Campylobacter jejuni é a espécie bacteriana mais comumente relacionada como causa de gastroenterite em humanos em vários países. Porém, o isolamento e o estudo de C. jejuni não são muito frequentes no Brasil, o que dificulta avaliar a dimensão dessa bactéria como causadora de doença em humanos e animais, bem como, determinar o impacto de sua presença em alimentos e no meio-ambiente. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diversidade genética por cinco diferentes técnicas de tipagem molecular, o potencial patogênico pela pesquisa de 16 genes de virulência por PCR e o perfil de resistência pela concentração inibitória mínima por Etest® frente a quatro antimicrobianos e pela análise in silico de genes de resistência e pontos de mutação de linhagens de C. jejuni isoladas no Brasil. Foram estudadas 121 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos (51), animais (35), alimentos (33) e ambiente (02) nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul, no período de 1996 a 2016. Todas as linhagens apresentaram os genes flaA, flhA, iamA, docA, ciaB, cdtA, cdtB, cdtC, racR, dnaJ, pldA, cadF, sodB e csrA. O gene wlaN foi detectado em 15 linhagens, e uma linhagem apresentou o gene virB11. Dentre as 121 linhagens estudadas, 68 linhagens foram resistentes a pelo menos um dos antimicrobianos testados. A resistência à ciprofloxacina, doxiciclina, tetraciclina e eritromicina foi observada em 43,8%, 34,7%, 34,7% e 4,9% das linhagens, respectivamente. O dendrograma de similaridade genética de Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) agrupou as 121 linhagens estudadas em três grupos com similaridade genômica de 46,9% entre eles. Apesar da alta diversidade genômica entre as linhagens estudadas, algumas linhagens isoladas de diferentes fontes, locais e anos, apresentaram uma similaridade genotípica acima de 80% entre elas e, foram agrupadas em 21 subgrupos. Pelas sequências da SVR do gene flaA as linhagens estudadas foram agrupadas em dois grupos com linhagens isoladas de fontes clínicas e não clínicas e de humanos e animais com similaridade acima de 80,9 % entre elas e tipadas em 40 SVR-flaA alelos, sendo os alelos 57, 49 e 45 os mais frequentemente detectados. A análise do locus CRISPR por HRMA tipou as linhagens de C. jejuni em 23 diferentes variantes sendo que algumas variantes continham linhagens de origem clínica e não clínica e de humanos e animais. A árvore de SNPs gerada a partir dos dados do sequenciamento do genoma completo alocou as 116 linhagens sequenciadas em dois principais grupos. O grupo SNP-A agrupou 97 linhagens e o grupo SNP-B agrupou 19 linhagens, com linhagens de fontes clínicas e não clínicas e de humanos e animais, respectivamente. A técnica de Multilocus sequence typing (MLST) tipou as 116 linhagens de C. jejuni em 46 STs, e não foi observada a predominância de um ST. O índice de discriminação das metodologias de análise de SNPs no genoma completo, PFGE, MLST, sequenciamento das SVR do gene flaA e análise do locus CRISPR por HRMA foi 1,0, 0,982, 0,941, 0,939 e 0,874, respectivamente. Na análise in silico de genes de resistência e pontos de mutação, 95 linhagens apresentaram ao menos um gene de resistência ou ponto de mutação conhecido, sendo que a porcentagem de correlação entre os resultados de resistência fenotípicos e genotípicos foi maior que 66,7%; 94,6% e 96,8% para eritromicina, tetraciclina e ciprofloxacina, respectivamente. Conclui-se que a alta frequência da maioria dos genes de virulência pesquisados evidenciou o potencial patogênico das linhagens de C. jejuni estudadas. A resistência a antimicrobianos de primeira escolha utilizados para o tratamento da campylobacteriose encontrada nas linhagens estudadas é preocupante, podendo levar à falha terapêutica quando o tratamento é necessário. Os resultados obtidos pelas metodologias de tipagem molecular realizadas sugerem que uma possível contaminação possa ter ocorrido entre fontes clínicas e não clínicas e entre humanos e animais, ao longo de 20 anos no Brasil. Pelo índice de discriminação, foi observado que as metodologias de análise de SNPs no genoma completo e PFGE, em comparação com as outras técnicas de tipagem, foram as mais eficientes em discriminar as linhagens de C. jejuni do presente estudo. / Campylobacter jejuni is the most commonly bacterial species related as a cause of gastroenteritis in humans in several countries. However, the isolation and the study of C. jejuni have not been very frequently in Brazil, which makes it difficult to evaluate the involvement of this bacterium as a cause of diseases in humans and animals, as well as to determine the impact of its presence in food and the environment. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity by five different molecular typing techniques, the pathogenic potential by searching for the presence of 16 virulence genes by PCR and the resistance profile by the minimum inhibitory concentration by Etest® against four antibiotics and by the in silico analyses of resistance genes and mutation points of C. jejuni strains isolated in Brazil. A total of 121 C. jejuni strains isolated from humans (51), animals (35), food (33) and the environment (02) in the States of Minas Gerais, Sao Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul, between 1996 to 2016 were studied. All strains presented the genes flaA, flhA, iamA, docA, ciaB, cdtA, cdtB, cdtC, racR, dnaJ, pldA, cadF, sodB and csrA. The wlaN gene was detected in 15 strains, and one strain presented the virB11 gene. Among the 121 strains studied, 68 strains were resistant to at least one of the antibiotics tested. Resistance to ciprofloxacin, doxycycline, tetracycline and erythromycin was observed in 43.8%, 34.7%, 34.7% and 4.9% of the strains, respectively. The Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) dendrogram of genetic similarity clustered the 121 strains studied in three groups with a genomic similarity of 46.9% among them. Despite the high genomic diversity among the strains studied, some strains isolated from different sources, places and years, presented a genotypic similarity above 80% among them and were grouped into 21 subgroups. By flaA-SVR sequencing the strains studied were clustered into two groups with strains isolated from clinical and non-clinical sources and from humans and animals with a similarity above 80.9% among them and typed in 40 flaA-SVR alleles, being the alleles 57, 49 and 45 the most frequently detected. The analysis of the CRISPR locus by HRMA typed the C. jejuni strains in 23 different variants, with some variants containing strains from clinical and non-clinical origin and from humans and animals. The SNP tree generated from the whole genome sequencing data grouped the 116 strains sequenced into two major groups. SNP-A grouped 97 strains and SNP-B grouped 19 strains, with strains from clinical and non-clinical sources and from humans and animals, respectively. Multilocus sequence typing (MLST) technique typed the 116 C. jejuni strains in 46 STs, and it was not observed a predominant ST. The discrimination index of the analysis of SNPs in the whole genome, PFGE, MLST, flaA-SVR sequencing and analysis of the CRISPR locus by HRMA was 1.0, 0.982, 0.941, 0.939 and 0.874, respectively. In the in silico analyses of resistance genes and mutation points, 95 strains showed at least one resistance gene or known mutation point, and the percentage of correlation between phenotypic and genotypic resistance results was greater than 66.7%; 94.6% and 96.8% for erythromycin, tetracycline and ciprofloxacin, respectively. In conclusion, the high frequency of the majority of the virulence genes studied highlighted the pathogenic potential of the C. jejuni strains studied. Resistance to antimicrobials of first choice used for the treatment of campylobacteriosis found in the strains studied is worrying and may lead to therapeutic failure when treatment is required. The results obtained by the molecular typing methodologies performed suggest that a possible contamination may have occurred between clinical and non-clinical sources and between humans and animals over 20 years in Brazil. By the discrimination index, it was observed that the methodologies of analysis of SNPs in the whole genome and PFGE, in comparison to the other typing techniques, were the most efficients in discriminating the C. jejuni strains of the present study.

Avanços recentes na etiologia da puberdade precoce foram obtidos a partir da análise do genoma por sequenciamento global. Mutações inativadoras do gene MKRN3 representam uma causa importante de puberdade precoce central (PPC) familial (33-46% dos casos). O objetivo do estudo foi a análise do DNA genômico de pacientes com PPC de origem familial ou esporádica sem mutações deletérias no gene MKRN3. Foram selecionados 68 indivíduos com PPC (37 com a forma familial e 31, aparentemente, esporádicos). O DNA genômico foi extraído do sangue periférico ou da saliva dos pacientes com PPC. A técnica de sequenciamento genômico em larga escala (ILLUMNA -Clonal Single Molecule Array Technology - CSMA) foi usada na busca de novos genes implicados com o desenvolvimento puberal prematuro em seis indivíduos, sendo três afetados e três não afetados, pertencentes a uma grande família brasileira com PPC (Família 1). Mutações em um gene candidato foram pesquisadas em 64 pacientes por sequenciamento automático direto (método de Sanger). Em um subgrupo de pacientes, foi realizada a técnica de MLPA com sondas customizadas na busca de deleções. Por sequenciamento genômico global, foi identificado um novo complexo rearranjo no gene DLK1, caracterizado por uma deleção de, aproximadamente, 14.000 pb na região 5\' não traduzida (5\'UTR), englobando o início do exon 1, associada a uma duplicação de uma região do intron 3 de 269 pb. O gene DLK1 está localizado no braço longo do cromossomo 14 (14q32.2) e sofre imprinting materno. Este lócus está associado à síndrome de Temple, uma doença complexa com múltiplas manifestações, incluindo puberdade precoce central em até 90% dos casos. Para investigar o efeito dessa deleção genômica, as concentrações séricas da proteína DLK1 pelo método ELISA foram medidas nas pacientes afetadas da Família 1. Valores indetectáveis de DLK1 foram encontrados nestas pacientes. O fenótipo das pacientes afetadas da Família 1 caracterizou-se por uma PPC típica, sem sinais sindrômicos (excluída a síndrome de Temple). Posteriormente, por meio do sequenciamento direto, duas novas mutações inativadoras no gene DLK1 foram identificadas (p.Val272Cysfs*14 e p.Pro160Leufs*50) em duas famílias (Famílias 2 e 3) com PPC ou história de menarca precoce. O estudo de segregação nas Famílias 1 e 2 confirmou o padrão de herança autossômico dominante com penetrância completa e transmissão exclusiva pelo alelo paterno. A média de idade de início da puberdade nas pacientes afetadas do sexo feminino foi de 5,4 anos. A técnica de MLPA com sondas customizadas para o gene DLK1 não encontrou outras deleções no subgrupo estudado. Em conclusão, foram identificadas três mutações inativadoras no gene DLK1 associadas à PPC familial de origem paterna. O DLK1 é o segundo gene imprintado associado a distúrbios puberais em humanos. Este achado sugere um papel dos genes imprintados no controle da puberdade. O mecanismo pelo qual esse gene afeta a puberdade ainda é desconhecido / Recent advances in the etiology of precocious puberty were obtained from the whole-genome sequencing analysis. Inactivating mutations of the MKRN3 gene represent a major cause of familial central precocious puberty (CPP) (33%- 46% of the cases). The objective of the study was to analyze the genomic DNA of patients with familial or sporadic CPP without deleterious mutations in the MKRN3 gene. Sixty-eight individuals with CPP (37 with familial form and 31 apparently sporadic cases) were selected. The genomic DNA was extracted from the peripheral blood or saliva of patients with CPP. We used the whole-genomic sequencing technique (ILLUMNA - Clonal Single Molecule Array Technology - CSMA) searching for a new candidate genes implicated in premature pubertal development in 6 individuals, 3 affected and 3 non-affected, belonging to a large Brazilian family with CPP (Family 1). Mutations in one candidate gene were investigated in 64 patients through automatic sequencing (Sanger\'s method). In a subgroup of patients, MLPA using synthetic MLPA probes was performed to search for deletions. A new complex rearrangement in the DLK1 gene characterized by a deletion of approximately 14.000pb in the 5\' untranslated (5\'UTR), encompassing the start of exon 1, associated with a duplication of a region of intron 3 of 269 bp was identified by whole-genomic sequencing. The DLK1 gene is located on the long arm of chromosome 14 (14q32.2) and it is maternally imprinted gene. This locus is associated with Temple syndrome, a complex disorder with multiple alterations, including central precocious puberty in up to 90% of cases. To investigate the effect of this genomic deletion, a serum measurement of DKL1 protein using ELISA method was performed in the affected patients from Family 1. Undetectable serum DLK1 levels were found in these patients. The phenotype of affected patients from Family 1 was characterized by a typical CPP, without syndromic signs (excluding Temple syndrome). Posteriorly, two new inactivating mutations in the gene DLK1 were identified (p.Val272Cysfs*14 and p.Pro160Leufs*50) through direct sequencing in two families (Families 2 and 3) with CPP or precocious menarche history. The segregation studies in Families 1 and 2 confirmed the pattern of dominant autosomal inheritance with complete penetrance and exclusive transmission by the paternal allele. The average age of puberty onset in the affected female patients was 5.4 years. The MLPA technique with synthetic MLPA probes for the DLK1 gene did not find other deletions in the studied subgroup. In conclusion, we identified 3 paternally inherited inactivating mutations in the DLK1 gene associated with familial CPP. The DLK1 is the second imprinted gene associated with pubertal disorders in humans. This finding suggests a role of the imprinted genes in puberty control. The mechanism through which this gene affects puberty is still unknown

As espécies do Complexo Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii (ACB) são importantes causadoras de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde em todo o mundo. Detêm maior relevância os isolados com resistência aos antimicrobianos, os quais impactam negativamente no prognóstico, na mortalidade e custos associados ao cuidado com o paciente. O objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade genética e o perfil de susceptibilidade antimicrobiana de 134 isolados multirresistentes de A. baumannii presentes no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, entre 2007 e 2014. A identificação de A. baumannii deu-se pela pesquisa dos genes blaOXA-51-like e gltA, detectados em 85% (n=114) dos isolados Os isolados de Acinetobacter não-baumannii foram identificados por sequenciamento gênico como A. nosocomialis (n=4; 3,1%), A. pittii, A. bereziniae (n=2; 1,7%, cada), A. ursingii, A. variabilis, A. gyllenbergii (n=1; 0,9% cada) e Acinetobacter spp (n=2; 1,7%). Os isolados de A. baumannii foram submetidos às técnicas de PCR multiplex para detecção de outras oxacilinases, pesquisa de ISAba1, teste de susceptibilidade antimicrobiana, tipagem molecular por eletroforese em campo pulsado (PFGE), por sequência trilocus (3LST) e por sequência multilocus (MLST). Detectou-se o gene blaOXA-23-like em 105 isolados (92,1%), estando 100% associados a ISAba1; blaOXA-72 em um isolado (0,9%) e blaOXA-231 em dois isolados (1,7%). A maior parte (n=66; 57,9%) dos isolados foi classificada como extensivamente resistentes (XDR). O PFGE agrupou os isolados em 11 clusters (A-K) e o MLST identificou os isolados pertencentes majoritariamente aos clones CC79 (42,4%), CC1 (16,6%), CC15 (12,1%) e ao ST317 (18,2%). Os resultados do MLST e 3LST concordaram em 95,6%. Foi verificada a ocorrência de diferentes perfis de PFGE em A. baumannii MDR e XDR, predominando cepas carreadoras de ISAba1/OXA-23-like e pertencentes aos CC1, CC15, CC79, ST317. Predominaram o ST317 nos anos iniciais e o CC79 (ST730) de 2011 a 2014. Estes resultados fornecem subsídios que ressaltam a necessidade de monitoramento e controle de patógenos multirresistentes / Species of Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii Complex (ACB) are important causes of Healthcare Associated Infections worldwide. More relevant are isolates with antimicrobial resistance, which have a negative impact on the outcome, mortality and costs associated with patient care. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity and the antimicrobial susceptibility profile of 134 multiresistant ACB spcies strains present at Botucatu Medical School Teaching Hospital between 2007 and 2014. Identification of A. baumannii species was by detection of blaOXA-51-like and gltA genes, detected in 85% (n=114) of the isolates. Non-baumannii Acinetobacter species were identified by gene sequencing as A. nosocomialis (n=4, 3.1%), A. ursingii, A. variabilis, A. gyllenbergii (n=1, 0.9% each) and Acinetobacter spp (n=2; 1.7%). A. baumannii isolates were submitted to multiplex PCR for other oxacillinases and ISAba1 detection, antimicrobial susceptibility testing, molecular typing by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), trilocus sequence typing (3LST) and multilocus sequence typing (MLST). blaOXA-23-like gene was detected in 105 isolates (92.1%), of which 100% were associated with ISAba1; blaOXA-72 was present in one isolate (0.9%) and blaOXA-231, in two isolates (1.7%). The majority (n=66; 57.9%) of isolates were classified as extensively resistant (XDR). The PFGE grouped the isolates into 11 clusters (A-K) and MLST identified the isolates belonging mainly to CC79 (42.4%), CC1 (16.6%), CC15 (12.1%) and ST317 (18.2%). MLST and 3LST results were 95.6% concordant. We verified the occurrence of different PFGE profiles in multidrug-resistant (MDR) and extensively drug-resistant (XDR) A. baumannii, predominantly presenting ISAba1/OXA-23-like genes and belonging to CC1, CC15, CC79 and ST317. There was a prevalence of ST317 in the early years and CC79 (ST730) from 2011 to 2014. Our results highlight the importance of surveillance and control of multiresistant pathogens

Introdução: A variação genética em genes que codificam a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de medicamentos frequentemente afeta a farmacocinética da droga e resulta na variabilidade da eficácia e segurança do medicamento. No entanto, a frequência da variação genética nos genes ADME diferem entre as populações. O objetivo deste estudo foi analisar as variações genéticas nos genes ADME nos pacientes brasileiros portadores do vírus da hepatite C e comparar com outros bancos de dados (1000 Genomes Project e Exome Aggregation Consortium). Métodos: Um total de 147 genes ADME foram genotipados em 100 amostras por sequenciamento de DNA genômico usando SureSelectXT (Agilent) e MiSeq, NextSeq (Illumina). Resultados: Um total de 2004 SNPs em 147 genes foram analisados, incluindo enzimas de fase I (n=50), enzimas de fase II (n=37) e transportadores (n=60). Uma coleção de variantes genéticas indica que há pelo menos 2 vezes mais variações do que semelhanças entre os pacientes com hepatite C e os principais grupos continentais. Estas diferenças foram observadas em vários genes relevantes, incluindo CYP1A2, CYP3A4, NAT2, ABCB1 e SLCO1B1. Além disso, pacientes auto declarados como branco, pardo, negro e asiático também apresentaram diferenças de frequência alélica quando comparados à europeus, americanos mixos, africanos e asiáticos nos polimorfismos dos genes CYP1A1, CYP2B6, GSTP1 e ABCG2, respectivamente. Conclusão: Concluímos que os pacientes com hepatite C tem uma frequência alélica de genes ADME diferente dos outros bancos de dados. Embora a personalização do tratamento medicamentoso com base no genótipo individual, e não na etnia, possa ser a mais apropriada, as diferenças nas frequências alélicas entre os continentes devem ser consideradas ao projetar ensaios clínicos de novos medicamentos / Background: Genetic variation in genes encoding drug absorption, distribution, metabolism, and excretion (ADME) proteins often affects the drug pharmacokinetics and results in variability in drug efficacy and safety. However, the frequency of genetic variation in the ADME genes differ among populations. The aim of this study was to analyze the genetic variations in the ADME genes in Brazilian patients with hepatitis C and to compare to other databases (1000 Genomes Project e Exome Aggregation Consortium). Methods: A total of 147 ADME were genotyped in 100 samples from Brazil by targeted genomic DNA sequencing using SureSelectXT (Agilent) and MiSeq, NextSeq (Illumina). Results: A total of 2004 SNPs in 147 genes that were analyzed, including phase I enzymes (n=50), phase II enzymes (n=37), drug transporters (n=60). We provide a collection of genetic variants that indicate that there are at least 2-times more variation than similarities between patients with hepatitis C and major continental groups. These differences were observed in several relevant genes including CYP1A2, CYP3A4, NAT2, ABCB1 and SLCO1B1. Moreover, white, brown, black and Asian self-reported patients also showed allele frequency differences when compared to European, mixed American, African and Asian for polymorphisms of the genes CYP1A1, CYP2B6, GSTP1 and ABCG2. respectively. Conclusion: We conclude that the hepatitis C patients has an allele frequency of ADME genes different from other data bases. While personalization of drug treatment based on individual genotype rather than ethnicity may be more appropriate, differences in allelic frequencies across continents should be considered when designing clinical trials of new drugs

Introdução: A miopatia centronuclear é uma doença muscular congênita com apresentação clínica heterogênea, caracterizada histologicamente pela proeminência de fibras musculares com núcleos centralizados. Três formas são reconhecidas: neonatal grave, com herança ligada ao X e envolvimento do gene MTM1; autossômica dominante, com início geralmente tardio e curso mais leve, associada a mutações no gene DNM2; e autossômica recessiva, com gravidade intermediária entre as outras formas e envolvimento dos genes BIN1, RYR1 ou TTN. Apesar da identificação dos principais genes responsáveis pela doença, os métodos usuais de diagnóstico genético não encontram mutações em cerca da metade dos casos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi a caracterização clínica, histológica e molecular de pacientes brasileiros portadores de miopatia centronuclear. Métodos: Laudos de dois bancos de biópsia muscular foram usados para identificar pacientes com diagnóstico de miopatia centronuclear nos últimos dez anos. As lâminas das biópsias foram revisadas e analisadas, e as famílias correspondentes convocadas para aplicação de protocolo clínico e coleta de sangue periférico para extração de DNA genômico. As famílias foram estudadas para os genes conhecidos por sequenciamento Sanger, MLPA, painel de genes implicados em doenças neuromusculares ou sequenciamento de exoma. Resultados: Foram convocados 24 pacientes provenientes de 21 famílias, em 16 das quais foi possível estabelecer o diagnóstico molecular. As 7 famílias com a forma neonatal grave constituíam um grupo homogêneo clínica e histologicamente, e mutações novas e conhecidas foram encontradas no gene MTM1 em 6 destas. Dois meninos deste grupo, com evolução estável, tiveram óbito súbito por choque hipovolêmico subsequente a rompimento de cisto hepático. O gene MTM1 também foi implicado em uma menina portadora manifestante, com quadro mais leve, na forma de uma macrodeleção em heterozigose, detectada por MPLA. Duas famílias em cuja histologia foram encontradas fibras com aspecto em \"roda de carroça\" apresentaram mutações no gene DNM2, uma das quais, p.Phe372Cys, nunca havia sido descrita. Em 7 famílias, o gene RYR1 foi o responsável, em todas sob a forma de heterozigose composta, com 14 mutações, das quais 13 novas, encontradas ao longo de todo o gene. Este grupo, apesar de heterogêneo clinicamente, apresentou em comum a presença de falhas focais na atividade oxidativa das fibras musculares na maioria dos indivíduos. O gene TTN está provavelmente implicado em uma família com um único afetado, no qual o sequenciamento de exoma mostrou mutação nula em heterozigose composta. Nesta coorte de pacientes brasileiros, não houve famílias com alterações no gene BIN1, e três famílias seguem sem diagnóstico molecular, com prováveis novos genes implicados. Conclusões: Os achados clínicos e histológicos de pacientes brasileiros com miopatia centronuclear seguem os padrões descritos na literatura, e em conjunto podem direcionar o estudo molecular adequado. Nesta coorte de pacientes, o gene RYR1, estudado por sequenciamento de alto débito de exoma, foi o mais frequentemente acometido, sugerindo que sua implicação na miopatia centronuclear vem sendo subestimada. Novas mutações encontradas nos genes MTM1, DNM2 e RYR1 contribuíram para confirmar regiões de patogenicidade e ampliar o espectro de alterações nestes genes / Introduction: Centronuclear myopathy is a heterogeneous congenital muscle disease, characterized by the prominence of centralized nuclei in muscle fibers. Three disease forms are recognized: a severe neonatal, X-linked form caused by mutations in the MTM1 gene; an autosomal dominant, late-onset milder form, associated to the DNM2 gene; and an autosomal recessive form, with intermediate severity, so far with the BIN1, RYR1 or TTN genes implicated. In spite of the identification of these genes, usual molecular diagnostic methods don\'t yield a molecular diagnosis in about half of cases. Objetives: The aim of this work was to study clinical, histological, and molecular aspects of centronuclear myopathy Brazilian patients. Methods: Reports taken from two muscle biopsy banks were used to identify centronuclear myopathy patients in the last ten years. Biopsy slides were reviewed and analyzed, and corresponding families recruited to apply a clinical protocol and to draw peripheral blood to extract genomic DNA. Families were studied for known genes via Sanger sequencing, MLPA, panel of genes implicated in neuromuscular diseases, or exome sequencing. Results: Twentyfour patients out of 21 families were recruited, and in 16 families molecular diagnosis was established. The 7 families with the severe neonatal form amounted to a clinically and histologically homogeneous group, and mutations, both known and novel, were found in the MTM1 gene in 6 of these. Two boys of this group, with a stable course, died suddenly of hypovolemic shock due to a hepatic cyst rupture. The MTM1 gene was also implicated in the case of a mild manifesting carrier girl with a heterozygous macrodeletion detected via MLPA. Two families whose histology contained fibers with a \"spoke of wheels\" aspect had mutations in the DNM2 gene, one of which, p.Phe372Cys, had never been described. In 7 families, the RYR1 gene was the culprit, in all of them in a compound heterozygous state, with 14 mutations, 13 of which novel, found throughout the length of the gene. This group, despite clinically heterogeneous, had in common the presence of focal disruptions in the oxidative activity of muscle fibers in the majority of individuals. The TTN gene is probably implicated in a family with a single affected, whose exome sequencing showed compound heterozygous null mutations. In this cohort of Brazilian patients, no family was found to have alterations in the BIN1 gene, and three families remain without molecular diagnosis, with probable new implicated genes. Conclusions: Clinical and histological findings of Brazilian patients with centronuclear myopathy follow patterns already described in the literature, and taken as a whole can direct the adequate molecular study. In this patient cohort, the RYR1 gene, sequenced though hight-throughput techniques, was the most frequently involved, suggesting that its implication in centronuclear myopathy is underestimated. Novel mutations found in the MTM1, DNM2 and RYR1 genes contributed to confirm pathogenic regions and expand the spectrum of alterations in these genes

Rearranjos genômicos são alterações estruturais na molécula de DNA e podem ser a causa de inúmeras doenças genéticas. O mecanismo gerador dessas alterações é bem variável. Ele pode ser recorrente, por intermédio de low copy repeats (LCRs), resultando num rearranjo causado por recombinação homóloga não-alélica (NAHR), ou não recorrente, ou seja, sem intermédio de um hotspot. Dentre os mecanismo não recorrentes temos: a junção das extremidades não-homólogas (NHEJ - non-homologous end joining) e a junção mediada por micro-homologia (MMEJ - microhomology-mediated end joining), a replicação em série por deslizamento (SRS), a SRS induzida por quebra (BISRS), a replicação induzida pela quebra de DNA por homologia (MMBIR - microhomology-mediated break induced replication), o enrolamento da forquilha de replicação e mudança de molde de DNA (FoSTeS - fork stalling and template switching). A análise dos pontos de quebra dos rearranjos genômicos pode fornecer informações importantes para uma maior compreensão da arquitetura genômica e seu papel na geração das anormalidades estruturais. O objetivo deste trabalho foi sequenciar os pontos de quebra genômicos a fim de identificar o mecanismo formador das alterações encontradas. Para isso, investigamos o panorama estrutural de 10 pacientes por sequenciamento por meio de linked reads (10X Genomics) e sequenciamos os pontos de quebra previamente identificados por array CytoSNP-12 (Illumina) de 12 pacientes com rearranjos genômicos estruturais por utilizando a captura por Nextera Rapid Capture (Illumina). A investigação por linked reads revelou rearranjos estruturais em 5 pacientes, destacando translocações encontradas em dois pacientes, impossíveis de serem detectadas por metodologias de sequenciamento que não envolva long reads. Foi possível sugerir os mecanismos causadores dessas alterações como NHEJ. O sequenciamento após a captura por Nextera foi capaz de identificar elementos que permitiram definir o mecanismo em três pacientes (NAHR E FoSTeS/MMBIR) e sugerir em mais dois pacientes (NHEJ). Com a estratégia utilizada foi possível sequenciar pontos de quebra por meio do flanqueamento das regiões identificadas por array, identificar os elementos genômicos presentes nos pontos de quebra e os mecanismos formadores dessas alterações / Genomic rearrangements are structural changes in the DNA molecule and can be the cause of numerous genetic diseases. The mechanisms that generate these alterations can occur in different ways. It can be recurrent, mediated by low copy repeats (LCRs), resulting in a rearrangement cause by non-alellic homologue recombination (NAHR), or non-recurrent, without a hotspot. Among non-recurrent mechanisms there are: non-homologous end joining (NHEJ), microhomology-mediated end joining (MMEJ), serial replication slippage (SRS), break-induced serial replication slippage (BISRS), microhomology-mediated break induced replication (MMBIR) and fork stalling and template switching (FoSTeS). Analysis of the breakpoints of genomic rearrangements may provide important information for a better understanding of genomic architecture and its role in generating structural abnormalities. The aim of this work was to sequence the genomic breakpoints in order to identify the mechanism that formed the alterations found. To do this, we investigated the genomic structure of 10 patients by linked reads (10X Genomics) sequencing and sequenced the breakpoints previously identified by Illumina CytoSNP-12 array of 12 patients with structural genomic imbalances by using Nextera Rapid Capture (Illumina). The research by linked reads revealed structural rearrangements in 5 patients, highlighting translocations found in two patients, impossible to be detected by sequencing methodologies that did not involve long reads. It was possible to suggest the mechanisms causing these changes as NHEJ. The sequencing after capture by Nextera was able to identify elements that allowed us to determine the formation mechanism in three patients (NAHR and FoSTeS / MMBIR) and to suggest in two patients (NHEJ). With the approach employed here, it was possible to sequencing breakpoints by flanking the regions identified by array, identifying the genomic elements present at breakpoints and the formation mechanisms of the alterations

Introdução: O diabetes monogênico corresponde de 1% a 2% de todos os casos de diabetes mellitus, sendo causado por variantes em um único gene. Dentre esses, o mais comum é o MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young), havendo, porém, diversas formas mais raras, como diabetes neonatal e sindrômico que podem estar associadas a outras comorbidades além do diabetes, bem como às lipodistrofias hereditárias. O diagnóstico genético permite a adequação do tratamento, seguimento clínico e aconselhamento familiar. Objetivos: (1) desenvolver e implantar um painel customizado de sequenciamento em larga escala para o diagnóstico genético-molecular das formas raras de diabetes monogênico e lipodistrofias hereditárias; (2) estabelecer o diagnóstico genético de casos com suspeita clínica; (3) realizar a correlação genótipo-fenótipo. Métodos: Os pacientes foram selecionados de acordo com os critérios de inclusão para cada tipo de diabetes monogênico raro. A pesquisa genética dos casos-índice foi feita por sequenciamento em larga escala. A segregação familiar e confirmação dos achados foram feitas pelo método de Sanger. A análise de bioinformática foi realizada considerando o tipo de variante, frequência em bancos de dados populacionais, predição in silico e segregação familiar. Resultados: Foram analisados 42 casos, sendo que em 23 foram encontradas variantes candidatas: 6/16 com diagnóstico de diabetes neonatal, 2/2 com quadro clínico de Síndrome de Wolfram, 11/11 com suspeita de lipodistrofia congênita generalizada, 4/13 com lipodistrofia parcial familiar. Conclusões: Um painel customizado de sequenciamento em larga escala permitiu o diagnóstico genético-molecular de diabetes monogênico, com positividade de 22/42 casos analisados, sendo possível realizar a correlação genótipofenótipo. O diagnóstico genético possibilitou o aprimoramento do seguimento clínico dos pacientes e suas famílias. Permitiu, ainda, aumentar o número de diagnósticos de casos anteriormente subdiagnosticados / Introduction: Monogenic Diabetes accounts for 1 to 2% of all cases of diabetes mellitus. It is caused for variants in a single gene. Among these, the most common is MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young), but there are several other rare forms, which may be associated with other comorbidities besides diabetes. Genetic diagnosis can lead to appropriate treatment and follow-up, besides and family counseling. Objectives: (1) to develop a customized targeted massively parallel sequencing panel to sequence the rare types of monogenic diabetes; (2) To establish the genetic diagnosis of probands with clinical suspicion of monogenic diabetes; (3) To correlate their phenotype with genetic findings, leading to a better understanding of rare monogenic diabetes subtypes. Methods: Patients were selected according to the inclusion criteria for each type of rare monogenic diabetes. Genetic research of index cases was done by massively parallel sequencing. Family segregation and confirmation of the variants findings were done by Sanger method. Bioinformatics analysis was performed considering the type of variant, frequency in population databases, in silico prediction and family segregation. Results: We analyzed a total of 42 cases. We found 22 candidate causal variants: 6/16 in probands with Neonatal Diabetes, 2/2 with Wolfram Syndrome, 11/11 with suspected Generalized Congenital Lipodystrophy, and 4/13 with Familial Partial Lipodystrophy. Conclusions: A customized targeted massively parallel sequencing panel allowed genetic diagnosis of rare types of monogenic diabetes, with a positivity of 23/42 cases analyzed, being possible to perform the genotype-phenotype correlation. The genetic diagnosis allowed the improvement of the clinical follow-up of the patients and their families. It also increased the number of diagnoses of previously underdiagnosed cases

Estudos de gêmeos e famílias demonstram que os transtornos do espectro do autismo (TEA) apresentam um grande componente genético (~50%), porém sua etiologia ainda é desconhecida, possivelmente devido aos TEA serem caracterizados como doenças complexas, poligênicas e multifatoriais. Recentemente, variações no número de cópias (CNVs, do inglês Copy Number Variations) e mutações pontuais (SNV, do inglês Single Nucleotide Variant) raras, de novo e herdadas foram associadas com TEA, sugerindo novos loci e genes candidatos. No entanto, a grande maioria das alterações descritas são individuais, de forma que analises por agrupamento das mesmas em genes, e busca de funções biológicas ou vias hiper-representadas tem sido uma abordagem para a compreensão dos possíveis mecanismos etiopatológicos dos TEA. Como os TEA são muito heterogêneos clinicamente o uso de endofenótipos específicos para agrupamento das alterações gênicas pode auxiliar a discriminação de vias e processos biológicos relacionados a dimensões fenotípicas. Considerando os estudos realizados em autismo, e a natureza das variações comuns e raras, nesse trabalho foi realizado o sequenciamento do exoma de 1 família de dois irmãos com TEA sindrômico (sequenciamento piloto) e 18 trios de casos esporádicos de TEA, em busca alterações muito raras e/ou de novo com provável impacto funcional nos pacientes; Além disso, foi analisado se existe diferença entre as vias biológicas hiper-representadas de redes gênicas crescidas a partir dos genes que apresentavam variações raras e de novo, comparando pacientes de TEA com: (1) pouca ou nenhuma comunicação, chamados de não verbais e (2) média a boa comunicação, chamados de verbais. No sequenciamento piloto da família dos irmãos com TEA sindrômico, encontramos 1 duplicação em 4p16.3 e 1 deleção em 8p23.3, em ambos os irmãos; alterações estas encontradas em estudos previos em pacientes com características sindrômicas e TEA; na análise de SNVs e Indels foi encontrada 1 variação de novo e 117 variações não-sinônimas raras herdadas de um dos pais na irmã e 150 variações não-sinônimas raras herdadas de um dos pais no irmão; a análise de vias revelou que os genes com as mutações pontuais raras estavam hiper-representados em regiões cromossômicas diferentes em cada irmão (no cromossomo 1 na paciente do sexo feminino e no cromossomo 16 no paciente do sexo masculino), o que pode estar relacionado às diferenças fenotípicas por eles apresentadas. No sequenciamento do exoma dos trios foram encontradas alterações de novo em 9 dos pacientes: 1 CNV de novo (deleção) de 1,5Mb na região 3q29, região previamente associada com síndrome e transtornos do desenvolvimento; e 8 genes alterados por mutações pontuais de novo, dos quais um dele é o GABBR2, que apresenta evidência de associação com TEA. A análise de vias e redes das variantes herdadas raras, mostrou que muitos dos genes relacionados aos dois grupos verbais e não verbais são genes já associados com TEA ou que apresentam interação com aqueles genes associados ao TEA. As analises de vias e redes precisam ser replicadas em amostras maiores, mas com nossos resultados preliminares podemos perceber que nosso estudo contribui com alterações em genes de vias relacionadas a neurogênese e sinaptogênese, independentemente do fenótipo, que possam refletir um conjunto de genes específicos e ou numero de alterações relacionadas a gravidade do TEA / Studies of twins and families have shown that autism spectrum disorders (ASD) are highly heritable (~50%), but its etiology is still unknown, possibly because it is a very heterogeneous phenotype and have multiple genes involved in its development, what characterizes a complex disease such as ASD. Recently, copy number variations (CNVs) and point mutations (SNVs) rare, inherited e de novo, were associated with ASD, suggesting new candidate genes and loci. Because they are very rare, the vast majority of the changes described are individual, so the analysis of different variations grouped by genes and searching for biological functions or hyper represented pathways has been an approach for understanding possible pathogenic mechanisms of ASD. As ASD is clinically very heterogeneous, the use of endophenotypes, specific grouping of genomic changes can help discriminating pathways and biological processes related to phenotypic dimensions. Considering the studies in autism, and the nature of common and rare variants, we sequenced all exons (exome) of 1 family with syndromic ASD (pilot sequencing) and 18 trios of sporadic ASD cases to search for de novo and rare variations with probable functional impact on Brazilian patients; Also, we analyzed whether there is a difference in the enrichment of biological pathways of gene networks from the list of genes affected with de novo and rare deleterious variants in two groups of ASD patients: (1) cases with little or no communication, called nonverbal and (2) cases with average to good communication, called verbal. In the pilot exome sequencing (ASD syndromic family), we found a duplication in 4p16.3 and a deletion in 8p23.3 in both siblings, alterations that were found in patients with syndromes and ASD in previously studies; the analysis of SNVs showed 1 variation de novo and 117 nonsynonymous rare variations inherited from only 1 of the parents in the female sibling, and 150 nonsynonymous rare variations inherited from only 1 of the parents in the male sibling; Pathway analysis revealed enrichment differences of chromosomal regions for each sibling (chromosome 1 for the female patient and chromosome 16 for the male patient), what may be related to their phenotypic differences. In the exome sequencing of trios, as expected, it was found de novo variation in 9 of the patients: 1 de novo CNV (deletion) of 1.5 Mb in the region 29 of the long arm of chromosome 3, a region previously associated with syndrome and developmental disorders; and 8 genes altered by de novo variations, one of those is in the GABBR2, gene with previous evidence of association with ASD. The pathways and networks analysis of rare inherited variants showed that many of the genes related to the two groups verbal and nonverbal are already associated with ASD or interacts with those genes associated with ASD. This pathway and gene network analyses need to be replicated in larger samples, but our preliminary results shows that our study contributes with variations in genes related to neurogenesis and synaptogenesis pathways, regardless of phenotype, with probable impact to specific genes that may be related to severity of clinical presentation

A síndrome de Bloom (SB) é uma síndrome de instabilidade cromossômica rara, transmitida por herança autossômica recessiva. Caracteriza-se por deficiência de crescimento pré e pós-natal, microcefalia, hipoplasia malar, eritema telangiectásico em face e comprometimento do sistema imunológico, entre outras manifestações clínicas. Os pacientes com SB apresentam predisposição aumentada para o desenvolvimento de neoplasias em idade precoce, sendo esta, a principal causa de óbito. Ao estudo citogenético observa-se aumento de quebras cromossômicas espontâneas e trocas entre cromátides irmãs (TCI), que são utilizadas como marcador diagnóstico para a SB. Além disso, a literatura mostra que a maioria dos pacientes também apresenta mutações no gene BLM, que estão relacionadas a defeitos no mecanismo de reparo do DNA. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos não são completamente compreendidos. Nesse sentido estudamos o transcriptoma de duas pacientes portadoras da síndrome de Bloom e de três controles utilizando a metodologia RNA-seq (Illumina, Inc., San Diego, CA). A análise de expressão diferencial revelou 216 genes diferencialmente expressos relacionados a vias relacionadas à resposta imune como replicação negativa da regulação da replicação do genoma viral, regulação positiva da proliferação de células B, via de sinalização mediada por interferon gama, ativação de células B, resposta a vírus, resposta imune adaptativa e processo efetor imune, e nenhuma diferença da expressão em genes de reparo de DNA. Concomitantemente, observamos a hiperexpressão do gene BLM para ambas as pacientes, contribuindo para a desestabilização de genes envolvidos em vias imunológicas, fenômeno também observado em alguns tumores. Dessa forma, sugerimos que a combinação de defeitos de proliferação linfocitária e defeitos de sinalização celular somados a outros, como perda celular e expressão alterada do gene BLM, podem contribuir diretamente para as principais características observadas na síndrome de Bloom, como a deficiência de crescimento e o elevado risco de câncer. Futuramente, o estudo do transcriptoma, aplicado a outros portadores da SB e outras síndromes de instabilidade, possibilitará uma análise mais acurada das interações gênicas relevantes para a desestabilização do genoma / Bloom Syndrome (BS) is a rare chromosome instability syndrome, with recessive autosomal inheritance. The main clinical manifestations are pre and postnatal growth deficiency, microcephaly, malar hypoplasia, telangiectasic facial erythema and compromised immune system, among others. Patients with BS present increased risk to the development of neoplasias at an early age, which is the main cause of death. Cytogenetic test is used as a diagnostic marker for BS since the patient\'s cells present increase in spontaneous chromosomal breaks and sister chromatid exchange (SCE). In addition, the literature reveals that most patients also present mutations in the BLM gene, which are related to defects in the DNA repair mechanism; however, it is still not completely understood. In this sense, we studied the transcriptome of two patients with Bloom\'s syndrome and three controls using the RNA-seq methodology (Illumina, Inc., San Diego, CA). Differential expression analysis revealed 216 differentially expressed genes related to immunological pathways such as: negative replication of the regulation of the viral genome replication, positive regulation of B cells proliferation, gama-interferon mediated signalization pathway, B cells activation, virus response, adaptive immune response and immune effector process, and absence of difference of DNA repair genes expression. At the same time, we observed the hyperexpression of the BLM gene for both patients contributing for the destabilization of genes involved in immunological pathways, a phenomenon also observed in some tumors. Thus, we suggest that the combination of lymphoid proliferation defects and cell signaling defects added to others such as cell loss and altered expression of the BLM gene may contribute directly to the main characteristics observed in Bloom\'s syndrome, such as growth failure and high risk of cancer. In the future, the study of the transcriptome applied to other BS carriers and other instability syndromes, will allow a more accurate analysis of the relevant gene interactions to the destabilization of the genome

The Amazon rainforest is considered the world\'s largest reservoir of plant and animal biodiversity, but in recent years has been subjected to high rates of deforestation for the conversion of native areas into agricultural fields and pasture. The understanding of the effects of land-use change on soil microbial communities is essential, taking into account the importance that these organisms play in the ecosystem. In this context, this thesis evaluated the effect of these changes on microorganism communities in soils under different land-use systems. In the first study, the microbial communities were analyzed using the nextgeneration sequencing Illumina Hiseq2000, considering samples from native forest, deforested area, agriculture and pasture. From the analysis of approximately 487 million sequences was possible to show that microbial communities respond differently in each landuse system, with changes in both taxonomic and functional diversity. Also, we suggested that ecosystem function in forest soils is maintained by the abundance of microorganisms, while in disturbed areas such functioning is maintained by high diversity and functional redundancy. In the second study, we assessed the extent to which a particular plant species, i.e. soybean, is able to select the microbial community that inhabits the rhizosphere. From the metagenomic sequencing by the 454 GS FLX Titanium platform we investigated the taxonomic and functional diversities of soil and rhizosphere communities associated to soybean, and also tested the validity of neutral and niche theories to explain rhizosphere community assembly process. The results suggest that soybean selects a specific microbial community inhabiting the rhizosphere based on functional traits, which may be related to benefits to the plant, such as growth promotion and nutrition. This process of selection follows largely the niche -based theory indicating the selection power of the plant and other environmental variables in shaping the microbial community both at the taxonomic and functional level. This thesis highlights the importance of microbial ecology studies in the context of the Amazon to a better understanding of the effects of deforestation on microorganisms, and provides information that can be suitable for future development of sustainable approaches for the ecosystem use / A floresta Amazônica é considerada o maior reservatório de biodiversidade vegetal e animal do mundo, porém, nos últimos anos tem sido submetida à altas taxas de desmatamento para a conversão de áreas de mata nativa em campos de agricultura e pastagem. A compreensão sobre os efeitos dessa mudança de uso da terra sobre as comunidades microbianas do solo é fundamental, levando-se em consideração a importância que esses organismos desempenham no ecossistema. Neste contexto, este trabalho de tese avaliou o efeito dessas mudanças sobre as comunidades de micro-organismos em solos sob diferentes sistemas de uso. No primeiro estudo, as comunidades microbianas foram analisadas por meio do sequenciamento de nova geração Illumina Hiseq2000, sendo consideradas amostras de áreas de floresta nativa, área desmatada, agricultura e pastagem. A partir da análise de aproximadamente 487 milhões de sequências foi possível mostrar que as comunidades microbianas respondem diferentemente em cada sistema de uso do solo, com alterações tanto na diversidade taxonômica quanto funcional. Também, sugere-se que o funcionamento do ecossistema em solos de floresta é mantido pela abundância dos micro-organismos presentes, enquanto nas áreas alteradas esse funcionamento é mantido pela alta diversidade e redundância funcional. No segundo estudo foi avaliado até que ponto uma espécie de planta, i.e. soja, é capaz de selecionar a comunidade habitante de sua rizosfera. A partir do sequenciamento metagenômico pela plataforma 454 GS FLX Titanium da Roche foi investigado a diversidade taxonômica e funcional das comunidades de solo e rizosfera associadas à soja, e testou-se a validade das teorias neutras e de nicho para explicar o processo de formação das comunidades microbianas. Os resultados sugerem que a soja seleciona uma comunidade específica que habita sua rizosfera com base em atributos funcionais, os quais podem estar relacionados com benefícios à planta, como promoção do crescimento e nutrição. Esse processo de seleção segue a teoria de nicho, indicando o poder de seleção da planta e de outras variáveis ambientais em moldar as comunidades microbianas tanto de forma taxonômica quanto funcional. Esta tese destaca a importância de estudos em ecologia microbiana no contexto da Amazônia para uma melhor compreensão dos efeitos do desmatamento sobre os microrganismos e disponibiliza informações que podem ser futuramente utilizados para o desenvolvimento de metodologias mais sustentáveis para o uso do ecossistema