Non-small cell lung cancer belongs to most frequent malignant tumours at all worldwide. Despite significant progress in knowledge about etiopathogenesis and targeted anticancer therapy, basic scientific research in this particular field and development of more effective treatment remains challenging. In case of its inadequate activation, the Hedgehog signaling pathway is involved in non-small cell cancer development. P53 is well known tumour suppressor gene, that serves as anticancer barrier. Its activity is mostly determined by the transcriptional activation of many pro-apoptotic genes, one of which is SIVA-1. Recently, it has been surprisingly shown, that SIVA-1 has also pro-oncogenic properties in a mouse model of non-small cell lung cancer. The aim of this study was to clarify the importance of Hedgehog signaling pathway and protein SIVA-1 and their potential relationship in development and progression of human non-small cell lung cancer. In selected cell lines of human non-small cell lung cancer, expression of each single component of Hedgehog signalign pathway was detected. In the tissue samples of tumour obtained from 39 patients that underwent surgery for non-small cell lung cancer and selected cell lines of the same tumour, expression of SIVA-1 protein was revealed. These findings indicate...

Die Signalwege des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, -migration und -apoptose durch die Aktivierung von Smad-Proteinen. Untersuchungen haben gezeigt, dass die biologischen Wirkungen des TGF-β-Signalwegs stark vom Zellkontext abhängen. In dieser Arbeit ging es darum zu verstehen, wie TGF-β-Signale Zielgene unterschiedlich regulieren können, wie unterschiedliche Dynamiken der Genexpression durch TGF-β-Signale induziert werden und auf welche Weise Smad-Proteine zu unterschiedlichen Expressionsmustern von TGF- β-Zielgenen beitragen. Der Fokus dieser Studie liegt auf den transkriptionsregulatorischen Effekten des Nodal / Activin-Liganden, der zur TGF-β-Superfamilie gehört und ein wichtiger Faktor in der frühen embryonalen Entwicklung ist. Um diese Effekte zu analysieren, habe ich kinetische Modelle entwickelt und mit den Zeitverlaufsdaten von RNA-Polymerase II (Pol II) und Smad2-Chromatin-Bindungsprofilen für die Zielgene kalibriert. Unter Verwendung des Akaike-Informationskriteriums (AIC) zur Bewertung verschiedener kinetischer Modelle stellten wir fest, dass der Nodal / Activin-Signalweg Zielgene über verschiedene Mechanismen reguliert. Im Nodal / Activin-Smad2-Signalweg spielt Smad2 für verschiedene Zielgene unterschiedliche regulatorische Rollen. Wir zeigen, wie Smad2 daran beteiligt ist, die Transkriptions- oder Abbaurate jedes Zielgens separat zu regulieren. Darüber hinaus werden eine Reihe von Merkmalen, die die Transkriptionsdynamik von Zielgenen vorhersagen können, durch logistische Regression ausgewählt. Der hier vorgestellte Ansatz liefert quantitative Beziehungen zwischen der Dynamik des Transkriptionsfaktors und den Transkriptionsantworten. Diese Arbeit bietet auch einen allgemeinen mathematischen Rahmen für die Untersuchung der Transkriptionsregulation anderer Signalwege. / Transforming growth factor-β (TGF-β) signaling pathways play a crucial role in cell proliferation, migration, and apoptosis through the activation of Smad proteins. Research has shown that the biological effects of TGF-β signaling pathway are highly cellular-context-dependent. In this thesis work, I aimed at understanding how TGF-β signaling can regulate target genes differently, how different dynamics of gene expressions are induced by TGF-β signal, and what is the role of Smad proteins in differing the profiles of target gene expression. In this study, I focused on the transcriptional responses to the Nodal/Activin ligand, which is a member of the TGF-β superfamily and a key regulator of early embryonic development. Kinetic models were developed and calibrated with the time course data of RNA polymerase II (Pol II) and Smad2 chromatin binding profiles for the target genes. Using the Akaike information criterion (AIC) to evaluate different kinetic models, we discovered that Nodal/Activin signaling regulates target genes via different mechanisms. In the Nodal/Activin-Smad2 signaling pathway, Smad2 plays different regulatory roles on different target genes. We show how Smad2 participates in regulating the transcription or degradation rate of each target gene separately. Moreover, a series of features that can predict the transcription dynamics of target genes are selected by logistic regression. The approach we present here provides quantitative relationships between transcription factor dynamics and transcriptional responses. This work also provides a general computational framework for studying the transcription regulations of other signaling pathways.

Après le vieillissement, le diabète Mellitus de type 2 (DMT2) est le facteur de risque le plus important pour développer la maladie d'Alzheimer (MA). Le DMT2 est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie et une résistance à l’insuline qui se développe vers la cinquantaine et est fortement favorisée par l’obésité. Nous avons exploré l’impact potentiel du DMT2 sur le développement de la MA chez le Rat. Pour cela, nous avons utilisé un régime alimentaire cafétéria (RC) couplé à des injections de faibles doses de Streptozotocine (STZ) (STZ-CD). Les rats STZ-CD montrent des signes classiques de DMT2 et des déficits légers de consolidation en mémoire de reconnaissance spatiale. Afin d'imiter le développement des stades précoces de la MA, la moitié des rats reçoivent une infusion intracérébrale de peptides β-amyloïdes solubles (Aβ) qui ne conduisent pas à des déficits mnésiques durables. Par contre, le phénotype DMT2 chez les rats STZ-CD exacerbe les déficits mnésiques observés avec le peptide Aβ en les prolongeant dans le temps. L’enrichissement environnemental pendant une période critique de 2 semaines après l’infusion d’Aβ est capable de compenser les déficits mnésiques induits par le peptide Aβ et/ou le traitement STZ-CD ; mais d’une manière limitée dans le temps. Des analyses biochimiques dans l’aire CA1 de l’hippocampe ont été effectuées pour explorer de possibles altérations de la voie PI3K, de marqueurs de la cascade amyloïde et du DMT2. Le peptide Aβ seul induit peu de changements durables ; le phénotype DMT2 seul est associé à des changements pour quelques protéines-clé, largement en liaison avec le régime cafétéria. Par contre, la majorité des modifications dysfonctionnelles de protéines est observée chez les rats montrant un phénotype de type DMT2 et recevant le peptide Aβ. Ces altérations, similaires à celles rapportées chez des patients atteints de la MA et chez des modèles animaux de la MA, concernent notamment des protéines de la voie PI3K-Akt impliquée dans des fonctions comme l’autophagie et l’inflammation et des marqueurs de la MA. L’altération de ces protéines pourrait contribuer aux déficits mnésiques durables observés et mettre en lumière des mécanismes moléculaires induits par le DMT2 et promouvant un milieu neuronal favorisant le développement d’un stade précoce de la maladie d'Alzheimer. / Following aging, type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is the most important risk factor of developing Alzheimer’s disease (AD). It is a metabolic disorder characterised by hyperglycemia and insulin resistance that develops in middle age and is promoted largely by obesity. In this study, we used a T2DM rat model to assess the potential impact T2DM may have on the development of AD. Rats were fed cafeteria-style diet (CD) coupled with low dose injections of Streptozotocin (STZ)(STZ-CD). We found that STZ-CD treated rats showed classic signs of T2DM and a modest deficit in consolidation of spatial recognition memory. In order to mimic the development of early stage AD, half of the rats were infused with a soluble oligomeric amyloid beta (Aβ), which alone was not sufficient to induce long-lasting memory deficits. Interestingly, the T2DM phenotype exacerbated the memory deficits induced by Aβ infusion by prolonging these deficits. Environmental enrichment during a critical two-week period following infusion of Aβ rescued memory deficits induced by Aβ and/or STZ-CD treatment; however, this was time-limited. Biochemical analyses were conducted mainly in proteins involved in the PI3K-Akt signalling pathway and markers of AD and T2DM in CA1 of the hippocampus. Aβ alone induced few long-lasting changes; T2DM phenotype alone induced some changes that were largely mediated by CD treatment alone; however, the majority of dysfunctional regulation of proteins was observed in rats showing a T2DM phenotype that were infused with Aβ. More importantly, many of these changes are similar to those reported in brains of AD patients or rodent models of the disease; notably key proteins in the PI3K-Akt signaling pathway that mediate functions such as autophagy, inflammation and markers of AD. Dysregulation of these proteins may contribute to the long-lasting memory deficits seen in this model, which may provide evidence of molecular mechanisms induced by T2DM that could promote a dysfunctional neuronal environment favouring the development of early stages of Alzheimer’s disease.

Lens development and differentiation are strictly regulated processes. Various disturbances of these processes can lead to vision-limiting pathologies. The vertebrate lens is composed of epithelial cells and terminally differentiated fiber cells. Differentiation of fiber cells is connected with expression of fiber cell specific proteins (such as crystallins), cell cycle exit, and finally with the degradation of cell nucleus and organelles. Wnt/β-catenin signaling plays important roles during early eye development as well as later during the lens differentiation. To investigate the consequences of constitutive activation of Wnt/β-catenin signaling in lens fiber cells transgenic mouse strain, called CLEF, was created. Constitutive activation of Wnt/β-catenin signaling in fiber cells of CLEF mouse is achieved by transgenic protein CLEF that contains C-terminal activation domain of β-catenin fused to the amino terminus of full-length protein Lef1. The expression of CLEF transgene is under the control of αA-crystallin promoter. As a result of constitutive activation of Wnt/β-catenin signaling in fiber cells, adult CLEF mice develop cataracts and microphthalmia, and the morphology of adult mutant lenses is disrupted. Transgenic CLEF mRNA is expressed starting from E13.5 and by E16.5 transgenic CLEF protein is...

Der Überträger von Malaria, Anopheles gambiae, fordert jedes Jahr das Leben von etwa einer halben Million Menschen. Dennoch haben Mücken Mechanismen entwickelt, die die Ausbreitung von Krankheitserregern einschränken können. Der NF-κB-ähnliche Signalweg REL2 wurde als Schlüsselmechanismus für die Abtötung von Plasmodium falciparum in Mücken beschrieben, der sie bei experimenteller Aktivierung resistent gegen Plasmodium-Parasiten macht. Der Weg blieb jedoch schlecht charakterisiert. Zur Charakterisierung des REL2-Signalwegs wurden Loss-of-Function-Mutanten des Gens das Transkriptionsfaktor REL2 kodiert verwendet. Hier wurde die Fitness der Mücken mit REL2-Mangel, ihre Anfälligkeit für eine Infektion mit P. falciparum und Veränderungen in ihren mikrobiellen Gemeinschaften untersucht. Es wurde eine entscheidende Rolle des REL2-Signalwegs bei der Kontrolle der Proliferation des Mitteldarmmikrobioms und folglich des Überlebens der Mücken identifiziert. Es konnte kein konsistenter Phänotyp in der Anfälligkeit von REL2-Mutanten gegenüber Plasmodium beobachtet werden. Die Interaktion des Signalwegs und des Parasiten war indirekt, als Folge der REL2- und Mikrobiom-Interaktion. Gewebespezifische Transkriptomsequenzierung wurde verwendet um REL2-Genziele zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten die gewebespezifische Funktion des REL2-Signalwegs, wobei der Mitteldarm der Hauptort seiner Aktivität ist. Die identifizierten REL2-Genziele gehörten zu verschiedenen Domänen der Mückenphysiologie, einschließlich des Stoffwechsels. Mit weiteren Experimenten wurde die Rolle des REL2-Signalwegs bei der Blutmahlzeitverdauung und dem Management von Zucker- und Lipidressourcen beobachtet. Diese Studie ist die erste, die die Hauptgewebe der REL2-Aktivität und die Genziele des Signalwegs in Mücken identifiziert. Seine Hauptfunktion ist die Regulierung der mikrobiellen Gemeinschaften der Mücken im Mitteldarm, aber der Signalweg ist auch an der Feinabstimmung von Stoffwechselprozessen beteiligt. / Malaria vector, Anopheles gambiae, claims lives of around half a million people each year. But mosquitoes have developed an array of mechanisms that can limit pathogen proliferation. NF-κB-like signaling pathway REL2 has been described as a key mechanism for Plasmodium falciparum killing in mosquitoes, rendering them resistant to Plasmodium parasites when experimentally activated. However, the pathway remained poorly characterized. With an aim to characterize the REL2-dependent Plasmodium killing, loss-of-function mutants of the gene encoding the NF-κB-like transcription factor REL2 were used. The fitness of the REL2 deficient mosquitoes, their susceptibility to P. falciparum infection, and changes in their microbial communities were investigated. A critical role of REL2 pathway in controlling the midgut microbiome proliferation, and consequently the mosquito survival, has been identified. Interestingly, no consistent phenotype could be observed in the susceptibility of REL2 mutants to Plasmodium. Rather, the interaction of the pathway and parasite seems to be indirect, as a consequence of the REL2 and microbiome interaction. Furthermore, tissue-specific transcriptome sequencing was used to identify REL2 gene targets. The sequencing results revealed the tissue-specific function of the REL2-pathway, with the midgut being the main site of its activity. Identified REL2 gene targets belonged to various domains of mosquito physiology, including metabolism. With further experiments, the role of the REL2 pathway in blood meal digestion and management of sugar and lipid resources has been observed. Taken together, this study is the first to identify the main tissues of the REL2 activity and also gene targets of the pathway in mosquitoes. Its main function was found to be the regulation of mosquito microbial communities in the midgut, but the pathway also seems involved in fine-tuning of metabolic processes.

Les carcinomes de la corticosurrénale (CC) sont des tumeurs malignes rares dont le pronostic est globalement sombre et les thérapeutiques encore limitées, la chirurgie étant le seul traitement efficace. Il est donc important de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement et l'agressivité des CC. L’activation constitutive de la voie de signalisation Wnt/b-caténine est fréquente dans les CC (40%) et est associée à un caractère agressif. L’objectif de mon projet de thèse était d’étudier l’implication de la voie Wnt/β-caténine dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. La lignée cellulaire humaine H295R, issue d’un CC présente une activation de la voie Wnt/β-caténine qui a pour origine une mutation activatrice de la β-caténine. Nous avons montré que l'invalidation de la β-caténine dans les cellules H295R inhibe l'activité transcriptionnelle de la voie Wnt/β-caténine, diminue la prolifération, augmente l'apoptose et bloque la progression du cycle cellulaire. De plus, nous avons montré que la voie Wnt/b-caténine est essentielle au développement tumoral de xénogreffes de ces cellules chez la souris. L’activation de la voie Wnt/b-caténine participe à la tumorigenèse de nombreux organes en régulant l’expression de gènes impliqués par exemple dans la prolifération, la survie cellulaire ou l'adhésion. Afin de mieux comprendre comment la voie Wnt/β-caténine participe à la tumorigenèse corticosurrénalienne, nous avons cherché à identifier les gènes cibles de cette voie dans les CC. L’analyse des transcriptomes de deux cohortes indépendantes de CC et des cellules H295R avec ou sans invalidation de la β-caténine a permis d’identifier des gènes dont l'expression est corrélée à l'activation de la voie Wnt/b-caténine. Nous avons montré que parmi ces gènes, AFF3 est essentiel pour transmettre les effets de l'activation de la voie Wnt/b-caténine dans les carcinomes de la corticosurrénale. En effet, AFF3 est un gène cible direct de la voie Wnt/b-caténine et son invalidation dans les cellules corticosurrénaliennes H295R diminue la prolifération cellulaire et déclenche l'apoptose à l'image de l'invalidation de la b-caténine. AFF3 est une protéine nucléaire, localisée au niveau des speckles qui sont impliqués dans l'épissage des ARNm. De plus, AFF3 interagit avec le P-TEFb (CDK9/CyclineT1/2) au sein du Super elongation complex (SEC) nécessaire à l’élongation de la transcription des ARNm par l'ARN polymérase II. Nous avons ainsi montré dans les cellules corticosurrénaliennes H295R, que la surexpression d'AFF3 altère l’organisation des speckles et la localisation de CDK9 et Cycline T1. En conclusion, ce travail a permis d'identifier une nouvelle cible transcriptionnelle de la voie de signalisation Wnt/b-caténine, AFF3, qui code pour un médiateur important des effets de l'activation de cette voie dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. AFF3 agirait notamment en altérant la structure des speckles et en interagissant avec le P-TEFb qui sont importants respectivement pour l'épissage des ARNm et la transcription. Ces résultats conduisent à une meilleure compréhension de la tumorigenèse corticosurrénalienne et permettent d'envisager le P-TEFb et le SEC comme de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des CC. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare and highly aggressive endocrine neoplasm, with limited therapeutic option. Currently, surgical resection is considered the only effective treatment. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in ACC development in order to improve their clinical management. Activation of the Wnt/b-catenin signaling pathway is frequent (40%) in ACC and is associated with poor prognosis. The aim of my thesis was to study the involvement of the Wnt/b-catenin signaling pathway in adrenocortical tumorigenesis. The human cell line H295R, derived from an ACC, carries the S45P β-catenin mutation which leads to constitutive β-catenin/TCF transcriptional activity. In the ACC cell line H295R we show that β-catenin silencing resulted in a decreased transcriptional activity of the Wnt/b-catenin signaling, cell cycle alterations, a decreased cell proliferation and an increased apoptosis. Moreover we show that β-catenin silencing abolish xenograft development of H295R adrenocortical cells. Aberrant activation of the Wnt/b-catenin signaling promotes tumorigenesis of several organs by enhancing expression of genes involved in proliferation, cell survival or cell adhesion. To better understand the role of the Wnt/b-catenin signaling in adrenocortical tumorigenesis, we wanted to identify target genes of this pathway in ACC. Combined transcriptomic analysis on two independent cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells with or without β-catenin silencing allow us to identify alterations of gene expression due to aberrant Wnt/βcatenin pathway activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of the Wnt/b-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by b-catenin silencing. AFF3 is a nuclear protein located in nuclear speckles, which serve as a reservoir of factors participating in mRNA splicing. Moreover, AFF3 interacts with P-TEFb (CDK9/CyclinT1/2) in the Super elongation complex (SEC) required for transcriptional elongation of mRNA by RNA polymerase II. In H295R adrenocortical cells, we show that strong overproduction of AFF3 altered the structural organization of nuclear speckles and the localization of CDK9 and Cycline T1. In conclusion, this study has identified a new transcriptional target of the Wnt/β-catenin signaling pathway, AFF3, which encodes an important mediator of this pathway in adrenocortical tumorigenesis. AFF3 might especially act by affecting the structural organization of speckles and interacting with the P-TEFb, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. These results provide a better understanding of the biological process involved in ACC development and suggest that P-TEFb and SEC could be new therapeutic targets for the treatment of ACC.

Les carcinomes de la corticosurrénale (CC) sont des tumeurs malignes rares dont le pronostic est globalement sombre et les thérapeutiques encore limitées, la chirurgie étant le seul traitement efficace. Il est donc important de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement et l'agressivité des CC. L’activation constitutive de la voie de signalisation Wnt/b-caténine est fréquente dans les CC (40%) et est associée à un caractère agressif. L’objectif de mon projet de thèse était d’étudier l’implication de la voie Wnt/β-caténine dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. La lignée cellulaire humaine H295R, issue d’un CC présente une activation de la voie Wnt/β-caténine qui a pour origine une mutation activatrice de la β-caténine. Nous avons montré que l'invalidation de la β-caténine dans les cellules H295R inhibe l'activité transcriptionnelle de la voie Wnt/β-caténine, diminue la prolifération, augmente l'apoptose et bloque la progression du cycle cellulaire. De plus, nous avons montré que la voie Wnt/b-caténine est essentielle au développement tumoral de xénogreffes de ces cellules chez la souris. L’activation de la voie Wnt/b-caténine participe à la tumorigenèse de nombreux organes en régulant l’expression de gènes impliqués par exemple dans la prolifération, la survie cellulaire ou l'adhésion. Afin de mieux comprendre comment la voie Wnt/β-caténine participe à la tumorigenèse corticosurrénalienne, nous avons cherché à identifier les gènes cibles de cette voie dans les CC. L’analyse des transcriptomes de deux cohortes indépendantes de CC et des cellules H295R avec ou sans invalidation de la β-caténine a permis d’identifier des gènes dont l'expression est corrélée à l'activation de la voie Wnt/b-caténine. Nous avons montré que parmi ces gènes, AFF3 est essentiel pour transmettre les effets de l'activation de la voie Wnt/b-caténine dans les carcinomes de la corticosurrénale. En effet, AFF3 est un gène cible direct de la voie Wnt/b-caténine et son invalidation dans les cellules corticosurrénaliennes H295R diminue la prolifération cellulaire et déclenche l'apoptose à l'image de l'invalidation de la b-caténine. AFF3 est une protéine nucléaire, localisée au niveau des speckles qui sont impliqués dans l'épissage des ARNm. De plus, AFF3 interagit avec le P-TEFb (CDK9/CyclineT1/2) au sein du Super elongation complex (SEC) nécessaire à l’élongation de la transcription des ARNm par l'ARN polymérase II. Nous avons ainsi montré dans les cellules corticosurrénaliennes H295R, que la surexpression d'AFF3 altère l’organisation des speckles et la localisation de CDK9 et Cycline T1. En conclusion, ce travail a permis d'identifier une nouvelle cible transcriptionnelle de la voie de signalisation Wnt/b-caténine, AFF3, qui code pour un médiateur important des effets de l'activation de cette voie dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. AFF3 agirait notamment en altérant la structure des speckles et en interagissant avec le P-TEFb qui sont importants respectivement pour l'épissage des ARNm et la transcription. Ces résultats conduisent à une meilleure compréhension de la tumorigenèse corticosurrénalienne et permettent d'envisager le P-TEFb et le SEC comme de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des CC. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare and highly aggressive endocrine neoplasm, with limited therapeutic option. Currently, surgical resection is considered the only effective treatment. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in ACC development in order to improve their clinical management. Activation of the Wnt/b-catenin signaling pathway is frequent (40%) in ACC and is associated with poor prognosis. The aim of my thesis was to study the involvement of the Wnt/b-catenin signaling pathway in adrenocortical tumorigenesis. The human cell line H295R, derived from an ACC, carries the S45P β-catenin mutation which leads to constitutive β-catenin/TCF transcriptional activity. In the ACC cell line H295R we show that β-catenin silencing resulted in a decreased transcriptional activity of the Wnt/b-catenin signaling, cell cycle alterations, a decreased cell proliferation and an increased apoptosis. Moreover we show that β-catenin silencing abolish xenograft development of H295R adrenocortical cells. Aberrant activation of the Wnt/b-catenin signaling promotes tumorigenesis of several organs by enhancing expression of genes involved in proliferation, cell survival or cell adhesion. To better understand the role of the Wnt/b-catenin signaling in adrenocortical tumorigenesis, we wanted to identify target genes of this pathway in ACC. Combined transcriptomic analysis on two independent cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells with or without β-catenin silencing allow us to identify alterations of gene expression due to aberrant Wnt/βcatenin pathway activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of the Wnt/b-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by b-catenin silencing. AFF3 is a nuclear protein located in nuclear speckles, which serve as a reservoir of factors participating in mRNA splicing. Moreover, AFF3 interacts with P-TEFb (CDK9/CyclinT1/2) in the Super elongation complex (SEC) required for transcriptional elongation of mRNA by RNA polymerase II. In H295R adrenocortical cells, we show that strong overproduction of AFF3 altered the structural organization of nuclear speckles and the localization of CDK9 and Cycline T1. In conclusion, this study has identified a new transcriptional target of the Wnt/β-catenin signaling pathway, AFF3, which encodes an important mediator of this pathway in adrenocortical tumorigenesis. AFF3 might especially act by affecting the structural organization of speckles and interacting with the P-TEFb, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. These results provide a better understanding of the biological process involved in ACC development and suggest that P-TEFb and SEC could be new therapeutic targets for the treatment of ACC.

Le glioblastome multiforme (GBM) représente la tumeur cérébrale primaire la plus agressive et la plus vascularisée chez l’adulte. La survie médiane après le diagnostic est de moins d’un an en l’absence de traitement. Malheureusement, 90% des patients traités avec de la radiothérapie après la résection chirurgicale d’un GBM développent une récidive tumorale. Récemment, le traitement des GBM avec radiothérapie et témozolomide, un agent reconnu pour ses propriétés antiangiogéniques, a permis de prolonger la survie médiane à 14,6 mois. Des efforts sont déployés pour identifier des substances naturelles capables d’inhiber, de retarder ou de renverser le processus de carcinogenèse. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), un polyphénol retrouvé dans le thé vert, est reconnu pour ses propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques. L’EGCG pourrait sensibiliser les cellules tumorales cérébrales et les cellules endothéliales dérivées des tumeurs aux traitements conventionnels. Le chapitre II décrit la première partie de ce projet de doctorat. Nous avons tenté de déterminer si l’EGCG pourrait sensibiliser la réponse des GBM à l’irradiation (IR) et si des marqueurs moléculaires spécifiques sont impliqués. Nous avons documenté que les cellules U-87 étaient relativement radiorésistantes et que Survivin, une protéine inhibitrice de l’apoptose, pourrait être impliquée dans la radiorésistance des GBM. Aussi, nous avons démontré que le pré-traitement des cellules U-87 avec de l’EGCG pourrait annuler l’effet cytoprotecteur d’une surexpression de Survivin et potentialiser l’effet cytoréducteur de l’IR. Au chapitre III, nous avons caractérisé l’impact de l’IR sur la survie de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (HBMEC) et nous avons déterminé si l’EGCG pouvait optimiser cet effet. Bien que les traitements individuels avec l’EGCG et l’IR diminuaient la survie des HBMEC, le traitement combiné diminuait de façon synergique la survie cellulaire. Nous avons documenté que le traitement combiné augmentait la mort cellulaire, plus spécifiquement la nécrose. Au chapitre IV, nous avons investigué l’impact de l’IR sur les fonctions angiogéniques des HBMEC résistantes à l’IR, notamment la prolifération cellulaire, la migration cellulaire en présence de facteurs de croissance dérivés des tumeurs cérébrales, et la capacité de tubulogenèse. La voie de signalisation des Rho a aussi été étudiée en relation avec les propriétés angiogéniques des HBMEC radiorésistantes. Nos données suggèrent que l’IR altère significativement les propriétés angiogéniques des HBMEC. La réponse aux facteurs importants pour la croissance tumorale et l’angiogenèse ainsi que la tubulogenèse sont atténuées dans ces cellules. En conclusion, ce projet de doctorat confirme les propriétés cytoréductrices de l’IR sur les gliomes malins et propose un nouveau mécanisme pour expliquer la radiorésistance des GBM. Ce projet documente pour la première fois l’effet cytotoxique de l’IR sur les HBMEC. Aussi, ce projet reconnaît l’existence de HBMEC radiorésistantes et caractérise leurs fonctions angiogéniques altérées. La combinaison de molécules naturelles anticancéreuses et antiangiogéniques telles que l’EGCG avec de la radiothérapie pourrait améliorer l’effet de l’IR sur les cellules tumorales et sur les cellules endothéliales associées, possiblement en augmentant la mort cellulaire. Cette thèse supporte l’intégration de nutriments avec propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques dans le traitement des gliomes malins pour sensibiliser les cellules tumorales et endothéliales aux traitements conventionnels. / Glioblastoma multiform (GBM) represents the most aggressive and vascularised primary cerebral neoplasm in adults. Median length of survival without further therapy is usually less than one year from the time of diagnosis. Unfortunately, 90% of patients receiving radiotherapy following GBM resection develop a tumor recurrence. More recently, treatment of GBM with combined radiotherapy and temozolomide, an agent recognized for its antiangiogenic activity, increased the median survival to 14,6 months. Efforts have been oriented towards identifying naturally occurring substances capable of inhibiting, delaying or reversing the multi-stage carcinogenesis process. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), a green tea polyphenol, has been recognized for its anticancerous and antiangiogenic property. EGCG may represent a potential agent capable of sensitizing brain tumor cells and their derived endothelial cells (ECs) to conventional treatments. In chapter II, the first part of this doctorate project aimed at determining if EGCG, in synergy with radiotherapy, can sensitize GBM’s response to radiation and whether specific molecular markers are involved. We documented that U-87 cells were relatively radioresistant and that Survivin, an inhibitor of apoptosis protein, may be involved in GBM’s radioresistance. We also found that pre-treatment of U-87 cells with EGCG could overcome the cytoprotective effect of Survivin overexpression and potentiate the cytoreductive effect of irradiation (IR). In chapter III, we characterized the impact of IR on human brain microvascular endothelial cell (HBMEC) survival and determined whether EGCG, could optimize this effect. We found that although EGCG treatment and IR individually decreased HBMEC survival, the combined treatment synergistically reduced survival. We documented that the combined treatment increased cell death, more specifically necrosis. In chapter IV, we investigated the impact of IR exposure on the angiogenic functions i.e. cell proliferation, cell migration in response to brain tumor-derived growth factors, and capacity for tubulogenesis of surviving human brain tumor-derived ECs. The Rho signalling pathway was also investigated in relation to the functional properties of radioresistant HBMEC. Our data suggests that IR significantly alters radioresistant HBMEC migration response to tumor-secreted growth factors and tubulogenesis. Response to growth factors important for tumor expansion and angiogenesis is significantly attenuated in these cells. In conclusion, this doctorate project confirmed IR’s cytoreductive properties on malignant gliomas. We proposed a novel mechanism to explain GBMs’ radioresistance. This project documented for the first time IR’s cytotoxic effect in HBMEC. It also described the existence of radioresistant HBMEC and characterized their altered angiogenic functions. The combination of natural anticancerous and antiangiogenic molecules such as EGCG with radiotherapy could improve IR’s effect on human malignant glioma cells and microvascular ECs, especially through increased necrosis of HBMEC. The thesis supports integrating nutrients bearing anticancerous and antiangiogenic properties, such as EGCG, in the management of gliomas to sensitize tumor and tumor-associated ECs to conventional therapies.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle omniprésente des protéines Cette modification est ajoutée et enlevée par l’activité enzymatique respective des protéines kinases et phosphatases. Les kinases Erk1/2 sont au cœur d’une voie de signalisation importante qui régule l’activité de protéines impliquées dans la traduction, le cycle cellulaire, le réarrangement du cytosquelette et la transcription. Ces kinases sont aussi impliquées dans le développement de l’organisme, le métabolisme du glucose, la réponse immunitaire et la mémoire. Différentes pathologies humaines comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et principalement le cancer, sont associées à une perturbation de la phosphorylation sur les différents acteurs de cette voie. Considérant l’importance biologique et clinique de ces deux kinases, connaître l’étendue de leur activité enzymatique pourrait mener au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était de mesurer l’influence de cette voie sur le phosphoprotéome et de découvrir de nouveaux substrats des kinases Erk1/2. Une étude phosphoprotéomique de cinétique d’inhibition pharmacologique de la voie de signalisation Erk1/2 a alors été entreprise. Le succès de cette étude était basé sur trois technologies clés, soit l’enrichissement des phosphopeptides avec le dioxyde de titane, la spectrométrie de masse haut débit et haute résolution, et le développement d’une plateforme bio-informatique nommée ProteoConnections. Cette plateforme permet d’organiser les données de protéomique, évaluer leur qualité, indiquer les changements d’abondance et accélérer l’interprétation des données. Une fonctionnalité distinctive de ProteoConnections est l’annotation des sites phosphorylés identifiés (kinases, domaines, structures, conservation, interactions protéiques phospho-dépendantes). Ces informations ont été essentielles à l’analyse des 9615 sites phosphorylés sur les 2108 protéines identifiées dans cette étude, soit le plus large ensemble rapporté chez le rat jusqu’à ce jour. L’analyse des domaines protéiques a révélé que les domaines impliqués dans les interactions avec les protéines, les acides nucléiques et les autres molécules sont les plus fréquemment phosphorylés et que les sites sont stratégiquement localisés pour affecter les interactions. Un algorithme a été implémenté pour trouver les substrats potentiels des kinases Erk1/2 à partir des sites identifiés selon leur motif de phosphorylation, leur cinétique de stimulation au sérum et l’inhibition pharmacologique de Mek1/2. Une liste de 157 substrats potentiels des kinases Erk1/2 a ainsi été obtenue. Parmi les substrats identifiés, douze ont déjà été rapportés et plusieurs autres ont des fonctions associées aux substrats déjà connus. Six substrats (Ddx47, Hmg20a, Junb, Map2k2, Numa1, Rras2) ont été confirmés par un essai kinase in vitro avec Erk1. Nos expériences d’immunofluorescence ont démontré que la phosphorylation de Hmg20a sur la sérine 105 par Erk1/2 affecte la localisation nucléocytoplasmique de cette protéine. Finalement, les phosphopeptides isomériques positionnels, soit des peptides avec la même séquence d’acides aminés mais phosphorylés à différentes positions, ont été étudiés avec deux nouveaux algorithmes. Cette étude a permis de déterminer leur fréquence dans un extrait enrichi en phosphopeptides et d’évaluer leur séparation par chromatographie liquide en phase inverse. Une stratégie analytique employant un des algorithmes a été développée pour réaliser une analyse de spectrométrie de masse ciblée afin de découvrir les isomères ayant été manqués par la méthode d’analyse conventionnelle. / Phosphorylation is an omnipresent post-translational modification of proteins that regulates numerous cellular processes. This modification is controlled by the enzymatic activity of protein kinases and phosphatases. Erk1/2 kinases are central to an important signaling pathway that modulates translation, cell cycle, cytoskeleton rearrangement and transcription. They are also implicated in organism development, glucose metabolism, immune response and memory. Different human pathologies such as diabetes, cardiovascular diseases, and most importantly cancer, are associated with misregulation or mutations in members of this pathway. Considering the biological and clinical importance of those two kinases, discovering the extent of their enzymatic activity could favor the development of new pharmacological therapies. In this context, the principal objective of this thesis was to measure the influence of this pathway on the phosphoproteome and to discover new substrates of the Erk1/2 kinases. A phosphoproteomics study on the pharmacological inhibition kinetics of the Erk1/2 signaling pathway was initiated. The success of this study was based on three key technologies such as phosphopeptides enrichment with titanium dioxide, high-throughput and high-resolution mass spectrometry, and the development of ProteoConnections, a bioinformatics analysis platform. This platform is dedicated to organize proteomics data, evaluate data quality, report changes of abundance and accelerate data interpretation. A distinctive functionality of ProteoConnections is the annotation of phosphorylated sites (kinases, domains, structures, conservation, phospho-dependant protein interactions, etc.). This information was essential for the dataset analysis of 9615 phosphorylated sites identified on 2108 proteins during the study, which is, until now, the largest one reported for rat. Protein domain analysis revealed that domains implicated in proteins, nucleic acids and other molecules binding were the most frequently phosphorylated and that these sites are strategically located to affect the interactions. An algorithm was implemented to find Erk1/2 kinases potential substrates of identified sites using their phosphorylation motif, serum stimulation and Mek1/2 inhibition kinetic profile. A list of 157 potential Erk1/2 substrates was obtained. Twelve of them were previously reported and many more have functions associated to known substrates. Six substrates (Ddx47, Hmg20a, Junb, Map2k2, Numa1, and Rras2) were confirmed by in vitro kinase assays with Erk1. Our immunofluorescence experiments demonstrated that the phosphorylation of Hmg20a on serine 105 by Erk1/2 affects the nucleocytoplasmic localization of this protein. Finally, phosphopeptides positional isomers, peptides with the same amino acids sequence but phosphorylated at different positions, were studied with two new algorithms. This study allowed us to determine their frequency in an enriched phosphopeptide extract and to evaluate their separation by reverse-phase liquid chromatography. An analytical strategy that uses one of the algorithms was developed to do a targeted mass spectrometry analysis to discover the isomers that had been missed by the conventional method.