Submitted by Cleber Casali (clebercasali@ufv.br) on 2017-06-28T19:25:06Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 353495 bytes, checksum: 17694f299e7d537ab4080333c4418278 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T19:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 353495 bytes, checksum: 17694f299e7d537ab4080333c4418278 (MD5) Previous issue date: 2001-10-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil / O objetivo deste trabalho foi estudar a qualidade seminal in vitro analisada por meio de testes complementares e sua relação com os aspectos físicos, morfológicos e bioquímicos do sêmen de bodes da raça Parda Alpina. O 1º experimento foi realizado durante os meses de janeiro e fevereiro de 2001 e foram utilizados quatro reprodutores adultos criados em condições intensivas. As coletas de sêmen foram realizadas empregando-se o método de vagina artificial. Em todas as coletas além do exame físico e morfológico do sêmen foi realizado o teste hipoosmótico e incubação isoosmótica como grupo controle. Os bodes apresentaram diferença nos aspectos físicos e morfológicos, no teste hipoosmótico e teste de termorresistência (p < 0,05). Os resultados dos testes de termorresistência lento tiveram correlação alta com o percentual de espermatozóides reativos ao meio hipoosmótico (0,67). O 2º experimento foi realizado durante final do mês de fevereiro até inicio do mês de abril de 2001 no mesmo local. Foram realizadas as coletas de quatro reprodutores adultos que se encontravam em regime de monta controlada. Em todas as coletas além do exame físico e morfológico do sêmen foram realizados os testes hipoosmóticos, isoosmóticos e a determinação da concentração protéica total do plasma seminal. Foi detectada diferença entre os bodes na concentração protéica total do plasma seminal (p < 0,05), mas não foram detectadas diferenças no teste hipoosmótico e coberturas por prenhez (p > 0,05). De acordo com os dados obtidos neste estudo pode-se concluir que o teste hipoosmótico pode ser uma importante ferramenta para a avaliação de sêmen caprino e a concentração protéica total do plasma seminal não pode ser utilizada como parâmetro para predizer a qualidade seminal de bodes da raça Parda Alpina. / The objective of this work was to study the in vitro seminal quality analyzed by complemental tests and compare them with physical, morphologic and biochemical aspects of the semen of male goats of the Alpine Brown breed. Two experiments were accomplished in the Caprinocultura Section of UFV of the Department of Zootecnia of the Federal University of Viçosa in the city of Viçosa. The first experiment was done during the months of January and February of 2001 and four adult male goat of the Alpine Brown breed were used in intensive conditions. The semen was collected three times a week for all male goats, by artificial vagina method. Physical and morphological analysis of the semen were accomplished by test hipoosmótico and isoosmotic’s incubation as control group. The male goats presented difference in the physical and morphologic aspects, in the hyposmotic test and term-resistance test (p < 0,05). Results of the slow term-resistance tests and hyposmotic test were highly correlated (0,67). The second experiment was done in February and April of 2001 in the same place. Samples were collected twice a week from 4 adult male goats of the Alpine Brown breed that were in breeding season. All semen samples besides the physical and morphological analysis, the hypoosmotic test, the isoosmotic’s incubation and the protein concentration of the seminal plasm were done. Difference was detected among male goats in the total protein concentration of the seminal plasm (p < 0,05), but differences were not detected in the hipoosmótico test (p > 0,05) and gestation rate (p < 0,05). It was concluded that the hypoosmotic test can be an important tool for the evaluation of goat semen and the protein concentration of the seminal plasm cannot be used as a parameter to predict the seminal quality of male goats of the Alpine Brown breed.

Velho, Ana Luiza Malhado Cazaux de Souza. Estratégias para o estudo de marcadores moleculares da fertilidade em modelos animais: perfil metabolômico do plasma seminal em touros e expressão da integrina subunidade beta 5 no espermatozoide, oócito e embrião bovino. 2017. 107 f. Tese (Tese em Zootecnia) – Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Francisca Gomes (francisbeserra@yahoo.com.br) on 2017-08-14T13:56:09Z No. of bitstreams: 1 2017_Tese_ almcsvelho.pdf: 2322234 bytes, checksum: 1d6b25f3dfd84db9848f1c12ca33f383 (MD5) / Approved for entry into archive by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2017-08-14T14:21:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_Tese_ almcsvelho.pdf: 2322234 bytes, checksum: 1d6b25f3dfd84db9848f1c12ca33f383 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T14:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_Tese_ almcsvelho.pdf: 2322234 bytes, checksum: 1d6b25f3dfd84db9848f1c12ca33f383 (MD5) Previous issue date: 2017 / Metabolites and proteins including integrins are important in the reproductive physiology of animals and humans. However, seminal plasma metabolites that are associated with bull fertility are still unknown and the possible roles of the integrin subunit beta 5 (ITGβ5) in fertilization and embryonic development of bovine are not yet known. Therefore, the objectives of the present study were (1) to determine comprehensive metabolome of seminal plasma from Holstein bulls with differing fertility scores, and (2) to ascertain potential metabolites as biomarkers associated with bull fertility, (3) to evaluate expression of ITGβ5 in sperm, oocytes and early bovine embryos, and (4) to ascertain the evolutionary conservation of ITGβ5. In the study 1, chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was employed to determine seminal plasma metabolome from 16 Holstein bulls with two fertility scores. Soon after, data were evaluated using multivariate and univariate analyses. Bioinformatics analyzes were performed in order to identify metabolic pathways associated with bull’s seminal plasma metabolites. Our results showed that 63 metabolites were identified in bull seminal plasma. Fructose was the most abundant metabolite detected followed by citric acid, lactic acid, urea, and phosphoric acid. Androstenedione, 4-ketoglucose, D-xylofuranose, 2-oxoglutaric acid and erythronic acid were the least predominant metabolites found in bull’s seminal fluid. PLS-DA showed a distinct separation between high and low fertility bulls as regard to scores plot. Metabolites with the greatest VIP score (VIP > 2) were 2-oxoglutaric acid and fructose. Heat-map analysis based on VIP score and univariate analysis indicated that 2-oxoglutaric acid was less (P = 0.02) and fructose was significantly greater (P = 0.02) in high-fertility bulls as compared to low-fertility bulls. To the best of our knowledge the current study is the first to identify the comprehensive metabolomic profiling of bull seminal plasma with differing fertility score and to present the potential of metabolites such as 2-oxoglutaric acid and fructose as biomarkers of bull fertility using GC-MS. In the study 2, expression levels of ITGβ5 protein in bull sperm were evaluated by western blotting. Real time-qPCR was carried out to evaluate the expression levels of ITGβ5 transcripts in oocytes and embryos from bovine species. In addition, bioinformatic tools were performed to determine to evolutionary conservation of ITGβ5 across species. Western blotting results showed the presence of ITGβ5 on bull spermatozoa. Moreover, RT-qPCR results demonstrated that ITGβ5 is present in bovine oocytes and that ITGβ5 levels were significantly higher in 2-cell embryos and 8-16 cell embryos. Bioinformatics analyses showed that ITGβ5 is conserved across species. Therefore, our results showed the presence of ITGβ5 in spermatozoa as well as oocytes and embryos in early stages of development, suggesting an important role of ITGβ5 upon fecundation and early embryo development in the bovine species. / Os metabólitos e as proteínas, incluindo as integrinas, são importantes na fisiologia reprodutiva de animais e seres humanos. Entretanto, ainda são desconhecidos os metabólitos do plasma seminal que estão associados com a fertilidade de touros e ainda não se sabe os possíveis papéis da integrina subunidade beta 5 (ITGβ5) na fecundação e no desenvolvimento embrionário de bovinos. Assim sendo, os objetivos do presente trabalho foram: (1) determinar o metaboloma do plasma seminal de touros com diferentes escores de fertilidades, (2) identificar metabólitos que demonstram ser potenciais marcadores de fertilidade em touros, (3) avaliar a expressão da ITGβ5 em espermatozoides, oócitos e embriões bovinos em fases iniciais de desenvolvimento e, (4) verificar a conservação evolutiva da ITGβ5 por meio de ferramentas de bioinformática. No estudo 1 foi utilizada a técnica de cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas (CG-EM) para determinar o metaboloma do plasma seminal de 16 touros com alta e baixa fertilidade. Em seguida, os dados foram submetidos a análise estatística multivariada e univariada. A partir destes resultados, análises de bioinformática foram realizadas a fim de identificar as vias metabólicas associadas com o metaboloma do plasma seminal desses touros. Sessenta e três metabólitos foram identificados no plasma seminal de touros com diferentes escores de fertilidade. A frutose foi detectada como o metabólito mais abundante, seguido pelo ácido cítrico, ácido lático, ureia e ácido fosfórico. Já androstenediona, 4-cetoglicose, D-xilofuranose, ácido 2-oxoglutárico e o ácido eritrônico foram os metabólitos menos abundantes do fluído seminal de touros. A Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA) revelou uma separação distinta entre os touros de alta e de baixa fertilidade. Os metabólitos com as maiores pontuações de Importância da Variável na Projeção (VIP > 2) foram o ácido 2-oxoglutárico e a frutose. A análise do mapa de calor (heatmap), com base na pontuação de VIP, e as análises univariadas indicaram que o ácido 2-oxoglutárico foi significativamente menor (P = 0,02) e a frutose foi significativamente maior (P = 0,02) em touros de alta fertilidade comparados aos touros de baixa fertilidade. O presente estudo foi o primeiro a identificar o perfil metabolômico do plasma seminal de touros empregando a CG-EM e o primeiro a mostrar o ácido 2-oxoglutárico e a frutose como potenciais biomarcadores de fertilidade em touros. No estudo 2, os níveis de expressão da proteína ITGβ5 em espermatozoide de touros foi avaliada pela técnica de western blotting. A reação de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) foi empregada para avaliar os níveis de expressão de transcritos da ITGβ5 em oócitos e embriões bovinos. Além disso, ferramentas de bioinformática foram utilizadas com o intuito de determinar a conservação evolutiva da proteína ITGβ5 entre várias espécies. Os resultados do western blotting confirmaram a presença da proteína ITGβ5 em espermatozoides de touros e, com base nas análises de RT-qPCR, foi observado que a ITGβ5 está presente nos óocitos e que os níveis dela são significativamente mais elevados nos embriões bovinos de 2 células, seguidos pelos embriões de 8-16 células. As análises de bioinformática mostraram que a ITGβ5 é conservada em várias espécies. Desta forma, nossos resultados demonstram a presença da ITGβ5 em espermatozoides, bem como em oócitos e embriões bovinos em estágios iniciais se desenvolvimento, sugerindo um importante papel da ITGβ5 na fecundação e no desenvolvimento embrionário inicial desta espécie.

BRITO, B. G. M. Viabilidade do sêmen caprino conservado em três diferentes diluidores: efeito da concentração inicial de frutose no plasma seminal. 2008. 60 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2014-12-01T20:16:35Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_bgmbrito.pdf: 324960 bytes, checksum: 65fbf714d549565ddc829f472ca5426a (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-20T23:31:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_bgmbrito.pdf: 324960 bytes, checksum: 65fbf714d549565ddc829f472ca5426a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-20T23:31:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_bgmbrito.pdf: 324960 bytes, checksum: 65fbf714d549565ddc829f472ca5426a (MD5) Previous issue date: 2008 / One of the main objectives of the artificial insemination program in goats is to produce the highest number of descendants of genetically superior animals with the purpose to improve the animal production. Thus, it is necessary to dominate correct techniques of dilution and semen storage in this specie. In this work three different extenders had been tested: citrate-egg yolk (CE), TRIS-egg yolk (TE) and industrialized coconut water (ICW) and two groups of animals: with high initial level of fructose (group I) and with low initial level of fructose (group II) in the seminal plasma. The semen was stored until 48h at 5oC and evaluated in times 0 (fresh), 2, 24 and 48h, where a sample of the conserved semen was submitted to the term-resistance test (TTR) that consists of incubate the sample at 38oC for 2h. During the incubation it had been verified the parameters of Motility (MOT) and vigor (VIG), in times 5, 60 and 120 minutes and to the end was calculated the tax of degradation of the motility (TDM) and semen slides had been carried through for verification of the possible morphologic alterations. It had a significant fall in the parameters analyzed in elapsing of the time of storage, independent of the used extender (P<0,05). However, extender ICW presented inferior resulted than the others. The effect of the group was observed only in the ICW,showing that this extender did not supply the energy necessities of the spermatozoa whose initial concentration of fructose in the plasma was low. CE and TE worked similarly in the two groups. Significant difference in the activity of phospholipase A2 between the groups was found (P<05), in way that a bigger activity was observed in group II. In conclusion, independent of the used extender, the seminal parameters tend to fall as draw out the conservation time. Moreover, the initial concentration of fructose did not intervene with the sperm quality when extenders CE and TE had been used, however, when the levels of this component in the seminal plasma had been superior to 740mg/dL, occurred an increase in lifetime of the spermatozoa conserved at 5oC, when ICW was used. It suggests that sperm low action also can be due to a higher activity of PLA2, however more studies are necessary, with a large number of animals to elucidate this hypothesis / Um dos principais objetivos de um programa de inseminação artificial em caprinos é produzir o maior número de descendentes de animais geneticamente superiores com a finalidade de melhorar a produção animal. Para tanto é necessário que se dominem técnicas de diluição e de armazenamento de sêmen nesta espécie. Neste trabalho foram testados três diferentes diluidores, citrato-gema (CG), TRIS-gema (TG) e água de coco industrializada (ACI) e dois grupos de animais, com alto nível inicial de frutose (grupo I) e com baixo nível inicial de frutose (grupo II) no plasma seminal. O sêmen foi armazenado por até 48h a 5oC e avaliado nos tempos 0 (fresco), 2, 24 e 48h, onde uma amostra do sêmen conservado foi submetida ao teste de termo-resistência (TTR) a 38oC por 2h. Durante a incubação foram verificados os parâmetros de motilidade (MOT) e vigor (VIG), nos tempos 5, 60 e 120 minutos e ao final foi calculada a taxa de degradação da motilidade (TDM). Esfregaços de sêmen foram realizados para verificação das possíveis alterações morfológicas. Houve uma queda significativa nos parâmetros analisados no decorrer do tempo de armazenamento, independente do diluidor utilizado (P<0,05). Contudo, o diluidor ACI apresentou resultados inferiores aos dos demais. O efeito do grupo foi observado apenas no ACI, mostrando que este diluidor não conseguiu suprir as necessidades energéticas dos espermatozóides cuja concentração inicial de frutose no plasma estava baixa. Os diluidores CG e TG comportaram-se de forma semelhante nos dois grupos. Foi encontrada diferença significativa na atividade da fosfolipase A2 (PLA2) entre os grupos (P<0,05), sendo que uma atividade superior foi observada no grupo II. Concluiu-se que, independente do diluidor utilizado, os parâmetros seminais tendem a cair conforme o tempo de conservação é prolongado. Além disso, a concentração inicial de frutose não interferiu na qualidade espermática quando os diluidores CG e TG foram utilizados, todavia, quando os níveis deste componente no plasma seminal foram superiores a 740 mg/dL ocorreu um aumento na sobrevida dos espermatozóides conservados a 5 oC, quando se utilizou ACI. Sugere-se que o baixo desempenho espermático também possa ser devido a uma maior atividade de PLA2, contudo mais estudos, contendo um maior número de animais, são necessários para elucidar esta hipótese

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004Bitstream added on 2014-06-13T20:06:45Z : No. of bitstreams: 1 dellaquajr_ja_dr_botfmvz.pdf: 670093 bytes, checksum: e66aa1acd7f261d1156564e3e811bc30 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Com o intuito de verificar a ação do acetato de prednisolona e do plasma seminal sobre a resposta inflamatória uterina de éguas inseminadas com sêmen congelado, desenvolveu-se os seguintes procedimentos: inicialmente 36 éguas foram aleatoriamente divididas em 6 grupos experimentais: G1 grupo controle, éguas não inseminadas; G2 éguas inseminadas com 800 x 106 de espermatozóides in natura; G3 éguas inseminadas com sêmen congelado 800 x 106 de espermatozóides viáveis pré-congelação; G4 éguas inseminadas com sêmen congelado 800 x 106 de espermatozóides viáveis pré-congelação + adição de 20 mL de plasma seminal; G5 éguas inseminadas com sêmen congelado 800 x 106 de espermatozóides viáveis pré-congelação + corticóide-terapia; G6 éguas inseminadas com sêmen congelado 800 x 106 de espermatozóides viáveis pré-congelação + adição de 20 mL de plasma seminal + corticóide-terapia. A corticóide-terapia foi iniciada quando os animais apresentavam folículos de 35 mm e edema uterino, neste momento, se efetuava a administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) e concomitantemente 0,1 mg/kg de acetato de prednisolona por via intramuscular (Predef ), e repetia-se o corticóide a cada 12 horas até a ovulação. Os animais dos grupos tratados com corticóide G5 e G6, demonstraram um decréscimo significativo na função neutrofílica, frente ao teste da redução do tetrazólio nitroazul (NBT). O plasma seminal não alterou a intensidade da resposta inflamatória em nenhum dos testes realizados. No teste de fertilidade foram realizados dois grupos de inseminação, no primeiro, foram utilizadas éguas sem histórico de resposta inflamatória intensa pós-inseminação e não foi vista diferença estatística nos resultados de prenhes. Entretanto, no segundo teste de fertilidade, onde foram usadas éguas problemas, com... . / Aiming to verify the action of prednizolone acetate and of seminal plasma on the uterine inflammatory response of mares inseminated with frozen semen, the following procedures were developed. Thirty six mares were randomly allocated in 6 experimental groups: G1 control groups, with non-inseminated mares; G2 mares inseminated with 800 x 106 in natura sperm cells; G3 mares inseminated with 800 x 106 frozen-thawed sperm cells; G4 mares inseminated with 800 x 106 frozen-thawed sperm cells + 20 mL seminal plasma; G5 mares inseminated with 800 x 106 frozen-thawed sperm cells + cortico-therapy; G6 mares inseminated with 800 x 106 frozen-thawed sperm cells + 20 mL seminal plasma + cortico-therapy. The therapy with 0,1 mg/kg of prednizolone acetate (IM) (Predef ), was performed when the mares presented follicles with 35 mm and uterine edema. At this moment the ovulation was induced with human corionic gonadotrophin (hCG), and the corticoid administrations repeated every 12 hours until ovulation. In G5 and G6 when the animals were treated with corticoid, it was observed a significant decrease on the neutrophil function, analyzed by the tetrazolio nitroazul test (NBT). The infusion of seminal plasma did not modify the uterine inflammatory response in any of the performed tests. For the fertility test, two groups of inseminated mares were used. On the first one, mares with no history of intense uterine inflammatory response after insemination were used. No statistic differences were observed on pregnancy results. However, on the second group of fertility test when problem mares, with history of post-insemination endometritis, were used, the corticoid-treated group presented a significant high pregnancy rate when compared with the control group (67% and 0% respectively). The cortico-therapy showed to be a safe method with no side effects on treated animals, representing an adequate choice for animals... (Complete abstract, click electronic address below).

O presente estudo visou verificar o efeito sobre alguns parâmetros da seleção por gradiente de Percoll® e da adição de plasma seminal do sêmen eqüino preservado a +4oC. O primeiro experimento avaliou a taxa de recuperação de espermatozóides após seleção por Percoll® em diferentes protocolos de centrifugação. Foram realizadas 5 coletas de sêmen de um garanhão. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração. Foram retiradas duas amostras de 4 mL, diluídas em leite desnatado UHT com concentrações de 50 e 100 x 106 espermatozóides por mL cada. Cada uma destas amostras foi dividida em 4 alíquotas de 1 mL, que foram então colocadas sobre Percoll® e submetidas a diferentes tempos e velocidades de centrifugação. V1 - 200 g (5 min) + 800 g (10 min); V2 - 800 g (10 min); V3 - 800 g (15 min); V4 - 800 g (20 min). Após esse processo, o sobrenadante foi desprezado e o pellet de cada alíquota ressuspendido com 0,5 mL de leite UHT. As 8 amostras foram novamente avaliadas para concentração, motilidade e vigor. O segundo experimento estudou o efeito da adição de plasma seminal de diferentes qualidades ao sêmen eqüino selecionado por gradiente de Percoll® e resfriado a +4°C por até 72 horas. Foram utilizados 40 ejaculados de 4 garanhões, sendo dois com boa qualidade de sêmen e dois com baixa qualidade de sêmen. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração e preparadas cinco frações de 100x106 espermatozóides, diluídas 1:1 (v/v) em EDTA-Glicose. Quatro delas, constituídas por 1mL a 2mL, foram depositadas sobre Percoll®. A fração restante foi centrifugada em tubo de vidro de 10 mL, sob as mesmas condições de tempo e velocidade das demais amostras. Foi realizada centrifugação por 5 minutos em 200 g, seguida de 10 minutos em 800 g. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com leite UHT desnatado compondo os seguintes tratamentos: Sp: 1,5 mL de leite UHT desnatado sem adição de plasma seminal; Hp: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal homólogo; Ap: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal do pool de alta qualidade; Bp: 1,425mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L plasma seminal do pool de baixa qualidade; Cc: foi centrifugada sem seleção por Percoll®, teve seu sobrenadante descartado e ressuspendida com 2 mL de leite UHT; C : uma amostra de sêmen diluído em leite UHT foi mantida como controle no processo de armazenamento. As amostras foram resfriadas a +4°C e examinadas a cada 24h até as 72 horas em relação à motilidade, funcionalidade de membrana (teste hiposmótico) e integridade de membrana (CFDA/PI). A seleção por gradiente descontínuo de Percoll® 90/45% mostrou-se efetiva na recuperação de espermatozóides com motilidades progressiva e total. A adição de 5% de plasma seminal ou a ausência de plasma não influenciaram os valores da motilidade das amostras selecionadas por gradiente de Percoll®. A seleção por Percoll não influenciou na percentagem de células com membrana plasmática funcional. Concentrações superiores a 2% de plasma seminal resultaram em decréscimo do número de células com membrana funcional, enquanto que as amostras sem plasma seminal apresentaram os melhores resultados e o grupo controle, que apresentava a maior percentagem de plasma, os piores. A utilização de Percoll® não separou células com alteração de membrana. A percentagem de células com membrana completamente íntegra foi significativamente maior nas amostras que sofreram processo de centrifugação, independentemente da seleção. O processo de seleção por Percoll® foi efetivo na recuperação de espermatozóides de eqüino com motilidade progressiva, mas não selecionou espermatozóides quanto à funcionalidade nem à integridade de membrana. Concentrações inferiores a 2% de plasma seminal melhoraram a funcionalidade de membrana. A ausência de plasma seminal melhorou os resultados de integridade das membranas plasmática e acrossomal; e a adição de plasma de alta qualidade não melhorou a motilidade de espermatozóides selecionados por Percoll®.

O presente trabalho constou de três estudos. No primeiro estudo, cinco ejaculados de 30 machos foram analisados conforme a manutenção da MOT a 17ºC, sendo classificados em três tipos: MOT <60% nas 72h (EI); MOT ≥60% nas 72h e <60% nas 144h (EII) e MOT ≥60% nas 144h (EIII). Doze machos foram selecionados e distribuídos em três grupos: MAIOR, MÉDIA e MENOR sensibilidade espermática ao resfriamento. Em seguida, foram coletados cinco ejaculados de cada macho, sendo a MOT avaliada a cada 24h, e a integridade da membrana espermática (IM) e de acrossomas normais (NAR) nas 24, 72, 120 e 168h. Machos menos sensíveis ao resfriamento apresentaram menor variação na MOT do período pré- para o pós-seleção. Diferenças entre os machos foram observadas desde as 24 até 168h para MOT, nas 120 e 168h para MI e nas 72 e 168h para NAR. A MOT foi mais afetada que MI e NAR durante o armazenamento do sêmen in vitro. No estudo 2 foi avaliada a possibilidade de reverter a sensibilidade espermática ao resfriamento pela troca de plasma seminal (PS) entre machos com diferente manutenção da MOT a 17ºC. Foram utilizados ejaculados de cinco cachaços selecionados e classificados como: menor (MES) e maior sensibilidade ao resfriamento (MAS). Foram utilizados seis tratamentos, com cinco repetições cada. Nos tratamentos T1 e T3, o sêmen dos machos MES e MAS, respectivamente, foram processados de acordo com o protocolo convencional. Foi efetuada centrifugação (800g por 10 min) e adição do PS (10mL) homólogo para os espermatozóides MES e MAS, respectivamente, nos T2 e T4. Após a centrifugação, foi realizada a troca do PS, sendo que espermatozóides dos machos MES foram expostos ao PS dos machos MAS (T5) e o PS dos machos MES foi adicionado aos espermatozóides dos machos MAS (T6). A MOT foi avaliada a cada 24h, durante sete dias de conservação. NAR e de IM foram avaliados nas 24, 72, 120 e 168h. Diferenças na MOT, entre os machos MES (T1) e MAS (T3), foram observadas após armazenamento de 48h. Não foram observadas alterações em MOT e IM, quando foi efetuada a troca de PS entre os machos MES e MAS. Não foi possível reverter a maior sensibilidade ao resfriamento de espermatozóides suínos, após a ejaculação, com a adição de 10% do PS de machos com sêmen de menor sensibilidade. No terceiro estudo, foi avaliada a fertilidade de sêmen suíno pelo teste de ligação de espermatozóides a um substrato sintético. A MOT e o percentual de espermatozóides ligados (PEL) foram avaliados nas 5, 24, 48 e 72 horas de armazenamento a 17ºC. O PEL foi determinado em soluções contendo 6,25 ou 12,5 milhões de espermatozóides/mL, com ou sem albumina sérica bovina (BSA), preparadas a partir de dois a cinco ejaculados de cada um dos quatro machos. Houve correlação positiva (r=0,33) entre a MOT e o PEL. Os machos diferem quanto à capacidade de ligação de seus espermatozóides ao substrato sintético, a partir de 24 horas de armazenamento do sêmen. Maior percentual de espermatozóides ligados ao substrato sintético é verificado com a inclusão de BSA e com o aumento da concentração espermática.

Orientador: Denise Maria Trombert de Oliveira / Banca: Ismar Sebastião Mosqueta / Banca: Káthia Socorro Mathias Mourão / Banca: João Donizete Denardi / Banca: Roberto Antônio Rodella / Resumo: Fabaceae apresenta ampla distribuição geográfica e compreende cerca de 727 gêneros e aproximadamente 19.320 espécies, sendo considerada a maior família depois de Asteraceae e Orchidaceae. Faboideae compõe a maior das subfamílias e possui as características mais derivadas. Dalbergieae é uma das tribos basais de Faboideae e apresenta 17 gêneros nos trópicos, concentrados na América tropical; Machaerium está incluído nesta tribo e sendo o maior número de espécies localizadas no Brasil, em diversas formações vegetais. O presente trabalho descreve a morfologia, anatomia e ontogênese dos frutos e sementes de Machaerium brasiliense, M. hirtum, M. nyctitans, M. stipitatum e M. villosum, comparando as espécies entre si e com a literatura; verifica-se, ainda, a morfologia das plântulas de M. brasiliense, M. hirtum e M. villosum, bem como é apresentada a análise anatômica comparada de cotilédones, eofilos e metafilos. O material coletado foi processado segundo técnicas usuais em microscopia de luz, utilizando-se principalmente, inclusão em metacrilato; para estudo da venação, eofilos e metafilos foram diafanizados. As cinco espécies estudadas apresentam o ovário típico das leguminosas, ocorrendo inúmeros tricomas tectores em toda a periferia, além de tricomas glandulares em M. hirtum; o ovário apresenta secção transversal ovada a elíptica, destacando-se a ocorrência de idioblastos fenólicos junto aos feixes vasculares. Após a fecundação, são reconhecidas grandes variações, ocorrendo inúmeras divisões celulares, as quais são mais numerosas no endocarpo externo. Durante a fase de alongamento e diferenciação celulares, destaca-se a formação do seed cushion, constituído por longos tricomas pluricelulares voltados para o interior exceto em M. villosum que o endocarpo interno é parenquimático, formando um tecido que preenche a cavidade seminal... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fabaceae presents wide geographic distribution and consists of approximately 727 genera and 19,320 species; it has been considered the third largest family, following Asteraceae and Orchidaceae. Faboideae represents the major subfamily and has the most derivative characteristics of such group. Dalbergieae is a basal tribe of Faboideae and presents 17 genera in the tropics, mainly in America; Machaerium is included in that tribe and has the largest number of species located in Brazil, in several biomes. The present work describes the morphology, anatomy and ontogeny of fruits and seeds from Machaerium brasiliense, M. hirtum, M. nyctitans, M. stipitatum, and M. villosum, through comparison between these species and with those in literature; besides, the morphology of seedlings of M. brasiliense, M. hirtum and M. villosum is analyzed and the comparative anatomical analysis of cotyledons, eophylls and metaphylls is presented. The material was collected and processed according to usual techniques of light microscopy, mainly through embedding in methacrylate; for venation study, eophylls and metaphylls were clarified. All studied species have typical leguminous ovary, with several non-glandular trichomes in all periphery, besides glandular trichomes in M. hirtum; the ovary presents ovate to elliptical transverse section, and phenolic idioblasts close to the vascular bundles are also detected. After fecundation, great variations are observed, with several cell divisions, which are more frequent in the outer endocarp. During cell elongation and differentiation, the seed cushion is originated by long pluricellular trichomes directed towards the interior, filling the seed chamber. Lignification is noted in part of the mesocarp and endocarp during fruit ripening, with formation of mesocarpic sclereids and outer endocarp fibers in all species. The samaras present typical structural peculiarities... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

The use of AI in dogs has been limited by the lack of effective and reliable means of cryopreservation of semen and by the poor correlation between traditional methods of post-thaw assessment of semen quality and fertility. In order to address these problems, the present study focuses upon methods of cold storage and cryopreservation of dog spermatozoa by undertaking comparative evaluations of post-thaw motility and in vitro induction of acrosome reaction. Split-ejaculate protocols were used to compare the effect of storage at +4°C and cryopreservation upon (i) the maintenance of spermatozoa motility and (ii) spontaneous or A23187-induced acrosome reactions during incubation at 39°C (in 5% CO2 in the humidified air) for 60 or 120 min. The assessments of samples were made by Bright-Field, Phase Contrast (PC), Differential Interference Contrast (DIC), Scanning (SEM) and Transmission (TEM) Electron Microscopy. The interaction between the process of glycerolisation and the presence of seminal plasma is one of the key limitors for success in cryopreservation of dog spermatozoa. Interactions between the effects of removal of seminal plasma (by centrifugation), dilution rate, the temperature at which glycerolisation took place and the concentration of glycerol upon survival of spermatozoa at +4°C were studied in a series of split-ejaculate experiments. Spermatozoa were suspended in Tris-fructose-citric acid extender containing 20% (v/v) egg yolk and 8% (v/v) glycerol at +4°C for 48 h. Survival was assessed as the percentage of spermatozoa displaying progressive motility. Survival of spermatozoa was higher (P < 0.05) after glycerolisation at +4°C than at the room temperature. At dilution rates of 1:1 and 1:2 (semen: extender), the survival was higher (P < 0.05) in samples that were centrifuged and glycerolised at +4°C than the samples that were neat and glycerolised at the room temperature. While at the dilution rate of 1:16 it was higher (P < 0.05) in samples that were neat plus glycerolised at +4°C than all samples that were glycerolised at the room temperature. Concentrations of glycerol that were > 2% (v/v) resulted in lower (P < 0.05) survival than at lower concentrations. Following the initial stage of the investigations, the optimisation and validation of a method for in vitro induction of acrosome reactions were required. Suspensions of spermatozoa in TALP medium were incubated in the presence of a logarithmic. series of concentrations of the calcium ionophore, A23187. Induction of acrosome reactions was assessedb y bright-field (using naphthol yellow S/aniline blue stain, NA) and phase contrast (PC) microscopy. Using these methods, it was determined that incubation in the presence of 1 μM/1 A23187 for a period of 30-45 min was optimal for inducing acrosomer eactions in fresh semen. It was also noted that the assessments of acrosome reactions by using NA staining, were highly correlated with PC microscopy. In consequence, the simple procedure of NA staining might be an acceptable alternative to PC microscopy for use in the field. Subsequently, the effect of chilling and glycerolisation upon in vitro induction of acrosome reactions by A23187 was assessed. Acrosome reactions were studied as these have been described in the literature as providing accurate bioassay of spermatozoal functionality in vivo. Acrosome reactions were assessed by using DIC microscopy. The acrosomal integrity was impaired after chilling, which accelerated the A23187-induced acrosome reaction such that a lower concentration (0.1 μM/1) of A23187 was also effective to induce the reaction within 60 min of incubation. However, the presence of 2% glycerol (v/v, final) in standard Tris extender, containing 20% egg yolk, did not significantly affect the sequence of acrosome reaction. The optimal freezing regimen (from +4°C to -120°C) was determined by using a programmable biological freezer in a series of experiments, in which various cooling rates were combined in a Latin square design. Semen was diluted in standard Tris extender containing 20% egg yolk and 2% glycerol (v/v, final) and packed in 0.25 ml French paiettes (straws). The optimal cooling regimen was -0.5°C/min from +4°C to -9°C, -40°C/min to -20°C, -100°C/min to -120°C, followed by direct immersion of the straws in liquid nitrogen. Changes in temperatures within an individual straw were continuously measured and these data were found to be highly correlated with the eventual post-thaw motility of frozen-thawed spermatozoa. Although freezing and thawing resulted in major acrosomal deterioration, there were no significant differences between freezing regimens on the basis of in vitro induction of acrosome reactions, as assessed by DIC microscopy. Finally, ultrastructural studies, using SEM and TEM, upon chilled (as 'ready to freeze') and frozen-thawed spermatozoa subjected to A23187-induced acrosome reaction demonstrated that freeze-thawing provoked the acrosome reaction such that, with TEM (i) the plasma membrane was usually damaged or missing, (ii) the acrosomal changes (including the loss of acrosomal content, as seen by decondensation and swelling) except vesiculation of the acrosomal membranes, exceeded to the equatorial segment and (iii) a further damage occurred to the post-acrosomal region. In summary, these results show that semen should be; (i) centrifuged for dilutions of < 1:8, (ii) diluted at 1:8 in Trisfructose-citric acid extender containing 20% egg yolk, (iii) glycerolised at +4°C at a final concentration of 2% glycerol (v/v), (iv) cooled at -0.5°C/min from +4°C to -9°C, at -40°C/min to -20°C and at -100°C/min to -120°C, followed by direct immersion of the straws in liquid nitrogen for cryopreservation and (i) introduced to 1 μM/1 A23187 in TALP, (ii) incubated for at least 30-45 min for induction of acrosome reaction in vitro and, thereby, demonstrated that optimisation of cryopreservation and in vitro induction of acrosome reaction of dog spermatozoa are possible.

O presente trabalho constou de três estudos. No primeiro estudo, cinco ejaculados de 30 machos foram analisados conforme a manutenção da MOT a 17ºC, sendo classificados em três tipos: MOT <60% nas 72h (EI); MOT ≥60% nas 72h e <60% nas 144h (EII) e MOT ≥60% nas 144h (EIII). Doze machos foram selecionados e distribuídos em três grupos: MAIOR, MÉDIA e MENOR sensibilidade espermática ao resfriamento. Em seguida, foram coletados cinco ejaculados de cada macho, sendo a MOT avaliada a cada 24h, e a integridade da membrana espermática (IM) e de acrossomas normais (NAR) nas 24, 72, 120 e 168h. Machos menos sensíveis ao resfriamento apresentaram menor variação na MOT do período pré- para o pós-seleção. Diferenças entre os machos foram observadas desde as 24 até 168h para MOT, nas 120 e 168h para MI e nas 72 e 168h para NAR. A MOT foi mais afetada que MI e NAR durante o armazenamento do sêmen in vitro. No estudo 2 foi avaliada a possibilidade de reverter a sensibilidade espermática ao resfriamento pela troca de plasma seminal (PS) entre machos com diferente manutenção da MOT a 17ºC. Foram utilizados ejaculados de cinco cachaços selecionados e classificados como: menor (MES) e maior sensibilidade ao resfriamento (MAS). Foram utilizados seis tratamentos, com cinco repetições cada. Nos tratamentos T1 e T3, o sêmen dos machos MES e MAS, respectivamente, foram processados de acordo com o protocolo convencional. Foi efetuada centrifugação (800g por 10 min) e adição do PS (10mL) homólogo para os espermatozóides MES e MAS, respectivamente, nos T2 e T4. Após a centrifugação, foi realizada a troca do PS, sendo que espermatozóides dos machos MES foram expostos ao PS dos machos MAS (T5) e o PS dos machos MES foi adicionado aos espermatozóides dos machos MAS (T6). A MOT foi avaliada a cada 24h, durante sete dias de conservação. NAR e de IM foram avaliados nas 24, 72, 120 e 168h. Diferenças na MOT, entre os machos MES (T1) e MAS (T3), foram observadas após armazenamento de 48h. Não foram observadas alterações em MOT e IM, quando foi efetuada a troca de PS entre os machos MES e MAS. Não foi possível reverter a maior sensibilidade ao resfriamento de espermatozóides suínos, após a ejaculação, com a adição de 10% do PS de machos com sêmen de menor sensibilidade. No terceiro estudo, foi avaliada a fertilidade de sêmen suíno pelo teste de ligação de espermatozóides a um substrato sintético. A MOT e o percentual de espermatozóides ligados (PEL) foram avaliados nas 5, 24, 48 e 72 horas de armazenamento a 17ºC. O PEL foi determinado em soluções contendo 6,25 ou 12,5 milhões de espermatozóides/mL, com ou sem albumina sérica bovina (BSA), preparadas a partir de dois a cinco ejaculados de cada um dos quatro machos. Houve correlação positiva (r=0,33) entre a MOT e o PEL. Os machos diferem quanto à capacidade de ligação de seus espermatozóides ao substrato sintético, a partir de 24 horas de armazenamento do sêmen. Maior percentual de espermatozóides ligados ao substrato sintético é verificado com a inclusão de BSA e com o aumento da concentração espermática.

O presente estudo visou verificar o efeito sobre alguns parâmetros da seleção por gradiente de Percoll® e da adição de plasma seminal do sêmen eqüino preservado a +4oC. O primeiro experimento avaliou a taxa de recuperação de espermatozóides após seleção por Percoll® em diferentes protocolos de centrifugação. Foram realizadas 5 coletas de sêmen de um garanhão. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração. Foram retiradas duas amostras de 4 mL, diluídas em leite desnatado UHT com concentrações de 50 e 100 x 106 espermatozóides por mL cada. Cada uma destas amostras foi dividida em 4 alíquotas de 1 mL, que foram então colocadas sobre Percoll® e submetidas a diferentes tempos e velocidades de centrifugação. V1 - 200 g (5 min) + 800 g (10 min); V2 - 800 g (10 min); V3 - 800 g (15 min); V4 - 800 g (20 min). Após esse processo, o sobrenadante foi desprezado e o pellet de cada alíquota ressuspendido com 0,5 mL de leite UHT. As 8 amostras foram novamente avaliadas para concentração, motilidade e vigor. O segundo experimento estudou o efeito da adição de plasma seminal de diferentes qualidades ao sêmen eqüino selecionado por gradiente de Percoll® e resfriado a +4°C por até 72 horas. Foram utilizados 40 ejaculados de 4 garanhões, sendo dois com boa qualidade de sêmen e dois com baixa qualidade de sêmen. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi avaliado quanto à motilidade, vigor e concentração e preparadas cinco frações de 100x106 espermatozóides, diluídas 1:1 (v/v) em EDTA-Glicose. Quatro delas, constituídas por 1mL a 2mL, foram depositadas sobre Percoll®. A fração restante foi centrifugada em tubo de vidro de 10 mL, sob as mesmas condições de tempo e velocidade das demais amostras. Foi realizada centrifugação por 5 minutos em 200 g, seguida de 10 minutos em 800 g. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com leite UHT desnatado compondo os seguintes tratamentos: Sp: 1,5 mL de leite UHT desnatado sem adição de plasma seminal; Hp: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal homólogo; Ap: 1,425 mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L de plasma seminal do pool de alta qualidade; Bp: 1,425mL de leite UHT desnatado acrescido de 75 L plasma seminal do pool de baixa qualidade; Cc: foi centrifugada sem seleção por Percoll®, teve seu sobrenadante descartado e ressuspendida com 2 mL de leite UHT; C : uma amostra de sêmen diluído em leite UHT foi mantida como controle no processo de armazenamento. As amostras foram resfriadas a +4°C e examinadas a cada 24h até as 72 horas em relação à motilidade, funcionalidade de membrana (teste hiposmótico) e integridade de membrana (CFDA/PI). A seleção por gradiente descontínuo de Percoll® 90/45% mostrou-se efetiva na recuperação de espermatozóides com motilidades progressiva e total. A adição de 5% de plasma seminal ou a ausência de plasma não influenciaram os valores da motilidade das amostras selecionadas por gradiente de Percoll®. A seleção por Percoll não influenciou na percentagem de células com membrana plasmática funcional. Concentrações superiores a 2% de plasma seminal resultaram em decréscimo do número de células com membrana funcional, enquanto que as amostras sem plasma seminal apresentaram os melhores resultados e o grupo controle, que apresentava a maior percentagem de plasma, os piores. A utilização de Percoll® não separou células com alteração de membrana. A percentagem de células com membrana completamente íntegra foi significativamente maior nas amostras que sofreram processo de centrifugação, independentemente da seleção. O processo de seleção por Percoll® foi efetivo na recuperação de espermatozóides de eqüino com motilidade progressiva, mas não selecionou espermatozóides quanto à funcionalidade nem à integridade de membrana. Concentrações inferiores a 2% de plasma seminal melhoraram a funcionalidade de membrana. A ausência de plasma seminal melhorou os resultados de integridade das membranas plasmática e acrossomal; e a adição de plasma de alta qualidade não melhorou a motilidade de espermatozóides selecionados por Percoll®.