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Echantillonnage compressif appliqué à la microscopie de fluorescence et à la microscopie de super résolution / Compressive fluorescence microscopy for biological imaging and super resolution microscopy.Chahid, Makhlad 19 December 2014 (has links)
Mes travaux de thèse portent sur l’application de la théorie de l’échantillonnagecompressif (Compressed Sensing ou Compressive Sampling, CS) à la microscopie defluorescence, domaine en constante évolution et outil privilégié de la recherche fondamentaleen biologie. La récente théorie du CS a démontré que pour des signauxparticuliers, dits parcimonieux, il est possible de réduire la fréquence d’échantillonnagede l’information à une valeur bien plus faible que ne le prédit la théorie classiquede l’échantillonnage. La théorie du CS stipule qu’il est possible de reconstruireun signal, sans perte d’information, à partir de mesures aléatoires fortement incomplèteset/ou corrompues de ce signal à la seule condition que celui-ci présente unestructure parcimonieuse.Nous avons développé une approche expérimentale inédite de la théorie du CSà la microscopie de fluorescence, domaine où les signaux sont naturellement parcimonieux.La méthode est basée sur l’association d’une illumination dynamiquestructurée à champs large et d’une détection rapide à point unique. Cette modalitépermet d’inclure l’étape de compression pendant l’acquisition. En outre, nous avonsmontré que l’introduction de dimensions supplémentaires (2D+couleur) augmentela redondance du signal, qui peut être pleinement exploitée par le CS afin d’atteindredes taux de compression très importants.Dans la continuité de ces travaux, nous nous sommes intéressés à une autre applicationdu CS à la microscopie de super résolution, par localisation de moléculesindividuelles (PALM/STORM). Ces nouvelles techniques de microscopie de fluorescenceont permis de s’affranchir de la limite de diffraction pour atteindre des résolutionsnanométriques. Nous avons exploré la possibilité d’exploiter le CS pour réduiredrastiquement les temps d’acquisition et de traitement.Mots clefs : échantillonnage compressif, microscopie de fluorescence, parcimonie,microscopie de super résolution, redondance, traitement du signal, localisation demolécules uniques, bio-imagerie / My PhD work deals with the application of Compressed Sensing (or CompressiveSampling, CS) in fluorescence microscopy as a powerful toolkit for fundamental biologicalresearch. The recent mathematical theory of CS has demonstrated that, for aparticular type of signal, called sparse, it is possible to reduce the sampling frequencyto rates well below that which the sampling theorem classically requires. Its centralresult states it is possible to losslessly reconstruct a signal from highly incompleteand/or inaccurate measurements if the original signal possesses a sparse representation.We developed a unique experimental approach of a CS implementation in fluorescencemicroscopy, where most signals are naturally sparse. Our CS microscopecombines dynamic structured wide-field illumination with fast and sensitive singlepointfluorescence detection. In this scheme, the compression is directly integratedin the measurement process. Additionally, we showed that introducing extra dimensions(2D+color) results in extreme redundancy that is fully exploited by CS to greatlyincrease compression ratios.The second purpose of this thesis is another appealing application of CS forsuper-resolution microscopy using single molecule localization techniques (e.g.PALM/STORM). This new powerful tool has allowed to break the diffraction barrierdown to nanometric resolutions. We explored the possibility of using CS to drasticallyreduce acquisition and processing times.
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Development of advanced methods for super-resolution microscopy data analysis and segmentation / Développement de méthodes avancées pour l'analyse et la segmentation de données de microscopie à super-résolutionAndronov, Leonid 09 January 2018 (has links)
Parmi les méthodes de super-résolution, la microscopie par localisation de molécules uniques se distingue principalement par sa meilleure résolution réalisable en pratique mais aussi pour l’accès direct aux propriétés des molécules individuelles. Les données principales de la microscopie par localisation sont les coordonnées des fluorochromes, un type de données peu répandu en microscopie conventionnelle. Le développement de méthodes spéciales pour le traitement de ces données est donc nécessaire. J’ai développé les logiciels SharpViSu et ClusterViSu qui permettent d’effectuer les étapes de traitements les plus importantes, notamment une correction des dérives et des aberrations chromatiques, une sélection des événements de localisations, une reconstruction des données dans des images 2D ou dans des volumes 3D par le moyen de différentes techniques de visualisation, une estimation de la résolution à l’aide de la corrélation des anneaux de Fourier, et une segmentation à l’aide de fonctions K et L de Ripley. En plus, j’ai développé une méthode de segmentation de données de localisation en 2D et en 3D basée sur les diagrammes de Voronoï qui permet un clustering de manière automatique grâce à modélisation de bruit par les simulations Monte-Carlo. En utilisant les méthodes avancées de traitement de données, j’ai mis en évidence un clustering de la protéine CENP-A dans les régions centromériques des noyaux cellulaires et des transitions structurales de ces clusters au moment de la déposition de la CENP-A au début de la phase G1 du cycle cellulaire. / Among the super-resolution methods single-molecule localization microscopy (SMLM) is remarkable not only for best practically achievable resolution but also for the direct access to properties of individual molecules. The primary data of SMLM are the coordinates of individual fluorophores, which is a relatively rare data type in fluorescence microscopy. Therefore, specially adapted methods for processing of these data have to be developed. I developed the software SharpViSu and ClusterViSu that allow for most important data processing steps, namely for correction of drift and chromatic aberrations, selection of localization events, reconstruction of data in 2D images or 3D volumes using different visualization techniques, estimation of resolution with Fourier ring correlation, and segmentation using K- and L-Ripley functions. Additionally, I developed a method for segmentation of 2D and 3D localization data based on Voronoi diagrams, which allows for automatic and unambiguous cluster analysis thanks to noise modeling with Monte-Carlo simulations. Using advanced data processing methods, I demonstrated clustering of CENP-A in the centromeric regions of the cell nucleus and structural transitions of these clusters upon the CENP-A deposition in early G1 phase of the cell cycle.
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Microscopie super-résolutive aux synapses inhibitrices mixtes : régulation différentielle des GlyRs et des GABAARs par l’activité excitatrice / Glycine/GABA mixed inhibitory synapses studied with super-resolution microscopy : differential regulation of GlyRs and GABAARs by excitatory activityYang, Xiaojuan 10 September 2019 (has links)
La microscopie optique stochastique de reconstruction (STORM) contourne la limite de diffraction en enregistrant des signaux monomoléculaires spatialement et temporellement séparés, atteignant une résolution de ~10-40 nm. Dans mon étude, j'ai développé une stratégie d'imagerie et d'analyse de données dSTORM bicolore afin d'étudier l'ultrastructure des synapses inhibitrices mixtes. Mes résultats ont montré que les GlyRs, les GABAARs, la géphyrine et RIM1/2 présentent une organisation intra-synaptique hétérogène et forment des domaines sous-synaptiques (SSDs). Les GlyR et les GABAAR ne sont pas complètement mélangés, mais peuvent occuper des espaces différents à la densité post-synaptique (PSD). De plus, les SSD de géphyrine postsynaptique sont alignées avec les SSD de RIM1/2 pré-synaptiques, formant des nanocolonnes trans-synaptiques. Au cours d'une activité neuronale élevée par traitement 4-AP, la corrélation spatiale entre les GlyRs, les GABAARs et la géphyrine a augmentée au PSD. De plus, la corrélation spatiale des GlyRs et RIM1/2 a également augmenté, tandis que celle des GABAARs et RIM1/2 n'a pas changé. Le nombre de SSD par synapse pour ces protéines synaptiques n'est pas modifié par 4-AP. Cette étude fourni un nouvel angle de compréhension des mécanismes sous-jacents à la co-transmission GABAergique/glycinergique. / Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) bypasses the diffraction limit by recording spatially and temporally separated single molecule signals, achieving a resolution of ~10-40 nm. In my study, I have developed a two-color dSTORM imaging and data analysis strategy, in order to investigate the ultrastructure of mixed inhibitory synapses. My results show that GlyRs, GABAARs, gephyrin and RIM1/2 exhibit a heterogeneous intra-synaptic organization and form sub-synaptic domains (SSDs). GlyRs and GABAARs were not fully intermingled, but sometimes occupied different spaces at the post-synaptic density (PSD). In addition, post-synaptic gephyrin SSDs were aligned with pre-synaptic RIM1/2 SSDs, forming trans-synaptic nanocolumns. During elevated neuronal activity by 4-AP treatment, the spatial correlation between GlyRs, GABAARs and gephyrin was increased at the PSD. Moreover, the spatial correlation of GlyRs and RIM1/2 was also increased, while that of GABAARs and RIM1/2 did not change. The number of SSDs per synapse for these synaptic proteins was not changed by 4-AP. My study thus provides a new angle for understanding the mechanisms underlying GABAergic/glycinergic co-transmission.
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