A quantificação dos componentes bioquímicos como frutose, ácido cítrico e proteína total existentes no plasma seminal de caprinos e ovinos localizados na região Centro-Oeste do Brasil é uma forma de avaliar a atividade fisiológica e bioquímica espermáticas. Estes dados servem como indicadores de prováveis problemas com os testículos e glândulas acessórias desses animais e de sua respectiva fertilidade. A frutose e o ácido cítrico são importantes para o sêmen como fonte de energia metabólica e como componente de sistema tampão, respectivamente. A frutose é um marcador da função secretora das vesículas seminais, e é um componente importante para a sobrevivência dos espermatozóides em condições anaeróbicas e está estreitamente relacionada com a motilidade inicial das células espermáticas. Sendo assim, os objetivos do presente projeto foram analisar quantitativamente esses componentes do plasma seminal de bodes e carneiros sob latitude 20°31\'S em quatro épocas do ano e purificar, através de técnicas cromatográficas, a enzima fosfolipase A2, importante proteína presente no plasma seminal. As análises bioquímicas foram feitas usando-se um espectrofotômetro UV/Vis para obtenção da curva padrão e para a determinação das concentraçõoes mensais e da concentração anual média dos constituintes analisados. A purificação da PLA2 foi feita por cromatografia líquida preparativa usando-se como fase estacionária a coluna Superdex 75-16/60 (GE HealthCare) de exclusão por tamanho e membranas semipermeáveis de 10 e 30 kDa. Como resultado das análises bioquímicas, obteve-se a concentração anual média de proteínas totais de 3,27 ± 0,60 g/dL para ovinos e de 5,02 ± 0,43 para caprinos, ácido cítrico de 1015,33 ± 66,50 µg/mL para ovinos e de 1584,35 ± 143,90 µg/mL para caprinos e frutose de 23,40 ± 4,80 mg/dL para ovinos e 72,73 ± 18,50 mg/dL para caprinos. Os resultados mostraram que a PLA2 extraída do plasma seminal de ovinos tem massa molecular próxima de 13,8 kDa e a PLA2 do plasma seminal de caprinos tem massa molecular próxima a 12,8 kDa. / Quantification of biochemical components in seminal plasma including fructose, citric acid and total protein of goat and sheep of the Midwest region of Brazil is one way of evaluating the biochemical and physiological activity of the sperm. These data serve as indicators of potential problems with the testicles and accessory glands of these animals and their relative fertility. The fructose and citric acid are important for the semen as a source of metabolic energy and as a component of a buffer, respectively. Fructose is a marker of secretory function of seminal vesicles, important for the survival of spermatozoa under anaerobic conditions, and is closely related to the initial motility of sperm cells. Therefore, the objectives of this project were to quantitatively analyze these components in the seminal plasma of goats and sheep in latitude 20°31\'S 3 1\'S in four seasons and purify by chromatographic techniques the enzyme phospholipase A2, an important protein in the seminal plasma. Biochemical analysis were done using a spectrophotometer UV / Vis to obtaining the standard curve and to determine the monthly and annual average concentration of the constituents analyzed. The purification of PLA2 was performed by preparative liquid chromatography using the column as stationary phase Superdex 75-16/60 (GE HealthCare) by size exclusion and semipermeable membranes 10 and 30 kDa. As a result of biochemical analysis, we obtained the annual average concentration of total protein of 3,27 ± 0,60 g / dL for sheep and 5,02 ± 0,43 g/dL for goats, citric acid of 1015,33 ± 66, 50 g / mL for sheep and 1584,35 ± 143,90 g / mL for goats and fructose 23,40 ± 4,80 mg / dL for sheep and 72,73 ± 18,50 mg / dL for goats. The results showed that the PLA2 extracted from seminal plasma of sheep has a molecular mass of 13,8 kDa and the next PLA2 from goat seminal plasma has a molecular mass close to 12,8 kDa.

Submitted by Suzane Peres Campanholi null (supc@hotmail.com) on 2016-06-02T21:33:16Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Suzane - Versão final pro repositório UNESP.pdf: 1223510 bytes, checksum: 26ebdc009120ee189335639e58233246 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-06T16:46:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 campanholi_sp_me_jabo.pdf: 1223510 bytes, checksum: 26ebdc009120ee189335639e58233246 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T16:46:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 campanholi_sp_me_jabo.pdf: 1223510 bytes, checksum: 26ebdc009120ee189335639e58233246 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O plasma seminal já foi descrito como benéfico e ao mesmo tempo prejudicial aos espermatozoides e isto está relacionado com o tempo de contato entre eles. A criopreservação do sêmen em touros pode ser prejudicada por exposição contínua dos espermatozoides ao plasma seminal (PS) e a aplicação de métodos para sua remoção pode aumentar a qualidade dos espermatozoides recuperados pós-descongelação, melhorando os resultados de biotécnicas que utilizam sêmen criopreservado. Pelo fato da centrifugação causar muitos danos aos espermatozoides, a filtragem com Sperm Filter® apresenta-se como um novo método de remoção do PS que almeja melhores resultados, porém não foi encontrado relato da sua aplicação em bovinos até o momento. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos métodos de centrifugação e filtragem com Sperm Filter® sobre a criopreservação do sêmen bovino. Para isso, o sêmen de 38 touros Nelore foi colhido por eletroejaculação. Após a colheita, o sêmen foi fracionado em três alíquotas iguais para divisão em três grupos: controle (N), em que o sêmen foi diluído com PS; centrifugação (C), em que o PS foi removido por centrifugação a 600 X g por 10 minutos; e filtragem (F), em que o PS foi removido por filtragem com Sperm Filter®. As amostras foram criopreservadas, e pós-descongelação foram avaliados a cinética espermática, a integridade das membranas plasmática e acrossomal, o potencial mitocondrial, o estresse oxidativo e a capacidade fecundante através da produção in vitro de embriões (PIVE). Com relação à cinética, maiores valores da velocidade do trajeto (P = 0,0005) e velocidade progressiva (P = <0,0001) foram observados nos grupos C e F e os parâmetros frequência de batimento, retilinearidade e linearidade foram superiores no grupo F (P = 0,0008; P = 0,0133 e P = 0,0005, respectivamente). A integridade de membrana foi prejudicada pela centrifugação e filtragem do sêmen (P < 0,0001), porém o estresse oxidativo foi reduzido com esses métodos de remoção do PS (P < 0,0001). Na PIVE, as maiores taxas de desenvolvimento embrionário (blastocistos e blastocistos eclodidos) foram observadas no grupo N e F (P = 0,008 e P = 0,0042, respectivamente). Portanto, a remoção do plasma seminal pelo método da centrifugação reduz a qualidade do sêmen criopreservado bovino, interferindo negativamente na fertilidade dos espermatozoides e o método da filtragem com Sperm Filter® apresentou melhor resultado evidenciado por altas taxas de desenvolvimento embrionário. / Seminal plasma has been described as beneficial and harmful to the spermatozoa and this is related to the contact time between them. Cryopreservation of semen from bulls can be undermined by continuous exposure of sperm to the seminal plasma (SP) and the application of methods for removal can increase the quality of post-thaw sperm recovered, improving fertilization. Centrifugation cause a lot of damage to sperm and filtering with Sperm Filter® is a new SP removal method that aims to better results, but has not yet been applied in bull. The aim of this study was to evaluate the effect of the methods of centrifugation and filtering with Sperm Filter® on cryopreservation of bovine semen. For this, semen of 38 Nelore bulls was collected by electroejaculation. Semen was fractioned into three equal aliquots for division into three groups: control (N), wherein the semen was diluted with SP; centrifugation (C), in which the SP was removed by centrifugation at 600 X g for 10 minutes; and filtration (F), in which the SP was removed by filtration with Sperm Filter®. Samples were cryopreserved and was evaluated after thawing sperm kinetics, the integrity of plasma and acrosomal membranes, mitochondrial potential, oxidative stress and the fertilizing capacity by in vitro embryo production (IVP). The kinetics, higher values of the path velocity (P = 0.0005) and progressive speed (P = <0.0001) were observed in the groups C and F and the beat frequency parameters, straightness and linearity were higher in group F (P = 0.0008, P = 0.0133 and P = 0.0005, respectively). Membrane integrity was impaired by centrifugation and filtration of semen (P <0.0001), though oxidative stress was reduced with these SP removal methods (P <0.0001). In IVP, the highest rate of embryonic development (blastocyst and hatched blastocyst) were observed in the C and F group (P = 0.008 and P = 0.0042, respectively). Therefore, removal of seminal plasma by the method of centrifugation reduces the quality of semen cryopreserved cattle, a negative effect on fertility of sperm, and the method of filtering with Sperm Filter® showed better results evidenced by high rates of embryonic development.

Submitted by RODRIGO DOS SANTOS ALBUQUERQUE null (rdsa20@gmail.com) on 2016-09-19T19:21:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado Rodrigo Albuquerque.pdf: 1101110 bytes, checksum: 06cce8f64ce03aadf0ced70da5dcfcab (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 12 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 12 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-09-22T17:06:43Z (GMT) / Submitted by RODRIGO DOS SANTOS ALBUQUERQUE null (rdsa20@gmail.com) on 2016-09-22T17:53:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado Rodrigo Albuquerque.pdf: 1101110 bytes, checksum: 06cce8f64ce03aadf0ced70da5dcfcab (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-09-27T12:31:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 albuquerque_rs_me_jabo.pdf: 1101110 bytes, checksum: 06cce8f64ce03aadf0ced70da5dcfcab (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T12:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 albuquerque_rs_me_jabo.pdf: 1101110 bytes, checksum: 06cce8f64ce03aadf0ced70da5dcfcab (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / A criopreservação provoca injúrias aos espermatozoides e necessita de métodos que minimizem esses danos. Embora seja bastante discutida, a remoção do plasma seminal tornou-se uma alternativa para melhorar a qualidade e viabilidade espermática após a congelação e vem sendo utilizada em outras espécies na tentativa de obter bons resultados. O objetivo deste estudo foi comparar a remoção do plasma seminal de bubalinos tanto por filtragem (SpermFilter®) quanto por centrifugação sobre a qualidade do sêmen descongelado de búfalos. Foram utilizados sete touros da raça Murrah, os quais foram submetidos à colheita de sêmen por vagina artificial uma vez por semana. Os ejaculados foram diluídos com Botu-Bov® e fracionados em alíquotas para confrontar três técnicas antes da congelação: grupo C (Criopreservação convencional com plasma seminal), grupo CE (Criopreservação removendo o plasma seminal por centrifugação) e grupo F (Criopreservação removendo o plasma seminal por filtragem). O sêmen fresco foi analisado quanto ao volume, aspecto, cor, concentração (câmara de Neubauer), turbilhonamento, motilidade progressiva, vigor e morfologia espermática. No sêmen descongelado, foram avaliados a cinética espermática pelo CASA, a integridade de membrana plasmática, acrossoma, potencial de membrana mitocondrial e quantificação de EROs por citometria de fluxo e, adicionalmente, foi estimado o grau de peroxidação lipídica pela técnica de TBARS. Os resultados revelam que a remoção de plasma seminal não proporcionou aumento da velocidade espermática, alteração no potencial de membrana mitocondrial e nem modificou o grau de peroxidação lipídica. Entretanto, a presença do plasma seminal (grupo controle) e a centrifugação provocou maiores índices de lesões na membrana plasmática, quando estas apresentam o acrossoma intacto (47,88±1,99% vs. 41,30±1,96%, respectivamente) em comparação ao grupo F (40,45±2,01%; p<0,07). A lesão em ambas as membranas (acrossomal e plasmática) foi mais evidente na filtragem (22,18±1,07) em relação ao grupo controle (15,23±1,06), sendo que a centrifugação não diferiu entre os grupos (17,43±1,04; p<0,01). A EROs foi mais evidente no grupo CE (56,68±4,53%) em relação ao grupo C e F (21,83±4,60% vs. 20,96±4,7%, respectivamente; p<0,01). Portanto, as hipóteses de que a remoção de plasma seminal melhoram a cinética espermática e proporcionam menores índices de lesões na membrana plasmática não foram confirmadas. Embora a filtragem tenha apresentado vantagem sobre a centrifugação gerando menor quantidade de EROs, não se justifica a remoção do plasma seminal em búfalos devido aos resultados serem muito semelhantes ao grupo controle. / Cryopreservation promotes injury to sperm and methods to minimize such damage are necessary. Although much discussed, removal of seminal plasma that has been successfully used in other species has become an alternative for improving sperm quality and viability after freezing. The aim of the present study was compare to removal seminal plasma in buffalo both by filtering (SpermFilter®) and by centrifugation on the quality frozen thawed buffalo semen. For this purpose, semen of seven Murrah buffalo-bulls, which were submitted to semen collection by artificial vagina once a week. The samples were diluted with Botu-Bov® and were fractionated in aliquots to confront three techniques before freezing: C group (conventional cryopreservation with seminal plasma), CE group (cryopreservation removing the seminal plasma centrifuge) F group (Cryopreservation removing the seminal plasma with Sperm Filter®). Fresh semen was analyzed for volume, appearance, color, concentration (Neubauer chamber), gross motility, progressive motility, vigor and sperm morphology. In the thawed sperm, sperm kinetics was evaluated by CASA, plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and estimation of the levels of reactive oxygen species were assigned by flow cytometry and was estimated degree of lipid peroxidation by TBARS technique. The results show that the removal seminal plasma did not improve sperm kinetics, mitochondrial membrane potential and does not modify the degree of lipid peroxidation.However, the presence of seminal plasma (control group) and centrifugation resulted in higher rates of injury to the plasma membrane, where they have an intact acrosome (47,88±1,99% vs. 41,30±1,96%, respectively) compared to F group (40,45±2,01%; p<0.07). The damage in both membranes (acrosome and plasma) was more evident in filtering (22,18±1,07) compared to the control group (15,23±1,06), and centrifugation did not differ between groups (17,43±1,04; p<0.01). ROS production was more evident in the CE group (56,68±4,53%) compared to the C and F group (21.83±4.60% vs. 20.96±4.7%, respectively; p<0.01). Therefore, removal seminal plasmais not beneficial to sperm, as did not alter the sperm kinetics nor provided lower lesions rates in the plasma membrane, although the filter has presented advantage over centrifugation as generated lower amount of ROS, not justifies the use bothtechnique because the results are very similar to those with seminal plasma. / FUNDUNESP: 2523-002-14

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: André Maciel Crespilho / Resumo: A vesiculite seminal possui grande relevância na clínica reprodutiva devido à dificuldade de tratamento, elevados índices de recidiva, risco de contaminação de fêmeas com agentes patogênicos, inutilização de animais e baixos índices de fertilidade. O tratamento local tem sido apontado por diversos autores como a melhor alternativa terapêutica, porém nenhum estudo avaliou seus efeitos na qualidade e longevidade seminal. Nesse sentido, os objetivos do presente estudo incluíram: investigar quais são as principais bactérias envolvidas na enfermidade e os principais fatores de risco para os garanhões; avaliar e comparar o efeito do tratamento local de vesiculite seminal quanto aos índices de cinética e morfologia espermática, integridade de membrana plasmática, porcentagem de leucócitos e contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) de amostras seminais frescas, refrigeradas e congeladas e o teor de óxido nítrico no plasma seminal, antes (M0), após uma semana (M1) e um mês (M2) da terapia. Os resultados obtidos permitiram inferir que a vesiculite seminal foi mais prevalente em animais adultos e idosos, a evolução da enfermidade ocorreu de forma crônica em todos os animais selecionados, a monta natural constituiu um fator predisponente para o surgimento da doença, a coloração amarelada do sêmen e a dificuldade na ejaculação são sinais indicativos de alteração da glândula e a bactéria mais prevalente envolvida na etiopatogenia da infecção foi a Pseudomonas aeruginosa. De maneira geral, o tratamento local levou a uma melhora da qualidade seminal após uma semana (M1), no sêmen a fresco, refrigerado e congelado, quanto aos índices de cinética espermática e integridade de membrana plasmática (p<0,05). No sêmen a fresco promoveu redução do volume seminal, incremento da concentração espermática, redução da porcentagem de leucócitos e de UFC/mL no M1 em relação aos demais momentos ... / Abstract: Seminal vesiculitis has great relevance in reproductive clinic due to the difficulty of treatment, high rates of recurrence, risk of female contamination with pathogenic agents, retirement of animals and low fertility rates. Local treatment has been reported as the best therapeutic alternative, although no other studies have evaluated its effects on seminal quality and longevity. The aims of this study included: to investigate what are the main bacteria involved in the disease and the risk factors for stallions; to evaluate and to compare the effect of local treatment of seminal vesiculitis on the sperm kinetic parameters, morphology and viability (plasma membrane integrity), percentage of leukocytes and counting colony forming units (CFU) of fresh, cooled and frozen semen samples and the content of nitric oxide in the seminal plasma, before (M0) and after one week (M1) and one month (M2) therapy. The results allow us to infer that the seminal vesiculitis was more prevalent in adults and aged animals, the evolution of the disease appeared chronically in all selected animals, natural breeding was a risk factor for onset of the disorder, the bege coulor of semen and ejaculatory dysfunction were signs indicative of abnormalities in the gland and the most common bacteria involved in the pathogenesis of the infection was Pseudomonas aeruginosa. In general, the local treatment produced an improvement in semen quality after a week (M1) in fresh, cooled and frozen semen on the kinetic parameters and sperm viability (p<0.05). In fresh semen promoted reduction in the volume of ejaculate, sperm concentration increased, reducing the percentage of leukocytes and CFU/mL in M1 compared to the other moments (p<0.05). In frozen semen promoted reduction of lipid peroxidation and of ROS content in M1 compared to other moments (p<0.05). The cooled semen for 24 hours at 5°C and 15°C demonstrated similar efficiency in the pre and post-treatment ... / Mestre

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar o perfil das principais proteÃnas do plasma seminal suÃno e suas associaÃÃes com parÃmetros seminais. Amostras de sÃmen foram coletadas de 12 cachaÃos adultos e submetidas à avaliaÃÃo dos parÃmetros seminais (motilidade total, morfologia, vitalidade e porcentagem de cÃlulas com acrossoma intacto). O plasma seminal foi obtido por centrifugaÃÃo e as proteÃnas seminais foram analisadas por eletroforese 2-D e espectrometria de massa. Foram testados modelos de regressÃo usando a soma das intensidades dos spots referentes Ãs mesmas proteÃnas como variÃveis independentes e parÃmetros seminais como variÃveis dependentes (p < 0,05). Cento e doze spots foram identificados nos gÃis do plasma seminal, equivalentes a 39 proteÃnas diferentes. As espermadesinas PSP-I, PSP-II, AQN1, AQN3 e AWN1 representaram 45,2  8 % do total da intensidade de todos os spots detectados nos geis. Outras proteÃnas expressas no plasma seminal suÃno incluem a albumina, proteÃnas do complemento (complement factor H precursor, complement C3 precursor e adipsin/complement factor D), imunoglobulinas (IgG heavy chain precursor, imunoglobulina delta heavy chain membrane bound form, imunoglobulina gamma-chain, Ig lambda chain V-C region PLC3 e CH4 and secreted domain of swine IgM), IgG-binding proteins, epididymal specific lipocalin-5, epididymal secretory protein E1 precursor, epididymal glutathione peroxidase precursor, transferrin, lactotransferrin e fibronectin tipo 1 (FN1). Em funÃÃo das anÃlises de regressÃo, o percentual de espermatozoides com defeito na peÃa intermediÃria foi relacionado com a quantidade de âCH4 and secreted domain of swine IgMâ e FN1 (R2 = 0,58), a proteÃna IgG-binding (R2 = 0,61), o fator H do complemento (R2 = 0,61) e lactaderina (R2 = 0,45). Porcentagem percentual de defeitos de cauda tambÃm foi relacionado com âCH4 and secreted domain of swine IgMâ e FN1 (R2 =0,40), a proteÃna IgG-binding (R2 = 0,34), e lactaderina (R2 = 0,74). A motilidade espermÃtica, por sua vez, teve associaÃÃo com a intensidade dos spots identificados como lactaderina (R2 = 0,48). Em conclusÃo, descreve-se, neste trabalho, o proteoma do plasma seminal suÃno e associaÃÃes significativas entre proteÃnas especÃficas do plasma seminal e parÃmetros seminais. Tais relaÃÃes servirÃo como base para a determinaÃÃo de marcadores moleculares da funÃÃo espermÃtica na espÃcie suÃna. / The present study was conducted to identify the major seminal plasma protein profile of boars and its associations with semen criteria. Semen samples were collected from 12 adult boars and subjected to evaluation of sperm parameters (motility, morphology, vitality and percent of cells with intact acrosome). Seminal plasma was obtained by centrifugation, analyzed by 2-D SDS-PAGE and proteins identified by mass spectrometry (electrospray ionization quadrupole-time-of-flight). We tested regression models using spot intensities related to the same proteins as independent variables and semen parameters as dependent variables (p < 0,05). One hundred and twelve spots were indentified in the boar seminal plasma gels, equivalent to 39 different proteins. Spermadhesins PSP-I, PSP-II, AQN1, AQN3 and AWN1 represented 45,2  8 % of the total intensity of all spots. Other proteins expressed in the boar seminal plasma include albumin, complement proteins (complement factor H precursor, complement C3 precursor and adipsin/complement factor D), immunoglobulins (IgG heavy chain precursor, immunoglobulin delta heavy chain membrane bound form, immunoglobulin gamma-chain, Ig lambda chain V-C region PLC3 and CH4 and secreted domain of swine IgM), IgG-binding proteins, epididymal specific lipocalin-5, epididymal secretory protein E1 precursor, epididymal secretory glutathione peroxidase precursor, transferrin, lactotransferrin and fibronectin type 1 (FN1). Based on regression analysis, the percentage of sperm with midpiece defects was related to the amount of CH4 and secreted domains of swine IgM and FN1 (R = 0,58), IgG-binding protein (R = 0,61), complement factor H precursor (R = 0,61) and lactadherin (R = 0.45). The percentage of sperm with tail defects was also related to CH4 and secreted domains of swine IgM and FN1 (R = 0,40), IgG-binding protein (R = 0,34) and lactadherin (R = 0,74). Sperm motility, in turn, had association with the intensities of spots identified as lactadherin (R = 0,48). In conclusion, we presently describe the major proteome of boar seminal plasma and significant associations between specific seminal plasma proteins and semen parameters. Such relationships will serve as the basis for determination of molecular markers of sperm function in the swine species.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar os aspectos da interaÃÃo das Binder of SPerm proteins (BSP) presentes no plasma seminal de caprinos e as principais proteÃnas do leite; 2) determinar se as BSP homÃlogas do plasma seminal de equinos, suÃnos e ovinos possuem propriedades de ligaÃÃo as proteÃnas do leite semelhante Ãs BSP bovinas; 3) investigar a interaÃÃo das proteÃnas do plasma seminal de caprinos e os componentes dos diluidores à base de lecitina de soja; 4) identificar as proteÃnas do plasma seminal de touros Curraleiro (PÃ-duro) associadas à circunferÃncia escrotal e os parÃmetros seminais. Para tanto, o leite desnatado tratado termicamente foi incubado com as proteÃnas do plasma seminal de caprinos e, aplicados em coluna cromatogrÃfica de gel filtraÃÃo na presenÃa e na ausÃncia de cÃlcio. AlÃm disso, o leite desnatado foi fracionado em duas fraÃÃes, MF-1 (proteÃnas do soro de leite) e MF-2 (caseÃnas), e posteriormente incubadas com as proteÃnas do plasma seminal de caprinos, seguida pela aplicaÃÃo em coluna de gel filtraÃÃo. As fraÃÃes foram eluÃdas e analisadas por Western blot. Adicionalmente, outras anÃlises foram realizadas para avaliar as propriedades desta ligaÃÃo. No primeiro procedimento, uma placa de ELISA foi sensibilizada com leite desnatado tratado termicamente e, em seguida, incubadas com diluiÃÃes em sÃrie de BSP purificadas e plasma seminal caprino, seguido por incubaÃÃo com anticorpos primÃrio e secundÃrios. Na segunda anÃlise, o leite desnatado, caseÃnas, &#945;-lactalbumina, &#946;-lactoglobulina diluÃdas em sÃrie foram gotejadas sobre uma membrana de nitrocelulose e, posteriormente, as membranas foram incubadas com plasma seminal de caprinos. A interaÃÃo foi detectada pela incubaÃÃo com anticorpos primÃrios e secundÃrios. No terceiro experimento, os espermatozoides epididimÃrios foram incubados com: (1) citrato/glicose + plasma seminal caprino, (2) plasma seminal caprino + diluidor leite, e (3) diluidor leite + plasma seminal de caprino. ApÃs o perÃodo de incubaÃÃo, as proteÃnas da membrana de espermatozoides foram extraÃdas e analisadas por Western blot. No segundo estudo, o leite desnatado foi incubado com as proteÃnas do plasma seminal de bovino, equino, suÃno e ovino, separadamente, e em seguida, foram aplicados em coluna cromatografia de filtraÃÃo em gel. AlÃm disso, a interaÃÃo de componentes de diluidores à base de lecitina de soja (Andromed e BioxcellÂ) foi investigada por cromatografia de filtraÃÃo em gel e ultracentrifugaÃÃo. Uma alÃquota de diluidor à base de lecitina de soja foi incubada com as proteÃnas do plasma seminal de caprinos e aplicadas em coluna de gel filtraÃÃo. As fraÃÃes foram eluÃdas e, apÃs este procedimento, as amostras foram analisadas por Western blot. A anÃlise por ultracentrifugaÃÃo foi realizada na ausÃncia e na presenÃa de vesÃculas de fosfolipÃdios oriundas de diluidores a base de lecitina de soja, Andromed e BioxcellÂ. As vesÃculas isoladas foram incubadas com as proteÃnas do plasma seminal de caprino. ApÃs a ultracentrifugaÃÃo, a presenÃa de BSP no sobrenadante e no sedimento foi analisada por Western Blot. Adicionalmente, o plasma seminal de dez touros Curraleiro (PÃ-duro) foi analisado por 2-D eletroforese. Os gÃis corados por Coomassie foram analisados no aplicativo PDQuestÂ. Nossos resultados demonstraram que as proteÃnas de BSP do plasma seminal caprino se ligam Ãs proteÃna do leite, especialmente, as caseÃnas e &#946;-lactoglobulina. AlÃm disso, estas proteÃnas interagem com as vesÃculas de fosfolipÃdios presentes nos diluidores Andromed e BioxcellÂ. As BSP de bovinos, equinos e suÃnos tambÃm se ligam aos componentes do leite. Jà as BSP de ovinos nÃo interagem com os componentes do leite desnatado. Nossas analises demonstraram que vinte e sete spots proteÃcos se correlacionam com pelo menos um parÃmetro reprodutivo. Em resumo, nossos resultados indicam que as BSP de caprinos se ligam Ãs proteÃnas do leite e aos fosfolipÃdios do diluidor Andromed e BioxcellÂ. Isto sugere que estes componentes tÃm um papel significativo na proteÃÃo de espermatozoide de caprinos, pois sequestram as BSP presentes no sÃmen. Nossos resultados sugerem que as BSP homÃlogas presentes no plasma seminal de equinos e suÃnos apresentam propriedades de ligaÃÃo Ãs proteÃnas do leite semelhantes Ãs BSP bovinas. AlÃm disso, o plasma seminal de touros Curraleiro (PÃ-duro) tem potenciais proteÃnas relacionadas com parÃmetros de qualidade seminal. Estes resultados sÃo de grande interesse, visto que elucida aspectos relacionados aos mecanismos de proteÃÃo dos espermatozoides pelos diluidores, para o desenvolvimento de novos diluidores livre de produtos de origem animal e na identificaÃÃo de proteÃnas com potencial à marcadores de fertilidade no plasma seminal de bovino. / The objectives of this study were: 1) to evaluate aspects of interaction between goat seminal plasma proteins and milk proteins; 2) to determine if homolog Binder of Sperm Proteins (BSP) from stallion, boar and ram seminal share the binding properties of the bovine BSP for the milk proteins; the mechanism of bovine sperm protection by milk is similar in different species of mammals; 3) to investigate the interactions of BSP proteins present in goat seminal plasma and phospholipids from soybean lecithin-based extender; 4) to identify seminal plasma proteins associated with scrotal circumference and sperm parameters. Heated skimmed milk was incubated with goat seminal plasma proteins and loaded onto Sepharose CL-4B column both in the presence and absence of calcium. Fractions were eluted and evaluated by Western blots using anti-goat BSP antibodies. Also, we fractionated milk into two fractions, MF-1 (mostly whey proteins) and MF-2 (mostly caseins), which were incubated with goat seminal plasma proteins and passed through gel filtration columns. Eluted fractions were then analysed by immunoblotting with anti-BSP antibodies. In addition, a series of analysis was conducted to evaluate binding properties involving milk and seminal plasma proteins. In the first procedure, an ELISA plate was saturated with heated skimmed milk and then incubated with serial dilutions of purified BSP proteins, goat seminal plasma proteins and anti-goat BSP. In a second analysis, heated skimmed milk, casein, &#945;-lactalbumin and &#946;-lactoglobulin were spotted onto a nitrocellulose membrane with serial dilutions. Membranes were then overlaid with goat seminal plasma proteins. Binding between milk and seminal plasma components were detected by successive incubations with primary and secondary antibodies. A third set of analysis was conducted to evaluate interactions among ejaculated and caudal epididymal sperm, milk and goat seminal plasma proteins. Epididymal sperm from each animal was incubated with: (1) citrate-glucose medium followed by seminal plasma; (2) with seminal plasma followed by milk extender; (3) with milk extender followed by seminal plasma (Fig. 1). Both ejaculated and epididymal goat sperm were also incubated with citrate-glucose medium without seminal plasma, as positive and negative controls, respectively. Following incubations, sperm membrane proteins were extracted and the presence of goat BSP proteins was assessed by Western blot Furthermore, heated skim milk was incubated with seminal plasma proteins from bulls, stallions, boars and rams and then loaded onto gel filtration column. The proteins were eluted and fractions were analysed by immunoblotting. Moreover, the interaction of hospholipids vesicles from soybean lecithin-based extender (Andromed and BioxcellÂ) and goat BSP proteins was investigated by gel filtration chromatography and ultracentrifugation analysis. An appropriate volume of soybean-based extender was incubated with goat seminal plasma proteins and passed through a gel filtration column. Proteins were eluted and fractions analysed by Western blot. Ultracentrifugation analysis was performed in the absence or in the presence of phospholipid vesicles. These vesicles were isolated from soybean lecithin extender and incubated with goat seminal proteins. The presence of goat BSP proteins in the supernatant and in the pellet was assessed by Western blot. In addition, seminal samples from ten Curraleiro Bulls were subjected to 2-D electrophoresis and Coomassie blue-stained gels analyzed with PDQuest software. Our results demonstrated that goat BSP proteins bound to milk protein, specially caseins and &#946;-lactoglobulin. In addition, these proteins interact with phospholipids vesicles of Andromed and BioxcellÂ. Bull, stallion and boar BSP proteins also bind to milk protein, whereas ram BSP proteins did not bind. Also, we identified that twenty and seven protein spots presented significant correlation with at least one reproductive parameter. In summary, our results indicate that goat BSP proteins bind to milk proteins and phospholipids from Andromed and Bioxcell semen extender. This suggests that these components play a significant role in protecting goat sperm by sequestrating all BSP proteins in semen. We also demonstrated that BSP homologs in boar, stallion seminal plasma share the binding properties of the bovine BSP for the milk proteins. Additionally, Curraleiro seminal plasma has potential proteins related to quality sperm parameters and they should be tested as putative fertility markers. These findings are of considerable interest in view of the mechanisms of sperm protection by extender constituents, for the development of novel extender free of animal components and the identification of proteins as potential biomarkers of fertility in bovine seminal plasma.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O Nordeste brasileiro possui aproximadamente quase metade do rebanho ovino brasileiro, estimado em vinte milhÃes de animais. Das raÃas aqui criadas, destacam-se as raÃas Santa InÃs e Morada Nova que tÃm bom desenvolvimento corporal, ganho de peso e boa adaptaÃÃo ao clima tropical. Recentemente mostrou-se o perfil protÃico de carneiros maduros atravÃs das tÃcnicas de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa, onde vÃrias proteÃnas foram identificadas, entre elas as RSVPs 14 e 22 kDa, pertencentes à famÃlia das BSPs e as bodesinas â 1 e 2, que fazem parte da famÃlia das espermadesinas, bem como as alteraÃÃes que sofre o perfil protÃico do plasma seminal dos animais durante o desenvolvimento reprodutivo, simultaneamente a mudanÃas nos parÃmetros de motilidade e concentraÃÃo espermÃtica, embora a associaÃÃo entre a expressÃo protÃica dessas proteÃnas com parÃmetros reprodutivos e medidas testiculares ainda nÃo tenham sido feitas no nordeste do Brasil. Amostras de sÃmen foram coletadas de 21 carneiros adultos Santa InÃs e 11 da raÃa Morada Nova com normalidade reprodutiva e idade mÃdia de dois anos. O plasma seminal foi obtido atravÃs da centrifugaÃÃo e submetido à eletroforese bidimensional, sendo os spots que diferiram estatisticamente entre os grupos de animais de alta (G1) e baixa motilidade (G2) foram digeridos com tripsina e submetidos a espectometria de massa e pesquisa em banco de dados para identificaÃÃo. Os gÃis foram corados com Cromassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo PDQuest e as quantidades dos spots estimados quantitativamente. Avaliaram-se, entÃo, associaÃÃes estatÃsticas entre estas variÃveis e os parÃmetros reprodutivos como, circunferÃncia escrotal (CE), percentual de cÃlulas mÃveis (PEM) e total de defeitos espermÃticos maiores (TDM) dos animais Santa InÃs e CircunferÃncia escrotal (CE), Motilidade Individual Progressiva (MIP), Percentual de cÃlulas mÃveis (PEM), ConcentraÃÃo espermÃtica (CONC) e Motilidade Massal (MM) para os animais Morada Nova. Em mÃdia foram detectados 236Â7,65 spots por gel, de acordo com o pareamento gerado pelo aplicativo PDQuest para a raÃa Santa InÃs e 261 15,09 spots por gel do plasma seminal dos animais Morada Nova, variando entre 182 e 375 spots por gel. Para a raÃa Santa InÃs um total de 63 spots foi identificado consistentemente em todos os gÃis, o que representou 41,5% da intensidade todos os spots detectados. Para os animais Morada Nova, um total de 98 spots foram detectados de forma consistente em todos os gÃis. A intensidade desses spots somou 60,82% da intensidade de todos os spots mostrados no gel master. Foi observado a grande expressÃo de proteÃnas de baixo peso molecular (14,5 a 18,4 kDa) e pI variando de 4,2 a 5,9.para a raÃa Santa InÃs. Do total mÃdio de 236 spots encontrados, treze spots apresentaram diferenÃa significativa (p<0,05) entre animais de alta e baixa motilidade, sendo dez spots mais intensos em animais de alta motilidade e trÃs em animais de baixa motilidade. ApÃs digestÃo dos spots e identificaÃÃo por espectometria de massa esses spots foram identificados como as proteÃnas Arilsulfatase A e Zinco alfa 2 glicoproteÃna, mais intensas no G1 e RSVP-22 e Bodesina-2 com maior expressÃo no grupo G2. Para a raÃa Morada Nova , quatro spots apresentaram diferenÃa significativa (p<0,05) para o parÃmetro percentual de cÃlulas mÃveis (PEM). ApÃs digestÃo dos spots e identificaÃÃo por MALDI-Tof-Tof, foram identificadas as proteÃnas RSVP-14, RSVP-22, ProteÃna &#945;-1 do complexo-t e aldose redutase, sendo todas mais intensas em animais de alta motilidade (G1). Em um segundo estudo, foi avaliada a influÃncia de diferentes fontes de proteÃna da dieta (farelo de soja, feno de folha de leucena e torta de algodÃo) e de nitrogÃnio nÃo- protÃico (urÃia) sobre o peso corporal, desenvolvimento testicular e qualidade espermÃtica dos animais estudados, bem como a expressÃo de proteÃnas no plasma seminal dos animais potencialmente relacionadas Ãs dietas. Foram utilizados 20 cordeiros da raÃa Morada Nova com idade variando entre 24 e 39 semanas. Para os critÃrios de desenvolvimento testicular (cirrcunferÃncia escrotal, espessura testicular, largura testicular e comprimento testicular) nÃo houve diferenÃa significativa (p<0,05). ao final do perÃodo experimental Animais alimentados com torta de algodÃo tiveram um aumento significativo do peso corporal (p<0,05), quando comparado com feno de leucena. No mesmo perÃodo, o peso corporal dos animais alimentados com feno de leucena, soja e urÃia foi semelhante. DiferenÃas entre os tratamentos (p <0,05) foram observadas apenas para motilidade progressiva individual e defeitos totais. O sÃmen dos animais alimentados com dietas contendo feno de leucena apresentou baixa motilidade progressiva individual quando comparados aqueles alimentados com dietas contendo farelo de soja. No entanto, animais alimentados com dietas contendo torta de algodÃo e urÃia tinham valores semelhantes para a motilidade progressiva. Quando os defeitos totais foram analisados, houve uma diferenÃa significativa entre os grupos de feno de leucena e urÃia. Foi detectado uma quantidade de 246,6  13,9, 236,0  12,4, 261,2  20,2 e 243,8  20,5 spots por gel nos grupos de farelo de soja, feno de folhas de leucena, torta de algodÃo e urÃia, respectivamente. NÃo houve diferenÃas significativas no nÃmero de spots por gel, entre os grupos. DiferenÃas significativas (p <0,05) foram observadas nas intensidades de doze spots dos mapas protÃicos. Foi observado um aumento da expressÃo do spot S8707 (62,8 kDa, pI 6,9 ) em animais alimentados com feno de folhas de leucena, quando comparados Ãqueles alimentados com farelo de soja, bem como correlaÃÃo negativa com a motilidade progressiva individual (MPI). Estas observaÃÃes indicam que fatores presentes no feno de folhas de leucena promovem um aumento na expressÃo da proteÃna (S8707), o que provavelmente provoca alteraÃÃes deletÃrias no mecanismo que controla a motilidade progressiva da cÃlula espermÃtica, jà que neste grupo observou-se valores mais baixos para MPI. / The Brazilian Northeast has about almost half of Brazilian sheep livestock, estimated at twenty million animals. The races created here, Santa Ines and Morada Nova stand out because they have good physical development, weight gain and good adaptation to the tropical climate. Recently showed the protein profile of mature rams through the techniques of two-dimensional electrophoresis associated with mass spectrometry, which several proteins have been identified, including those RSVPs 14 and 22 kDa, belonging to the family of BSPs and bodesinas - 1 and 2, that are part of the family of espermadesinas as well as the changes suffered by the protein profile of seminal plasma of animals during reproductive development, while changes in the parameters of sperm concentration and motility, although the association between the protein expression of these proteins with reproductive parameters testicular and measures have not yet been made in northeastern Brazil. Semen samples were collected from twenty-one adult sheep Santa Ines and eleven Morada Nova with normal reproductive and mean age of two years and seminal plasma was obtained by centrifugation and subjected to two-dimensional electrophoresis, and the spots that differed significantly between the groups of animals from high (G1) and low motility (G2) were digested with trypsin and subjected to mass spectrometry and research database for identification. The gels were stained with colloidal Cromassie, scanned and analyzed with PDQuest application and quantity of the spots quantitatively estimated. Evaluated, then, statistical associations between these variables and the reproductive parameters scrotal circumference (EC), percentage of motile cells (PEM) and total sperm defects (MDD) of the animals Santa InÃs and scrotal circumference (EC) motility individual rogressive (MIP), percentage of motile cells (PEM), Sperm concentration (CONC) and Massal motility (MM) for the animails Morada Nova. Were detected on average 236  7.65 spots per gel, according to the pairing generated by PDQuest application to the Santa Ines and 261  15.09 spots per gel in the seminal plasma of animals Morada Nova, ranging between 182 and 375 spots gel. For Santa InÃs a total of 63 spots were identified consistently in all gels, which represented 41.5% of all spots detected intensity. For Morada Nova animails, a total of 98 spots were detected consistently in all gels. The intensity of these spots amounted to 60.82% of the intensity of all spots shown on the master gel was observed a great expression of proteins of low molecular weight (14.5 to 18.4 kDa) and pI ranging from 4.2 to 5, 9. to Santa Ines. The average total of 236 spots found thirteen spots showed significant difference (p <0.05) between animals of high and low motility, being more intense ten spots in animals with high motility and three in animals with low motility. After digestion of spots and identification by mass spectrometry these spots were identified as proteins Arylsulfatase A and zinc alpha 2 glycoprotein more intense in G1and RSVP-22 and Bodesina with higher expression in G2. For the Morada Nova race, four spots showed significant difference (p <0.05) for the parameter percentage of motile cells (PEM). After digestion of spots and identification by MALDI-TOF-TOF, we identified as proteins, RSVP-14, RSVP-22, a protein &#945;-1 of t-complex and aldose reductase, which are all more intense in animals with high motility (G1). In a second study, evaluated the influence of different sources of dietary protein (soybean meal, leucaena leaf hay and cottonseed meal) and non-protein nitrogen (urea) on body weight, testicular development and sperm quality of the animals studied and protein expression in the seminal plasma of the animals potentially related to the diets. We used 20 Morada Nova lambs aged between 24 and 39 weeks. For the testicular development criteria (cirrcunferÃncia scrotal, testicular thickness, width and length testicular testicular) no significant difference (p <0.05) was observed at the end of experiment. Animals fed cottonseed meal had a significant increase in body weight (p <0.05) compared with Leucaena hay. In the same period, the body weight of animals fed leucaena hay, soybeans and urea was similar. Differences between treatments (p <0.05) were observed only for individual progressive motility and total defects. The semen of animals fed diets containing leucaena showed low motility individual when compared with those fed diets containing soybean meal. However, animals fed diets containing cottonseed meal and urea had similar values for progressive motility. When the total defects were analyzed, there was a significant difference between groups of leucaena hay and urea. Detected an amount of 246.6  13.9, 236.0  12.4, 261.2  20.2 and 243.8  20.5 spots per gel in groups of soybean meal, leucaena leaf hay, cottonseed meal and urea, respectively. No significant differences in the number of spots per gel, in both groups. Significant differences (p <0.05) were observed in the intensities of twelve spots in the proteic maps . An increased expression of spot S8707 (62.8 kDa, pI 6.9) in animals fed with hay and leaves of leucaena compared to those fed soybean meal, and a negative correlation with individual motility (MPI .) These observations indicate that factors present in hay sheets leucaena promote an increase in protein expression (S8707), the likely cause deleterious changes in the mechanism controlling the motility of sperm cells, as observed in this group lowest for MPI.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O Nordeste brasileiro à detentor de um expressivo rebanho ovino, e, dentre as raÃas deslanadas existentes na regiÃo, a Santa InÃs se destaca por apresentar bom desenvolvimento corporal, ganho de peso e adaptabilidade Ãs condiÃÃes tropicais. Recentemente, demonstrou-se que o perfil protÃico do plasma seminal de carneiros Santa InÃs passa por alteraÃÃes significativas durante o desenvolvimento reprodutivo, simultaneamente a mudanÃas nos parÃmetros de motilidade e concentraÃÃo espermÃtica. Contudo, ainda nÃo se conhece a identidade de todas essas proteÃnas. Dessa forma, o presente trabalho foi conduzido com o objetivo de identificar as proteÃnas do plasma seminal de carneiros Santa InÃs maduros, utilizando as tÃcnicas de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa. Amostras de sÃmen foram coletadas de oito carneiros adultos e o plasma seminal obtido atravÃs de centrifugaÃÃo e submetido à eletroforese bidimensional. Os gÃis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo PDQuest. Os spots foram cortados individualmente dos gÃis, digeridos com tripsina, e submetidos a identificaÃÃo por espectrometria de massa (MALDI-ToF/ToF). A sequÃncia peptÃdica das proteÃnas mais abundantes e a distribuiÃÃo dos domÃnios foram representadas graficamente utilizando o aplicativo Caititu. Foram detectados, em mÃdia, 302 spots por gel. Destes, 143 estavam presentes em todos os gÃis. Trinta e nove spots foram identificados, correspondendo a 26 diferentes proteÃnas. As proteÃnas mais abundantes foram as RSVPs 14 e 22 kDa, pertencentes à famÃlia das binder of sperm proteins, e as Bodesinas-1 e 2, pertencentes à famÃlia das espermadesinas. Outras proteÃnas foram identificas no estudo, incluindo albumina, clusterina, peroxiredoxina, lactotransferrina, metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2), beta galactosidase e heat shock proteins. Dessa forma, a identidade dessas proteÃnas sugere que o plasma seminal de carneiros Santa InÃs contÃm componentes que participam de diversos processos fisiolÃgicos, incluindo proteÃÃo do espermatozÃide, modulaÃÃo da motilidade e capacitaÃÃo espermÃtica, modificaÃÃo da membrana do espermatozÃide e interaÃÃo entre gametas. O conhecimento dessas proteÃnas contribuirà para uma melhor compreensÃo dos mecanismos de regulaÃÃo do plasma seminal sobre a funÃÃo espermÃtica em ovinos / Northeastern Brazil has a significant population of sheep and, among the native hairy breeds, Santa InÃs is known for its good performance and adaptability to tropical environments. Recently, it has been shown that the protein profile of the seminal plasma of Santa InÃs rams changes during sexual development, in concert with changes in semen parameters, such as sperm motility, morphology and concentration. However, the identity of seminal plasma proteins from these hairy rams is still unknown. Therefore, we pursued the identification of seminal plasma proteins from Santa InÃs rams using a proteomic approach. Semen samples were collected from eight mature rams, and seminal plasma saved after centrifugation. Seminal plasma protein maps, obtained by two-dimensional electrophoresis, were stained with colloidal Coomassie. The gels were scanned and analyzed using PDQuest software. Protein spots were individually cut, in-gel digested with trypsin and identified after tandem mass spectrometry and database search. On average , we detected 302 spots per gel, from which 143 were present on every member of the match set generated by PDQuest. Thirty-nine spots were positively identified by mass spectrometry, corresponding to 26 different proteins. The major proteins present in the maps were the BSP-like RSVP14 and RSVP22 and the spermadhesins bodhesin 1 and 2. Other proteins detected in the maps included albumin, clusterin, peroxiredoxin, lactoferrin, transferrin, matrix metalloproteinase 2, beta galactosidase and heat shock proteins. The Identity of these proteins suggest their participation on several physiological events, such as sperm protection, regulation of sperm motility and capacitation, modification of sperm membrane and fertilization. The knowledge of the proteome of the ovine seminal plasma is a necessary step towards the understanding of the mechanisms underlying the regulation of sperm function by seminal plasma components in rams

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A realizaÃÃo desta pesquisa teve por objetivos a descriÃÃo do mapa eletroforÃtico bidimensional do plasma seminal de touros adultos Bos indicus, raÃa Brahman, bem como a determinaÃÃo das associaÃÃes estatÃsticas entre proteÃnas do plasma seminal e parÃmetros seminais destes touros. Amostras de sÃmen de 56 touros foram coletadas e o plasma seminal foi obtido atravÃs de centrifugaÃÃo e submetido à eletroforese bidimensional. Os gÃis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados por meio do aplicativo PDQuest. Os touros foram divididos em grupos de alta e baixa motilidade espermÃtica e alto e baixo percentual de cÃlulas espermÃticas morfologicamente normais. As proteÃnas mais abundantes no plasma seminal dos touros Bos indicus e detectadas em todos os 56 gÃis apresentaram semelhanÃa com espermadesinas e BSPs. A expressÃo de spots com valores de kDa e pI equivalentes aos das proteÃnas aSFP, BSPs, clusterina , albumina e osteopontina foram estatisticamente diferentes entre os grupos de animais com parÃmetros contrastantes de motilidade e morfologia espermÃticas. As associaÃÃes encontradas entre tais spots protÃicos e os parÃmetros seminais sugerem a possibilidade do uso destes como marcadores moleculares da fertilidade potencial dos animais. / This research aimed to describe the two-dimensional electrophoresis map of bull seminal plasma of adult Bos indicus, Brahman, and the determination of statistical associations between proteins of seminal plasma and semen parameters of these bulls. Semen samples from 56 bulls were collected and seminal plasma was obtained by centrifugation and subjected to two-dimensional electrophoresis. The gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using PDQuest application. The bulls were divided into groups of high and low sperm motility and high and low percentage of morphologically normal sperm cells. The most abundant proteins in seminal plasma of bulls Bos indicus and detected in all 56 gels showed similarity to espermadesinas and BSPs. The expression of spots with pI values &#8203;&#8203;kDa protein equivalent to aSFP, BSPs, clusterin, albumin and osteopontin were significantly different between groups of animals with contrasting parameters of sperm motility and morphology. The associations found between such protein spots and semen parameters suggest the possibility of their use as molecular markers of potential fertility of animals.

Os macacos de cheiro (S. sciureus) são primatas neotropicais bastante ativos e que se estressam facilmente em cativeiro. Os métodos de colheita e avaliação do sêmen na espécie não foram padronizados de forma a reproduzi-los em diferentes centros de criação. O sêmen forma um firme coágulo imediatamente após a ejaculação e até o momento, nenhum método foi capaz de dissolvê-lo totalmente. Assim, a proposta deste estudo foi avaliar o condicionamento de S. sciureus ao método de colheita de sêmen por vibroestimulação peniana com o auxílio de observações comportamentais e dosagem de cortisol sérico. Objetivou-se ainda analisar o sêmen dos animais por meio de testes físicos e morfofuncionais, com e sem a utilização de enzima proteolítica para a dissolução do coágulo seminal. Foram estudados 12 machos adultos, alojados em dupla, em ambiente controlado. O condicionamento a vibroestimulação peniana foi desempenhado pela técnica de reforço positivo por meio de recompensa alimentar. Para a dissolução do coágulo seminal empregou-se a tripsina em três doses e dois tempos de incubação. O cortisol foi dosado pelo método de radioimunoensaio em amostras de soro. No presente estudo os animais foram condicionados às estimulações, porém a taxa de obtenção de ejaculados foi baixa. Contudo, a análise dos parâmetros físicos e morfofuncionais dos ejaculados obtidos mostrou altas porcentagens de espermatozóides móveis e com movimentos progressivos retilíneos com progressão boa à rápida. Somente os parâmetros concentração e espermatozóides com membrana plasmática íntegra foram menores do que o descrito para o gênero. A integridade do acrossomo e grau de atividade mitocondrial foram descritos pela primeira vez para a espécie e apresentaram alta porcentagem de integridade. O tratamento com a tripsina não foi eficaz na dissolução do coágulo nas concentrações de 0,5, 1 ou 5%, mas também não causou danos significativos aos espermatozóides. A dosagem de cortisol sérico demonstrou haver uma resposta aguda e não duradoura ao estresse logo após o procedimento de colheita de sêmen. O maior sucesso no emprego da vibroestimulação peniana para colheita de sêmen de macacos de cheiro parece depender de ajustes nas técnicas de contenção e estimulação, sazonalidade reprodutiva e contato olfativo com as fêmeas. / The squirrel monkeys (S. scireus) are very active neotropical primates, who get easily stressed in captivity. The semen collection and evaluation methods in this species have not been standardized to make possible their reproduction in different breeding centers. The semen turns into a firm coagulum immediately after the ejaculation, and, so far, any method was able to dissolve it completely. Therefore, the aim of this study was to evaluate the conditionment of S. sciureus to the semen collection method through the penile vibrostimulation with the assistance of behavioural observation and serum cortisol. Another objective was to analyze the semen of these animals through physical and morphofunctional tests, with and without the use of proteolytic enzymes to dissolve the semen coagulum. The study was performed in twelve male adults, hosted in couples, in a controlled environment. The training for the penile vibrostimulation was made through the positive reinforcement technique, with food reward. To dissolve the semen coagulum, it was made use of trypsin, at three doses and two incubation periods. Cortisol was measured through radioimmunoassay in serum samples. For this study, the animals were conditioned to the stimulations, though the semen attainment rate was low. Therefore, the analysis of the physical and morphofunctional semen parameters resulted in high percentages of mobile spermatozoa, with a straight-line progressive movement (good to fast progression). Only the parameters concentration and integrity of sperm plasma membrane were lower than the pattern for this genus. The achrossome integrity and the mitochondrial activity were described for the first time for this species and presented high integrity percentage. The treatment with trypsin was effective in dissolving the coagulum in concentrations of 0.5, 1 or 5%, but did not bring significant hazard to the spermatozoa. Measurement of serum cortisol showed an acute and not durable response to stress immediately after semen collection proceedings. The biggest success in the employment of the penile vibrostimulation in the collection of the squirrel monkey semen seems to depend on the handling and stimulation techniques, reproductive seasonality and contact with the female´s smell.