entraîne l!inhibition de l'adhésion des intégrines !vß3, avec participation de CRMP1 et CRMP4 mais pas de CRMP5. La deuxième étude a établi que sous Sema3A la voie de signalisation d'Erk ½ est activée par le complexe de récepteur NRP1/VEGFR1 lors de la migration de précurseurs nerveux. Dans ces conditions Sema3A entraîne des modulations des expressions des CRMP2, CRMP4 et CRMP5 suggérant leur implication. Ainsi, ce travail montre que l!activation de certaines voies de signalisation des sémaphorines sont spécifiques des types histopathologiques et des grades des tumeurs. Ces voies de signalisations sont médiées par des complexes de récepteurs précis et mettent souvent en jeu les CRMP / Tumour growth is a consequence of uncontrolled cell proliferation, cell migration and angiogenesis. These functions are partly controlled by molecules involved in cellular guidance. Among these molecules, the semaphorins, previously described in axonal guidance during development, interestingly control cell migration, angiogenesis, apoptosis and proliferation. Signalling pathways of Semaphorins are only partially known. CRMP (Collapsin Response Mediator Protein) are involved in the signalling semaphoring pathway, precisely as mediator of Sema3A induced growth cone collapse. Implication of these signalling pathways in tumour growth was initially discovered with Sema3F localised in frequently deleted regions of the third chromosome found in non neuroendocrine lung carcinoma. CRMP involvement was also discovered in neurological paraneoplastic syndromes (NPS). These syndromes result of an auto-immunisation against tumour antigens present in some patients. CRMP5 was identified by our laboratory as a target of anti-CV2/CRMP5 auto-antibodies seen in some NPS associated with small cell lung carcinoma (SCLC) and thymoma. While thymoma are benign tumours, SCLC account for 20% of all lung tumour pathological subtypes and represent with large cell neuroendocrine carcinoma the most clinically aggressive subtypes of lung tumours. Our aim was to study the physiopathological role of CRMP among the different subtypes of lung carcinoma, thymoma and central nervous system tumours and their relationship with semaphorin signalling pathways. We showed a specific diffuse expression of CRMP5 by high grade neuroendocrine carcinoma and high grade glioma tumour cells. CRMP5 is neither expressed by non neuroendocrine lung carcinoma nor H460 or H157 derived cell lines, nor thymoma. Additionally, 2 collaborative studies were undertaken, focusing on semaphorin cell signalling in tumour derived cell lines. The first study showed an anti tumour effect of Sema3F over-expressed in H157 cell line mediated by neuropilin 2, CRMP2 and CRMP4 but not by CRMP5. It showed that Sema3F stimulation led to the inactivation of Erk1/2 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) and inhibition of !vß3 integrin mediated adhesion. The second study showed that Sema3A induced DEV cells migration was mediated by neuropilin1/VEGFR1 receptor complex and activated Erk1/2 pathway. CRMP2, CRMP4 and CRMP5 expression changes suggested their involvement in that pathway. Thus, these data show that some semaphorin pathways activation were specific of tumour pathological subtype and grade. These signalling pathways were precisely mediated by specific receptor complexes and different CRMPs isoforms

Many signaling pathways have been shown to be involved in the formation of the vascular system. Among them are the endothelial specific receptor families such as VEGF, Ang/Tie, as well as other signaling pathways such as semaphorins, which are also involved, in axonal guidance. It is known that the interaction between receptor tyrosine kinase, Tie2, VE-Cadherin, and VE-PTP mediate endothelial cell quiescence and adhesion. However, the structural basis of these interactions is not well understood. The aim of our study is to characterize the binding interactions between these players. Another important part of our study is describing the cross-talk between vasculature and nervous system by characterizing the Neuropilin/Plexin/Semaphorin system. VE-Cadherin along with neuropilins plays an essential role by directing VEGF signals to the appropriate location and coordinating the activation of downstream molecules. We characterize the interaction between Tie2, VE-PTP and VE-Cadherin by (FRET)-based proximity assay, fluorescence lifetime imaging, and co-immunoprecipitation assays. Our data showed a consistent localization of the protein and FRET signal for Tie2 and VE-PTP prior to ligand recognition. We showed the association between Tie2 and VE-Cadherin complex by co-immunoprecipatation. However, our FRET data was not consistent. The examination of VE-PTP and VE-Cadherin for association and localization of the protein showed a very unique, mutually exclusive localization of the protein. Our study of Neuropilin/Plexin/Semaphorin system showed changes in the protein localization, FRET signal and morphology upon stimulation of HEK293 cells expressing Nrp/plexin with Sema3D. In this system VE-Cadherin along with neuropilins plays an essential role by directing VEGF signals to the appropriate location and coordinating the activation of downstream molecules. The characterization of extracellular binding between Tie2, VE-PTP, and VE-Cadherin, will help to better understand the molecular mechanisms of normal and tumor angiogenesis to develop new anti-angiogeneic therapies.

La mise en place des projections axonales est une étape clé du développement des circuits de la moelle épinière qui contrôle les fonctions motrices de l’individu. Il s’agit d’un processus complexe impliquant des mécanismes de spécification des neurones moteurs et des signalisations multiples assurant le guidage spécifique de chaque axone jusqu’à sa cible d’innervation. Les Sémaphorines de classe 3 (Sema3) sont des molécules secrétées dans l’environnement qui participent notamment au guidage des axones moteurs de la moelle épinière. De manière surprenante, les motoneurones expriment également eux-mêmes des Sema3. Mon équipe a déjà montré que l’expression intrinsèque de Sema3A par les motoneurones module leur sensibilité au Sema3A de l’environnement. Ce processus s’effectue par une régulation du niveau de son récepteur à la surface du cône de croissance, la structure terminale de l’axone responsable de la perception des signaux de guidage extracellulaires (Moret et al., 2007). Quelle est la portée de ce nouveau mécanisme modulatoire et peut-il être généralisé à d’autres membres de la famille des Sema3 exprimés dans les motoneurones ? Mon travail de thèse a permis de mettre en évidence ce rôle modulatoire d’un autre membre de la famille Sema3 : Sema3C, dons l’expression est restreinte à une sous-population de motoneurones, en plus d’une expression environnementale. Par des expériences de gain et de perte de fonction dans l’embryon de poulet, nous avons montré que l’expression motoneuronale de Sema3C module de manière différentielle ses deux récepteurs du niveau de récepteur entraînent une modulation de réponse à Sema3C mais aussi à Sema3A et Sema3F, qui se fixent respectivement sur Nrp1 et Nrp2. De plus, nous avons étudié la portée de ce mécanisme de modulation dans l’innervation des membres de l’embryon de poulet, ce modèle permettant l’étude des projections motoneuronales dans un environnement riche en Sema3. Ainsi, l’analyse in vivo des embryons de poulet pour lesquels l’expression intrinsèque de Sema3C dans les motoneurones a été manipulée a permis de montrer que la modulation de réponse aux Sema 3 de l’environnement contribue au positionnement stéréotypé des projection motrices dans le membre antérieur. Ce travail permet donc de proposer que l’expression d’un code de Sema 3 par les motoneurones confère aux différentes sous-populations une sensibilité spécifique aux gradients de Sema 3 présents dans l’environnement et assure ainsi une trajectoire stéréotypée des axones moteurs jusque dans leur territoire cible. / During spinal circuit’s development, the implementation of axonal projections is a key step as it ensures the integrity of motor functions. This complex process implicates several mechanisms such as motoneuton specification and various signaling cascades in order to guide specifically each axon toward its innervation target. Class 3 Semaphorins (Sema3s) are chemotactic cues, secreted in the environment, and contributing to the guidance of spinal motor axons. Surprisingly, these Sema3s are also expressed by motoneurons themselves. Previous work in our team showed that intrinsic expression of Sema 3A. This process arises from the regulation of its receptor availability at the growth cone surface, the terminal end of the axon that enables sensing of extracellular signals (Moret et al., 2007). But in what extent can we generalize this mechanism to other members of the Sema3 family, and what impact could it have, in vivo, during development? My PhD work revealed the modulatory role of another Sema3, Sema3C, expressed in a restricted motoneuronal subpopulation as well as in the environment. By again and loss of function experiments in the chick embryo, we showed that motoneuronal expression of Sema3C modulates differentially its two Neuropilin receptor level, Nrp1 and, Nrp2, at the growth cone surface. These variations of receptors’ availability lead to a response modulation to extrinsic Sema3, but also to Sema3A and Sema3F, that bind to Nrp1 and Nrp2, respectively. Moreover, we analyzed the role of such modulation mechanisms during limb innervation in the chick embryo. Indeed, this model enables the study of motor axon growth in a complex Semaphorin environment. In vivo analysis of chick embryos after intrinsic Sema3C manipulations revealed that response modulation to environmental Sema3s takes part in the stereotyped positioning motor axon projections in the forelimb. Hence, this Study suggest a model in which the expression of a Semaphorin code by motoneurons enables specific subpopulations to modulate their sensitivity Sema3 gradients expressed in their environment, thus contributing to the stereotyped trajectories of motor axon projections towards their final target.

Les Sémaphorines constituent une grande famille de protéines sécrétées et membranaires, qui ont été initialement impliquées dans le guidage axonal au cours du développement du système nerveux, mais qui jouent aussi un rôle important dans la cancérogenèse. Ainsi, les Sémaphorines agissent via leurs récepteurs, qui font partie de la famille des Neuropilines et des Plexines, pour réguler des fonctions multiples qui contribuent au développement des cancers et à la progression métastatique, telles que l'adhésion cellulaire, la motilité, la survie, l'angiogenèse et la réponse immunitaire. Mon travail de thèse a visé à mieux comprendre le rôle de la signalisation induite par la Sémaphorine-3E (Sema3E) et son récepteur Plexine-D1 dans le cancer du sein. Il a été proposé récemment, que la signalisation autocrine induite par le couple Sema3E/Pleixne-D1 dans les cellules tumorales, favorise l’apparition de métastases via l’augmentation de leurs capacités de migration et d’intravasation/extravasation.Dans ce travail de recherche, nous avons trouvé qu’une nouvelle signalisation autocrine induite par Sema3E/Plexine-D1 régit à la fois la tumorigenèse et la formation de métastases. Ainsi, la sécrétion de Sema3E par les cellules tumorales favorise leur survie grâce à l’inhibition d’une voie de mort induite par le récepteur à dépendance Plexine-D1. Bloquer l’interaction entre Sema3E et son récepteur Plexine-D1, via l’utilisation d’un ligand TRAP dans des modèles murins de cancer du sein, permet de tuer spécifiquement les cellules tumorales et exerce une action anti-tumorale et anti-métastatique. Des données préliminaires sur la voie de mort induite par le récepteur Plexine-D1, suggèrent un rôle important du clivage de son domaine intracellulaire par les Caspases et/ou une translocation nucléaire. Ensemble, ces résultats indiquent que l’expression de Sema3E dans les cancers du sein chez la femme, permet un avantage sélectif pour la survie des cellules tumorales. Bloquer l’interaction entre Sema3E/Plexine-D1 apparaît donc comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour traiter ces cancers. De plus, ces données permettent une nouvelle approche dans l’étude des fonctions du couple Sema3E/Plexine-D1 dans d’autres contextes physiologiques et pathologiques. / The Semaphorins constitute a large family of secreted and membrane-bound proteins, which have initially been implicated in axon guidance during development of the nervous system, but also have an important role in cancer. Semaphorins signal through Neuropilin and Plexin receptors to regulate multiple functions contributing to cancer development and progression, including cell adhesion and motility, cell survival, angiogenesis and immune response. My work is aimed at better understanding the role of the secreted glycoprotein Semaphorin 3E (Sema3E) and its binding receptor PlexinD1 in breast cancer. It has been recently proposed that Sema3E/PlexinD1 autocrine signaling in tumor cells promotes metastasis by enhancing cancer cell migration and intravasation/extravasion steps. Here we found another mechanism by which Sema3E/PlexinD1 autocrine signaling regulates both tumorigenesis and metastasis. We show that release of Sema3E by tumor cells promoted their survival through inhibition of an endogenous cell death pathway triggered by the unbound PlexinD1 “dependence receptor”. Interrupting Sema3E/PlexinD1 binding using a ligand-TRAP for PlexinD1 receptor specifically increased tumor cell death and exerted anti-tumoral and anti-metastatic activities in animal models of breast cancers. Preliminary investigations of the underlying cell death pathway suggested a crucial role of PlexinD1 intracellular domain via its cleavage by caspases or its possible translocation to the nucleus. Together, the results indicate that up-regulation of Sema3E in human breast cancers provides a selective advantage for tumor cell survival and that antagonizing Sema3E binding to PlexinD1 may represent a promising therapeutic strategy. Moreover, these data may provide new insight into the functions of Sema3E/PlexinD1 in other physiological and pathological contexts.

Les TNE-GEPs constituent un groupe de tumeurs hétérogènes pour lesquelles il convient d’élargir les approches thérapeutiques. Les thérapies ciblées, particulièrement l’inhibition de la voie mTOR par l’évérolimus, sont la référence pour les TNE-GEPs pancréatiques. Néanmoins, le bénéfice thérapeutique de l’évérolimus n’a pas été évalué dans le sous-groupe des carcinomes neuroendocrines GEPs peu différenciés (pdCNE-GEPs). A travers un modèle préclinique in vivo, nous montrons que l’inhibition de mTOR pourrait constituer une option thérapeutique pour les pdCNEGEPs. Ensuite, une étude protéomique a mis en évidence de nouveaux facteurs impliqués dans la progression de TNE-GEPs. Certaines protéines identifiées présentent un rôle dans la régulation du cytosquelette. Parmi celles-ci, CRMP2 est un acteur clé de la voie de signalisation des sémaphorines de classe 3 (sema3). Un profil d’expression de ces sema3 montre que l’expression de la sema3F est diminuée dans les TNE-GEPs. La ré-expression de ce facteur dans des modèles cellulaires de TNEGEPs montre que la sema3F induit une baisse de la survie et de la prolifération. In vivo, la sema3F permet de ralentir le développement tumoral. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle de la voie de signalisation de la sema3F dans la progression des TNE-GEPs / GEP-NETs are heterogeneous tumors for which therapeutic options are limited and must therefore be enlarged. Targeted therapies, and mainly everolimus-directed mTOR inhibition, constitute standard treatments for GEP-NETs of pancreatic origin. Nevertheless, the therapeutic benefits of everolimus have not been evaluated in the poorly-differentiated GEP neuroendocrine carcinomas (pdGEP-NECs) subgroup. By using a preclinical in vivo model, we demonstrated that mTOR inhibition could be considered as a therapeutic option for pdGEP-NECs. Then, a proteomic study highlighted novel proteins involved in GEP-NETs progression with all identified factors displaying function in cytoskeleton regulation. Among them, CRMP2 is a key member of class 3 semaphorin (sema3) signaling. An expression profile of sema3 revealed that sema3F expression was decreased in GEP-NETs. The re-expression of this protein in TNE-GEPs cellular models showed that sema3F is responsible of the reduction of cell viability and proliferation. In vivo, sema3F hampered tumor development. Further studies are thus needed to better understand the role of the sema3F signaling pathway in the progression of GEP-NETs

INTRODUCTION: Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) is an aggressive form of cancer with a high mortality rate, primarily due to lack of effective treatment options. Current therapeutic approaches are limited to surgical resection of the pancreas during early stages of the disease and to the use of non-specific chemotherapeutic drugs such as gemcitabine, neither of which has successfully improved the 5-year survival rate of PDAC. Both the lack of effective treatments and the high mortality of the disease call for the urgent need to develop new therapeutic options. OBJECTIVES: This thesis project focuses on an endogenous inhibitor of the neuropilin 2 receptor (NRP2) called semaphorin 3F (SEMA3F) and its use as a potential new drug in the fight against pancreatic cancer. By binding the transmembrane receptor neuropilin 2 (NRP2), SEMA3F can inhibit angiogenesis and cellular proliferation. Interestingly, given its role as a guidance molecule, it is also a potent mediator of cellular repulsion. All three of these effects will be analyzed in the context of this study. METHODS: Syngeneic pancreatic cancer cells were injected orthotopically in two separate groups of mice. One group involved the use of transgenic Nrp2-/- mice, and served as a way to analyze the absence of the receptor on the vasculature and how that affects the growth of the primary tumor and the formation of metastases in the liver. The other group received intravenous injections of SEMA3F-expressing and control adenovirus, and served to explore the effect of SEMA3F as a potential therapy against the growth of the primary tumor in the pancreas and distant metastases in the liver. RESULTS: We observed a decrease in pancreatic tumor and metastatic growth in the absence of Nrp2 in our transgenic mouse model compared to the WT control. Mice injected with SEMA3F-expressing adenovirus also showed a decrease in primary tumor growth as well as a reduction in the formation of metastases in the liver compared to the control. CONCLUSION: Nrp2 mediates angiogenesis in pancreatic cancer, which facilitates the growth of the primary tumor as well as the formation of metastases. Our results indicate that the anti-angiogenic, anti-proliferative and repulsive actions of SEMA3F could be used to develop an effective treatment option for PDACpancreatic ductal adenocarcinoma. / 2020-07-24T00:00:00Z

During embryonic development, cells respond to extracellular signals to establish proper tissue organization. Semaphorins (Semas) are a large class of secreted and transmembrane proteins that signal through Plexin (Plxn) receptors to guide migrating cells to their correct position and thus play critical roles in the development of various tissues including the nervous and cardiovascular systems. We have previously shown that Sema6A-PlxnA2 signaling is essential for visual system development, as decreasing endogenous Sema6A or PlxnA2 in zebrafish results in decreased cohesion of the early eye field, impaired retinal lamination, and smaller eye size. However, the molecular mechanisms governing these phenotypes are unknown. This dissertation describes the elucidation of functionally-relevant mechanisms of Sema6A-PlxnA signaling during eye development using biochemical and proteomic approaches in cell culture systems and the zebrafish as an in vivo vertebrate model of eye development. We first describe our investigations on the receptor-proximal mechanisms of Sema6A-PlxnA signaling. The Src-family tyrosine kinase Fyn was known to bind to and phosphorylate PlxnA receptors. However, the specific sites of phosphorylation and their function were unknown. Using mass spectrometry, we identified highly-conserved, Fyn-induced PlxnA tyrosine phosphorylation sites. Mutation of these tyrosines to phenylalanine nearly eliminated Fyn-dependent PlxnA phosphorylation. Furthermore, unlike mRNA encoding wild type human PlxnA2, mRNA encoding the tyrosine-to-phenylalanine mutant PlxnA2 could not rescue the smaller eye size phenotype caused by endogenous PlxnA2 knockdown in zebrafish. This suggests that Fyn-dependent PlxnA2 phosphorylation is critical for proper vertebrate eye development. Next, we report the discovery and functional characterization of a naturally-released soluble ectodomain of Sema6A (sSema6A). We show that sSema6A production is increased by PKC activity. The identification of several PKC-dependent phosphorylation sites in the intracellular region of Sema6A suggests a mechanism for PKC-dependent release of sSema6A. Importantly, we show that sSema6A is functional as it promotes the cohesion of zebrafish early eye field explants. This is the first report of a soluble ectodomain of the Sema6 class and suggests that Sema6A can have regulated, long-range signaling capacity in addition to its canonical contact-mediated functions. Finally, we present our findings characterizing the role in eye development of CRMP2, a downstream effector of Sema-Plxn signaling. CRMP2 is known to be critical for lamination of the cerebral cortex, leading us to hypothesize that CRMP2 could also be involved in the lamination of the retina. Using morpholino-based knockdown of endogenous zebrafish Crmp2, we show that Crmp2 has a critical function in visual system development. Crmp2 knockdown results in smaller eye size, impaired retinal lamination and a weakened optic tract. Together, this dissertation describes important novel Sema6A-PlxnA signaling mechanisms and places them in the context of vertebrate eye development.