Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos demostram que a hiperalimentação no período pós-natal causa obesidade, alterações cardiometabólicas e resistência à insulina em longo prazo. O objetivo do estudo foi investigar as consequências da hiperalimentação na lactação nos corações de camundongos filhotes e adultos ao longo do desenvolvimento. Para induzir a hiperalimentação na lactação, o tamanho da ninhada foi reduzida a 3 filhotes machos no terceiro dia, grupo hiperalimentado (GH). O grupo controle (GC) permaneceu com 9 filhotes da lactação ao desmame. Avaliamos a massa corporal, gordura epididimária e retroperitoneal, morfologia hepática e cardíaca, ultraestrutura dos cardiomiócitos, peso do PVE/CT, glicemia de jejum, triglicerídeos, colesterol total, insulina plasmática e HOMA-IR. Analisamos o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução, atividade enzimática da PDH, CS e LDH no coração e glicogênio hepático. Biologia molecular, através das proteínas: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, complexos da CTE (I, II, III, IV e V), &#945;-tubulina, GP91 e VADC. Diferenças entre os grupos analisadas por Two-Way ANOVA, com significância p<0,05. O GH apresentou aumento da massa corporal, gordura epididimária, retroperitoneal e colesterol total em todas as idades; glicemia de jejum, insulina, índice de HOMA-IR e triglicerídeos aos 21 e 90 dias. Aumento do índice de Lee aos 60 e 90 dias. GH apresentou diminuição: do IR&#946; e GLUT4 aos 21 e 60 dias; aumento do IR&#946; aos 90 dias; aumento do IRS1, PTP1B, aos 21 e 90 dias e da AKT, pAMPK/AMPK e GLUT1 aos 21 dias; diminuição da pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/AKT aos 21 e 90 dias; diminuição da HKII aos 21 dias e aumento aos 60 e 90 dias; aumento da PDH aos 90 dias; aumento da LDH aos 21 dias e redução aos 60 dias; aumento da CS aos 21 dias e diminuição aos 60 e 90 dias; aumento da oxidação de carboidratos aos 21 dias e redução aos 90 dias; diminuição na oxidação de ácidos graxos aos 60 e 90 dias. Adicionalmente, aumento do desacoplamento mitocondrial entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP aos 60 e 90 dias. Diminuição da CPT1 e aumento da UCP2 aos 21 e 90 dias. Diminuição da PGC-1&#945; aos 60 e 90 dias; da FABPm e CD36 em todas idades. Aumento da 4HNE aos 21 e diminuição aos 90 dias. Diminuição na expressão do mRNA para CPT1 aos 21, 60 dias. Diminuição na expressão do mRNA para PPAR&#945; e aumento na expressão do mRNA para UCP2 aos 21 dias; diminuição na expressão do mRNA para UCP2 ao 60 dias. Alterações morfológicas cardíacas e hepáticas, assim como na ultraestrutura dos cardiomiócitos, em todas as idades, maior conteúdo de glicogênio hepático aos 21 e 90 dias. Concluímos que a hiperalimentação na lactação levou à obesidade, com aumento da oxidação de glicose, alterações no metabolismo energético associadas à diminuição da sensibilidade à insulina, redução da capacidade oxidativa mitocondrial, levando ao desacoplamento e alteração da morfologia e ultraestrutura dos cardiomiócitos do desmame até a idade adulta. / Recent studies have shown that overnutrition in the postnatal period lead obesity, cardiometabolic alterations, insulin resistance at long term. The objective of the study was to investigate the consequences of overnutrition lactation in the hearts of mice pups and adults throughout the development. To induce overnutrition during lactation, the litter size was reduced from three male pups at the third day, overnutrition group (OG). The control group (CG) remained with 9 pups per litter at lactation until weaning. We evaluated the body weight, epididymal and retroperitoneal fat, liver and cardiac morphology, ultrastructure of cardiomyocytes, left ventricle weight/ tibia length ratio, fasting glucose, triglycerides, total cholesterol, plasma insulin and HOMA-IR. The oxygen consumption of cardiac fibers was analyzed by high-resolution respirometry. We evaluated the enzymatic activity of PDH, CS and LDH and liver glycogen. Molecular biology, through: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, eletrons transport chain complex (I, II, III, IV and V), &#945;-tubulin, GP91 and VADC. Differences between groups analyzed by Two-way ANOVA, significance level p <0.05. The OG had increased body weight, epididymal and retroperitoneal fat and total cholesterol in all ages. Fasting glucose, insulin, HOMA-IR and triglyceride levels at 21 and 90 days. Increased Lee index at 60 and 90 days. OG showed a decrease: the IR&#946; and GLUT4 at 21 and 60 days; IR&#946; increased to 90 days; increased IRS1, PTP1B, at 21 and 90 days and AKT, pAMPK/ AMPK and GLUT1 to 21 days; decrease of pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/ AKT at 21 and 90 days; HKII decreased at 21 days and increased at 60 and 90 days; PDH increased to 90 days; increased LDH at 21 days and reduced to 60 days; CS increased at 21 days and decreased at 60 and 90 days; increased oxidation of carbohydrates to 21 days and reduced to 90 days; decrease in fatty acid oxidation at 60 and 90 days. Additionally, increased mitochondrial uncoupling oxidative phosphorylation and ATP synthesis at 60 and 90 days. We observed decrease in CPT1 and increased UCP2 at 21 and 90 days. Decreased PGC-1&#945; at 60 and 90 days and FABPm and CD36 in all ages. increased 4HNE at 21 and decrease at 90 days. However, we observed a decrease in the expression of mRNA for CPT1 to 21 and 60 days. Decrease in mRNA expression of PPAR&#945; and increased in mRNA expression of UCP2 at 21 days; decrease in mRNA expression of UCP2 at 60 days. Heart and liver morphological changes, as well as the ultrastructure of cardiomyocytes, in all ages, hepatic glycogen content at 21 and 90 days. We conclude that the overfeeding lactation led to obesity with increased glucose oxidation, changes in energy metabolism, associated with decreased insulin signaling, reduced mitochondrial oxidative capacity, leading to decoupling and changing the morphology and ultrastructure of cardiomyocytes from weaning to adulthood.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos demostram que a hiperalimentação no período pós-natal causa obesidade, alterações cardiometabólicas e resistência à insulina em longo prazo. O objetivo do estudo foi investigar as consequências da hiperalimentação na lactação nos corações de camundongos filhotes e adultos ao longo do desenvolvimento. Para induzir a hiperalimentação na lactação, o tamanho da ninhada foi reduzida a 3 filhotes machos no terceiro dia, grupo hiperalimentado (GH). O grupo controle (GC) permaneceu com 9 filhotes da lactação ao desmame. Avaliamos a massa corporal, gordura epididimária e retroperitoneal, morfologia hepática e cardíaca, ultraestrutura dos cardiomiócitos, peso do PVE/CT, glicemia de jejum, triglicerídeos, colesterol total, insulina plasmática e HOMA-IR. Analisamos o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução, atividade enzimática da PDH, CS e LDH no coração e glicogênio hepático. Biologia molecular, através das proteínas: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, complexos da CTE (I, II, III, IV e V), &#945;-tubulina, GP91 e VADC. Diferenças entre os grupos analisadas por Two-Way ANOVA, com significância p<0,05. O GH apresentou aumento da massa corporal, gordura epididimária, retroperitoneal e colesterol total em todas as idades; glicemia de jejum, insulina, índice de HOMA-IR e triglicerídeos aos 21 e 90 dias. Aumento do índice de Lee aos 60 e 90 dias. GH apresentou diminuição: do IR&#946; e GLUT4 aos 21 e 60 dias; aumento do IR&#946; aos 90 dias; aumento do IRS1, PTP1B, aos 21 e 90 dias e da AKT, pAMPK/AMPK e GLUT1 aos 21 dias; diminuição da pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/AKT aos 21 e 90 dias; diminuição da HKII aos 21 dias e aumento aos 60 e 90 dias; aumento da PDH aos 90 dias; aumento da LDH aos 21 dias e redução aos 60 dias; aumento da CS aos 21 dias e diminuição aos 60 e 90 dias; aumento da oxidação de carboidratos aos 21 dias e redução aos 90 dias; diminuição na oxidação de ácidos graxos aos 60 e 90 dias. Adicionalmente, aumento do desacoplamento mitocondrial entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP aos 60 e 90 dias. Diminuição da CPT1 e aumento da UCP2 aos 21 e 90 dias. Diminuição da PGC-1&#945; aos 60 e 90 dias; da FABPm e CD36 em todas idades. Aumento da 4HNE aos 21 e diminuição aos 90 dias. Diminuição na expressão do mRNA para CPT1 aos 21, 60 dias. Diminuição na expressão do mRNA para PPAR&#945; e aumento na expressão do mRNA para UCP2 aos 21 dias; diminuição na expressão do mRNA para UCP2 ao 60 dias. Alterações morfológicas cardíacas e hepáticas, assim como na ultraestrutura dos cardiomiócitos, em todas as idades, maior conteúdo de glicogênio hepático aos 21 e 90 dias. Concluímos que a hiperalimentação na lactação levou à obesidade, com aumento da oxidação de glicose, alterações no metabolismo energético associadas à diminuição da sensibilidade à insulina, redução da capacidade oxidativa mitocondrial, levando ao desacoplamento e alteração da morfologia e ultraestrutura dos cardiomiócitos do desmame até a idade adulta. / Recent studies have shown that overnutrition in the postnatal period lead obesity, cardiometabolic alterations, insulin resistance at long term. The objective of the study was to investigate the consequences of overnutrition lactation in the hearts of mice pups and adults throughout the development. To induce overnutrition during lactation, the litter size was reduced from three male pups at the third day, overnutrition group (OG). The control group (CG) remained with 9 pups per litter at lactation until weaning. We evaluated the body weight, epididymal and retroperitoneal fat, liver and cardiac morphology, ultrastructure of cardiomyocytes, left ventricle weight/ tibia length ratio, fasting glucose, triglycerides, total cholesterol, plasma insulin and HOMA-IR. The oxygen consumption of cardiac fibers was analyzed by high-resolution respirometry. We evaluated the enzymatic activity of PDH, CS and LDH and liver glycogen. Molecular biology, through: IR&#946;, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPK&#945;, pAMPK&#945;, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1&#945;, PPAR&#945;, 4HNE, eletrons transport chain complex (I, II, III, IV and V), &#945;-tubulin, GP91 and VADC. Differences between groups analyzed by Two-way ANOVA, significance level p <0.05. The OG had increased body weight, epididymal and retroperitoneal fat and total cholesterol in all ages. Fasting glucose, insulin, HOMA-IR and triglyceride levels at 21 and 90 days. Increased Lee index at 60 and 90 days. OG showed a decrease: the IR&#946; and GLUT4 at 21 and 60 days; IR&#946; increased to 90 days; increased IRS1, PTP1B, at 21 and 90 days and AKT, pAMPK/ AMPK and GLUT1 to 21 days; decrease of pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/ AKT at 21 and 90 days; HKII decreased at 21 days and increased at 60 and 90 days; PDH increased to 90 days; increased LDH at 21 days and reduced to 60 days; CS increased at 21 days and decreased at 60 and 90 days; increased oxidation of carbohydrates to 21 days and reduced to 90 days; decrease in fatty acid oxidation at 60 and 90 days. Additionally, increased mitochondrial uncoupling oxidative phosphorylation and ATP synthesis at 60 and 90 days. We observed decrease in CPT1 and increased UCP2 at 21 and 90 days. Decreased PGC-1&#945; at 60 and 90 days and FABPm and CD36 in all ages. increased 4HNE at 21 and decrease at 90 days. However, we observed a decrease in the expression of mRNA for CPT1 to 21 and 60 days. Decrease in mRNA expression of PPAR&#945; and increased in mRNA expression of UCP2 at 21 days; decrease in mRNA expression of UCP2 at 60 days. Heart and liver morphological changes, as well as the ultrastructure of cardiomyocytes, in all ages, hepatic glycogen content at 21 and 90 days. We conclude that the overfeeding lactation led to obesity with increased glucose oxidation, changes in energy metabolism, associated with decreased insulin signaling, reduced mitochondrial oxidative capacity, leading to decoupling and changing the morphology and ultrastructure of cardiomyocytes from weaning to adulthood.

A restrição de sal na dieta está associada com resistência à ação da insulina e obesidade. O mecanismo molecular pelo qual a dieta hipossódica (HO) pode induzir resistência à insulina e obesidade não está totalmente compreendido. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da ingestão crônica de sal sobre o peso corporal (PC), sinalização da insulina no fígado, músculo e tecido adiposo branco (TAB) e sua associação com adiposidade e resistência à insulina. Com esta finalidade, ratos Wistar foram alimentados com dieta HO, normossódica (NR) ou hipersódica (HR) desde o desmame. O PC foi avaliado desde o desmame. Ao completarem 12 semanas de vida, foram avaliados pressão arterial, balanço energético, consumo de ração, glicemia, angiotensina II (ANGIO II) plasmática e perfil hormonal. A atividade motora espontânea foi estudada em ratos com 8 e 12 semanas. A sensibilidade à insulina foi analisada pelo índice de HOMA. A expressão da proteína desacopladora mitocondrial 1 (UPC-1) foi quantificada no tecido adiposo marrom (TAM) e o conteúdo de ANGIO II no TAM, TAB e hipotálamo. As etapas iniciais da sinalização da insulina foram avaliadas por imunoprecipitação e immunoblotting das proteínas envolvidas como o receptor da insulina (IR), substrato 1 e 2 do IR (IRS-1 e IRS-2), enzima fosfatidilinositol 3 – quinase (PI-3q), proteína quinase B (Akt/PKB), ativação da proteína c-jun NH2-terminal quinase (JNK) e fosforilação em serina 307 do IRS-1. O PC no desmame foi semelhante entre os grupos de dieta. No entanto, na idade adulta os ratos em dieta HO apresentaram maior PC, adiposidade visceral, glicemia e insulinemia de jejum, concentração de ANGIO II plasmática e aumento do conteúdo de ANGIO II no TAM. Por outro lado, nestes mesmos animais a dieta HO diminuiu o consumo de ração, o gasto energético, a expressão da proteína UCP-1, adiponectina plasmática e o conteúdo de ANGIO II no TAB. A atividade motora não foi diferente entre os grupos estudados. A dieta HO diminuiu a via IR/PI-3q/Akt/Foxo1 de sinalização da insulina no fígado e músculo. Por outro lado, parte desta via (IRS-2/Akt/Foxo1) mostrou-se aumentada no TAB. No fígado e músculo houve um aumento da fosforilação da proteína JNK associada com maior fosforilação do IRS-1ser307 no grupo HO. Em conclusão, a restrição ou sobrecarga crônica de sal altera a evolução ponderal associada com modificações no balanço energético e no perfil hormonal na idade adulta. A resistência à insulina induzida pela dieta HO é tecido-específico e foi acompanhada por uma ativação da proteína JNK e um aumento da fosforilação dos resíduos de serina 307 do IRS-1. / Restriction of sodium chloride intake has been associated with insulin resistance (INS-R) and obesity. The molecular mechanisms by which the low salt diet (LSD) can induce INS-R and obesity have not yet been established.The aim of the present study was to evaluate the influences of salt intake on body weight (BW) and on insulin signaling in liver, muscle and white adipose tissue (WAT). Wistar rats were fed a LSD, normal (NSD), or high (HSD) salt diet since weaning. At 12 weeks of age, BW, blood pressure(BP),energy balance, food intake, plasma glucose and angiotesin II (ANGIO II), and hormonal profile were evaluated. Afterward, motor activity, HOMA index, uncoupling protein 1 expression (UCP-1) and tissue adipose ANGIO II content was determined. The early steps of insulin signaling (IR: insulin receptor, IRS-1 and IRS-2: IR substrate 1 and 2, PI-3K: phosphatidylinositol 3-kinase), Akt (protein kinase B) phosphorylation, JNK (c-jun NH2-terminal kinase) activation and IRS-1ser307 (serine 307 of IRS-1) phosphorylation were evaluated by immunoprecipitation and immunoblotting. LSD increased BW, visceral adiposity, blood glucose, insulin, leptin, plasma ANGIO II and its content in BAT. Otherwise, LSD decreased food intake, energy expenditure, UCP-1 expression, adiponectin and ANGIO II content in WAT. Motor activity was not influenced by the dietary salt content. In LSD, a decreasing in IR/PI-3K/Akt/Foxo1 was observed in liver and muscle and an increase in this pathway was showed in adipose tissue. JNK activity and IRS-1ser307 phosphorylation were higher in liver and muscle. In conclusion, LSD induced obesity and insulin resistance due to changes in energy expenditure, SRA and insulin signaling. The INS-R is tissuespecific and is accompanied by JNK activation and IRS-1ser307 phosphorylation.

A restrição calórica (RC) estende a expectativa de vida de muitos organismos por mecanismos ainda em estudo. Entre os vários efeitos fisiológicos da RC encontra-se o aumento na biogênese mitocondrial, dependente de óxido nítrico (NO&#8226;), sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Um dos indutores fisiológicos mais potentes da eNOS é a insulina, cujos níveis plasmáticos são consideravelmente reduzidos nos organismos em RC. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos associados ao aumento da sinalização por NO&#8226; durante a RC in vivo e in vitro, e as conseqüências celulares do aumento de massa mitocondrial no que diz respeito à longevidade e capacidade respiratória celulares. Submetemos camundongos Swiss fêmeas à RC de 40% e observamos um considerável aumento tecido-específico na fosforilação basal de Akt e eNOS em músculo esquelético, tecido adiposo visceral e cérebro, os quais também apresentaram maior massa mitocondrial. A associação entre a sinalização por insulina, NO&#8226; e biogênese mitocondrial foi adicionalmente confirmada em um grupo de camundongos tratados com o desacoplador mitocondrial dinitrofenol (DNP), que também reduz a insulinemia e aumenta a longevidade em camundongos. Para o estudo mecanístico deste fenômeno, usamos soros de ratos Sprague-Dawley submetidos à RC de 40% ou alimentados ad libitum (AL) em cultura celular de células vasculares da musculatura lisa (VSMC), reproduzindo um protocolo descrito para RC in vitro. O uso do soro RC aumentou a fosforilação do receptor de insulina e Akt, a expressão de eNOS e nNOS (forma neural da NOS) e a fosforilação de eNOS, o que se refletiu em maior liberação de nitrito (NO2) no meio de cultura. Inibindo-se a Akt, todos os efeitos promovidos pela RC na sinalização por NO&#8226; foram revertidos. Ao se imunoprecipitar do soro a adiponectina, citocina conhecida por aumentar a sensibilidade à insulina, aumentada durante a RC, os efeitos do soro RC na via de sinalização de insulina foram abolidos e, conseqüentemente, os efeitos na sinalização por &#8226;NO foram prevenidos. Neurônios de células granulosas de cerebelo, que não expressam eNOS, apenas nNOS, foram cultivados com os soros AL ou RC, e também apresentaram considerável aumento na sinalização por &#8226;NO. Estas alterações induziram a biogênese mitocondrial e capacidade respiratória, e foram associadas à maior longevidade celular. Os mesmos efeitos mitocondriais foram observados em células secretoras de insulina, INS1, entretanto a secreção de insulina em resposta à glicose tornou-se inibida, por um mecanismo desconhecido, porém associado a reduzidos níveis intracelulares de espécies oxidantes, moléculas-chave para a secreção de insulina; e à alteração da morfologia mitocondrial, provavelmente devido à maior expressão de mitofusina-2 (Mfn-2). Ao se nocautear a Mfn-2, houve um aumento na geração de EROs e as células em RC passaram a secretar insulina a níveis comparáveis aos das células controle. Concluímos que durante a RC a maior sensibilidade à insulina aumenta a atividade de eNOS, via Akt, associada à maior biogênese mitocondrial. A adiponectina é uma molécula-central nestes eventos. A expressão de nNOS também é afetada, por mecanismos desconhecidos. O aumento de biogênese mitocondrial eleva a capacidade respiratória celular e impacta positivamente a longevidade in vitro. A alteração da morfologia mitocondrial associa-se a alterações na produção de oxidantes intracelulares e mudanças na secreção de insulina. / Calorie restriction (RC) is known to extend the lifespan in many organisms, and its mechanisms of action are still under investigation. Enhanced mitochondrial biogenesis driven by nitric oxide (&#8226;NO), synthesized by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS), is proposed to be a CR central effect. Insulin is one of the most potent physiological activators of eNOS. However, plasmatic insulin levels are dramatically reduced in organisms under CR. The goal of this work was uncover the mechanisms associated with enhanced &#8226;NO signaling during CR, in vivo and in vitro, as well as the cellular consequences of increased mitochondrial mass, regarding lifespan and reserve respiratory capability. Female Swiss mice were submitted to 40% of CR. A tissue-specific (skeletal muscle, abdominal adipose tissue and brain) increment in basal Akt and eNOS phosphorylation, which was related to enhanced mitochondrial biogenesis, was observed. Indeed, this association was also verified in tissues from mice treated with low doses of a mitochondrial uncoupler, dinitrophenol (DNP). To unveil the mechanism behind the insulin signaling effects on &#8226;NO levels, serum from Sprague-Dawley rats submmited to 40% of CR was used to culture in VSMC cells, an in vitro CR protocol. CR sera enhanced insulin receptor (IR) and Akt phosphorylation, as well as nitrite (NO2-) accumulation in the culture media, the expression of eNOS and nNOS (neural NOS isoform) and eNOS phosphorylation. The effects of CR sera were reversed by Akt inhibition. The immunoprecipitation of serum adiponectin, a cytokine known to improve peripheral insulin sensitivity, also reversed the CR serum effects on insulin and &#8226;NO signaling. Cerebellar neurons, which do not express eNOS, just nNOS, were also cultured with CR or AL serum and also presented striking increments in &#8226;NO signaling, associated with mitochondrial biogenesis, increased reserve respiratory capability and lifespan extension. The mitochondrial effects promoted by CR were also observed in insulin secreting cells (INS1). However, under the CR condition, insulin secretion stimulated by glucose was impaired. The likely explanations are reduced mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation, or the alteration in mitochondrial morphology, associated, in our model, with enhanced mitofusin-2 expression (Mfn-2). In cells which the Mfn-2 was knocked down, insulin secretion in CR and AL groups was responsive to glucose at the same level, and the intracellular oxidants levels were much higher. Overall, CR improves &#8226;NO signaling due to enhanced insulin sensitivity, through Akt, and results in mitochondrial biogenesis. Adiponectin is a key molecule in this phenomenon. Increments in mitochondrial mass enhance the cellular reserve respiratory capability and lifespan. Mitochondrial morphology alterations are associated with possible decreases in ROS generation and impaired insulin release, maintained the low levels of plasmatic insulin.

A administração de deidroepiandrosterona (DHEA) tem resultado em efeitos anti-diabetogênicos em animais de experimentação e no homem. Assim, o objetivo desse trabalho é avaliar o efeito do DHEA in vitro na expressão protéica do IR, do IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, ERK-1/2; na expressão gênica do PDX-1, do PGC-1, da insulina, do GLUT-2 e da glicocinase; e avaliar a secreção estática de insulina de ilhotas pancreáticas de ratos. O cultivo das ilhotas por 24 horas com DHEA, não induziu nenhuma alteração tanto na expressão das proteínas quanto na secreção estática de insulina estimulada por glicose. Ocorreu aumento da fosforilação de ERK-1/2 e na expressão gênica do PGC-1. As células RINm5F, cultivadas por 72 horas com DHEA, apresentaram aumento da expressão total de IRS-1 e IRS-2. Concluímos, que 24 horas de cultura com ilhotas não é tempo suficiente para observar nenhuma alteração induzida pelo DHEA, na secreção de insulina, e na expressão das proteínas da via IRS/PI3-K/Akt. Células RINm5F podem ser um modelo alternativo para investigar os efeitos diretos do DHEA. / The dehydroepiandrosterone (DHEA) administration has resulted in reduction of abdominal fat and protection against insulin resistance from experimental animals and humans. So, the purpose of this project is measure the in vitro effects from DHEA: on protein expression of insulin receptor, the proteins IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, and ERK-1/2; on gene expression of transcriptional factors PDX-1 and PGC-1, insulin, glucose transport GLUT-2 and glicocinase; and to measure the static insulin secretion, on cultured pancreatic islets of the rat. The culture of pancreatic islet for 24 hours with DHEA, did not induce nothing alteration on protein expression of the IR, IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt-1 and ERK-1/2, and static insulin secretion induced by glucose. However, happened increase ERK-1/2 phosphorylation and PGC-1 gene expression. The RINm5F cells, cultured by 72 hours, showed increase of the IRS-1 and IRS-2 expression. We conclude that 24 hours of the pancreatic islets culture are not sufficient time to look any alteration induced by DHEA, on insulin secretion, and on protein expression involved on IRS/PI3-K/Akt pathway. RINm5F cells can be an alternative model to research the direct effects from DHEA.

A restrição calórica (RC) estende a expectativa de vida de muitos organismos por mecanismos ainda em estudo. Entre os vários efeitos fisiológicos da RC encontra-se o aumento na biogênese mitocondrial, dependente de óxido nítrico (NO&#8226;), sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Um dos indutores fisiológicos mais potentes da eNOS é a insulina, cujos níveis plasmáticos são consideravelmente reduzidos nos organismos em RC. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos associados ao aumento da sinalização por NO&#8226; durante a RC in vivo e in vitro, e as conseqüências celulares do aumento de massa mitocondrial no que diz respeito à longevidade e capacidade respiratória celulares. Submetemos camundongos Swiss fêmeas à RC de 40% e observamos um considerável aumento tecido-específico na fosforilação basal de Akt e eNOS em músculo esquelético, tecido adiposo visceral e cérebro, os quais também apresentaram maior massa mitocondrial. A associação entre a sinalização por insulina, NO&#8226; e biogênese mitocondrial foi adicionalmente confirmada em um grupo de camundongos tratados com o desacoplador mitocondrial dinitrofenol (DNP), que também reduz a insulinemia e aumenta a longevidade em camundongos. Para o estudo mecanístico deste fenômeno, usamos soros de ratos Sprague-Dawley submetidos à RC de 40% ou alimentados ad libitum (AL) em cultura celular de células vasculares da musculatura lisa (VSMC), reproduzindo um protocolo descrito para RC in vitro. O uso do soro RC aumentou a fosforilação do receptor de insulina e Akt, a expressão de eNOS e nNOS (forma neural da NOS) e a fosforilação de eNOS, o que se refletiu em maior liberação de nitrito (NO2) no meio de cultura. Inibindo-se a Akt, todos os efeitos promovidos pela RC na sinalização por NO&#8226; foram revertidos. Ao se imunoprecipitar do soro a adiponectina, citocina conhecida por aumentar a sensibilidade à insulina, aumentada durante a RC, os efeitos do soro RC na via de sinalização de insulina foram abolidos e, conseqüentemente, os efeitos na sinalização por &#8226;NO foram prevenidos. Neurônios de células granulosas de cerebelo, que não expressam eNOS, apenas nNOS, foram cultivados com os soros AL ou RC, e também apresentaram considerável aumento na sinalização por &#8226;NO. Estas alterações induziram a biogênese mitocondrial e capacidade respiratória, e foram associadas à maior longevidade celular. Os mesmos efeitos mitocondriais foram observados em células secretoras de insulina, INS1, entretanto a secreção de insulina em resposta à glicose tornou-se inibida, por um mecanismo desconhecido, porém associado a reduzidos níveis intracelulares de espécies oxidantes, moléculas-chave para a secreção de insulina; e à alteração da morfologia mitocondrial, provavelmente devido à maior expressão de mitofusina-2 (Mfn-2). Ao se nocautear a Mfn-2, houve um aumento na geração de EROs e as células em RC passaram a secretar insulina a níveis comparáveis aos das células controle. Concluímos que durante a RC a maior sensibilidade à insulina aumenta a atividade de eNOS, via Akt, associada à maior biogênese mitocondrial. A adiponectina é uma molécula-central nestes eventos. A expressão de nNOS também é afetada, por mecanismos desconhecidos. O aumento de biogênese mitocondrial eleva a capacidade respiratória celular e impacta positivamente a longevidade in vitro. A alteração da morfologia mitocondrial associa-se a alterações na produção de oxidantes intracelulares e mudanças na secreção de insulina. / Calorie restriction (RC) is known to extend the lifespan in many organisms, and its mechanisms of action are still under investigation. Enhanced mitochondrial biogenesis driven by nitric oxide (&#8226;NO), synthesized by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS), is proposed to be a CR central effect. Insulin is one of the most potent physiological activators of eNOS. However, plasmatic insulin levels are dramatically reduced in organisms under CR. The goal of this work was uncover the mechanisms associated with enhanced &#8226;NO signaling during CR, in vivo and in vitro, as well as the cellular consequences of increased mitochondrial mass, regarding lifespan and reserve respiratory capability. Female Swiss mice were submitted to 40% of CR. A tissue-specific (skeletal muscle, abdominal adipose tissue and brain) increment in basal Akt and eNOS phosphorylation, which was related to enhanced mitochondrial biogenesis, was observed. Indeed, this association was also verified in tissues from mice treated with low doses of a mitochondrial uncoupler, dinitrophenol (DNP). To unveil the mechanism behind the insulin signaling effects on &#8226;NO levels, serum from Sprague-Dawley rats submmited to 40% of CR was used to culture in VSMC cells, an in vitro CR protocol. CR sera enhanced insulin receptor (IR) and Akt phosphorylation, as well as nitrite (NO2-) accumulation in the culture media, the expression of eNOS and nNOS (neural NOS isoform) and eNOS phosphorylation. The effects of CR sera were reversed by Akt inhibition. The immunoprecipitation of serum adiponectin, a cytokine known to improve peripheral insulin sensitivity, also reversed the CR serum effects on insulin and &#8226;NO signaling. Cerebellar neurons, which do not express eNOS, just nNOS, were also cultured with CR or AL serum and also presented striking increments in &#8226;NO signaling, associated with mitochondrial biogenesis, increased reserve respiratory capability and lifespan extension. The mitochondrial effects promoted by CR were also observed in insulin secreting cells (INS1). However, under the CR condition, insulin secretion stimulated by glucose was impaired. The likely explanations are reduced mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation, or the alteration in mitochondrial morphology, associated, in our model, with enhanced mitofusin-2 expression (Mfn-2). In cells which the Mfn-2 was knocked down, insulin secretion in CR and AL groups was responsive to glucose at the same level, and the intracellular oxidants levels were much higher. Overall, CR improves &#8226;NO signaling due to enhanced insulin sensitivity, through Akt, and results in mitochondrial biogenesis. Adiponectin is a key molecule in this phenomenon. Increments in mitochondrial mass enhance the cellular reserve respiratory capability and lifespan. Mitochondrial morphology alterations are associated with possible decreases in ROS generation and impaired insulin release, maintained the low levels of plasmatic insulin.

A restrição de sal na dieta está associada com resistência à ação da insulina e obesidade. O mecanismo molecular pelo qual a dieta hipossódica (HO) pode induzir resistência à insulina e obesidade não está totalmente compreendido. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da ingestão crônica de sal sobre o peso corporal (PC), sinalização da insulina no fígado, músculo e tecido adiposo branco (TAB) e sua associação com adiposidade e resistência à insulina. Com esta finalidade, ratos Wistar foram alimentados com dieta HO, normossódica (NR) ou hipersódica (HR) desde o desmame. O PC foi avaliado desde o desmame. Ao completarem 12 semanas de vida, foram avaliados pressão arterial, balanço energético, consumo de ração, glicemia, angiotensina II (ANGIO II) plasmática e perfil hormonal. A atividade motora espontânea foi estudada em ratos com 8 e 12 semanas. A sensibilidade à insulina foi analisada pelo índice de HOMA. A expressão da proteína desacopladora mitocondrial 1 (UPC-1) foi quantificada no tecido adiposo marrom (TAM) e o conteúdo de ANGIO II no TAM, TAB e hipotálamo. As etapas iniciais da sinalização da insulina foram avaliadas por imunoprecipitação e immunoblotting das proteínas envolvidas como o receptor da insulina (IR), substrato 1 e 2 do IR (IRS-1 e IRS-2), enzima fosfatidilinositol 3 – quinase (PI-3q), proteína quinase B (Akt/PKB), ativação da proteína c-jun NH2-terminal quinase (JNK) e fosforilação em serina 307 do IRS-1. O PC no desmame foi semelhante entre os grupos de dieta. No entanto, na idade adulta os ratos em dieta HO apresentaram maior PC, adiposidade visceral, glicemia e insulinemia de jejum, concentração de ANGIO II plasmática e aumento do conteúdo de ANGIO II no TAM. Por outro lado, nestes mesmos animais a dieta HO diminuiu o consumo de ração, o gasto energético, a expressão da proteína UCP-1, adiponectina plasmática e o conteúdo de ANGIO II no TAB. A atividade motora não foi diferente entre os grupos estudados. A dieta HO diminuiu a via IR/PI-3q/Akt/Foxo1 de sinalização da insulina no fígado e músculo. Por outro lado, parte desta via (IRS-2/Akt/Foxo1) mostrou-se aumentada no TAB. No fígado e músculo houve um aumento da fosforilação da proteína JNK associada com maior fosforilação do IRS-1ser307 no grupo HO. Em conclusão, a restrição ou sobrecarga crônica de sal altera a evolução ponderal associada com modificações no balanço energético e no perfil hormonal na idade adulta. A resistência à insulina induzida pela dieta HO é tecido-específico e foi acompanhada por uma ativação da proteína JNK e um aumento da fosforilação dos resíduos de serina 307 do IRS-1. / Restriction of sodium chloride intake has been associated with insulin resistance (INS-R) and obesity. The molecular mechanisms by which the low salt diet (LSD) can induce INS-R and obesity have not yet been established.The aim of the present study was to evaluate the influences of salt intake on body weight (BW) and on insulin signaling in liver, muscle and white adipose tissue (WAT). Wistar rats were fed a LSD, normal (NSD), or high (HSD) salt diet since weaning. At 12 weeks of age, BW, blood pressure(BP),energy balance, food intake, plasma glucose and angiotesin II (ANGIO II), and hormonal profile were evaluated. Afterward, motor activity, HOMA index, uncoupling protein 1 expression (UCP-1) and tissue adipose ANGIO II content was determined. The early steps of insulin signaling (IR: insulin receptor, IRS-1 and IRS-2: IR substrate 1 and 2, PI-3K: phosphatidylinositol 3-kinase), Akt (protein kinase B) phosphorylation, JNK (c-jun NH2-terminal kinase) activation and IRS-1ser307 (serine 307 of IRS-1) phosphorylation were evaluated by immunoprecipitation and immunoblotting. LSD increased BW, visceral adiposity, blood glucose, insulin, leptin, plasma ANGIO II and its content in BAT. Otherwise, LSD decreased food intake, energy expenditure, UCP-1 expression, adiponectin and ANGIO II content in WAT. Motor activity was not influenced by the dietary salt content. In LSD, a decreasing in IR/PI-3K/Akt/Foxo1 was observed in liver and muscle and an increase in this pathway was showed in adipose tissue. JNK activity and IRS-1ser307 phosphorylation were higher in liver and muscle. In conclusion, LSD induced obesity and insulin resistance due to changes in energy expenditure, SRA and insulin signaling. The INS-R is tissuespecific and is accompanied by JNK activation and IRS-1ser307 phosphorylation.

A administração de deidroepiandrosterona (DHEA) tem resultado em efeitos anti-diabetogênicos em animais de experimentação e no homem. Assim, o objetivo desse trabalho é avaliar o efeito do DHEA in vitro na expressão protéica do IR, do IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, ERK-1/2; na expressão gênica do PDX-1, do PGC-1, da insulina, do GLUT-2 e da glicocinase; e avaliar a secreção estática de insulina de ilhotas pancreáticas de ratos. O cultivo das ilhotas por 24 horas com DHEA, não induziu nenhuma alteração tanto na expressão das proteínas quanto na secreção estática de insulina estimulada por glicose. Ocorreu aumento da fosforilação de ERK-1/2 e na expressão gênica do PGC-1. As células RINm5F, cultivadas por 72 horas com DHEA, apresentaram aumento da expressão total de IRS-1 e IRS-2. Concluímos, que 24 horas de cultura com ilhotas não é tempo suficiente para observar nenhuma alteração induzida pelo DHEA, na secreção de insulina, e na expressão das proteínas da via IRS/PI3-K/Akt. Células RINm5F podem ser um modelo alternativo para investigar os efeitos diretos do DHEA. / The dehydroepiandrosterone (DHEA) administration has resulted in reduction of abdominal fat and protection against insulin resistance from experimental animals and humans. So, the purpose of this project is measure the in vitro effects from DHEA: on protein expression of insulin receptor, the proteins IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, and ERK-1/2; on gene expression of transcriptional factors PDX-1 and PGC-1, insulin, glucose transport GLUT-2 and glicocinase; and to measure the static insulin secretion, on cultured pancreatic islets of the rat. The culture of pancreatic islet for 24 hours with DHEA, did not induce nothing alteration on protein expression of the IR, IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt-1 and ERK-1/2, and static insulin secretion induced by glucose. However, happened increase ERK-1/2 phosphorylation and PGC-1 gene expression. The RINm5F cells, cultured by 72 hours, showed increase of the IRS-1 and IRS-2 expression. We conclude that 24 hours of the pancreatic islets culture are not sufficient time to look any alteration induced by DHEA, on insulin secretion, and on protein expression involved on IRS/PI3-K/Akt pathway. RINm5F cells can be an alternative model to research the direct effects from DHEA.