Acenes are a class of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) with linearly fused benzene rings. They are widely considered as promising materials for organic and molecular electronics. However, larger molecules of this class possessing more than five rings are chemically extremely reactive and show a very low solubility. Hence, large acenes are difficult to handle, and the experimental data available to date is limited. The aim of this work is to show a very promising protocol of how acenes with different lengths can be stabilized and investigated on metallic surfaces. The experimental approach of on-surface synthesis is explored to generate the respective acenes directly on the metallic substrate via the reduction of suitable precursor molecules. High-resolution scanning probe microscopy (SPM) is employed at a temperature of 5 K to verify the chemical conversion at a single-molecule level. In the first part of this work, the on-surface synthesis of acenes is introduced via the example of tetracene (4-acene) formation on Cu(111). Precursors with 1,4-epoxy moieties preferably adsorb with their oxygen-rich site facing the substrate. Subsequently, they can be deoxygenated via annealing of the substrate or by single-molecule manipulation with the tip of the scanning probe microscope. In both cases, atomic force microscopy (AFM) measurements resolve the planar adsorption geometry of tetracene on the surface with atomic resolution. Based on these findings, scanning tunneling microscopy (STM) is employed to investigate the self-assembly patterns of on-surface generated anthracene (3-acene) and tetracene molecules after synthesis on Au(111). These measurements show intriguing organic nanostructures and supramolecular networks that can form at the metallic interface upon thermally-induced surface reactions. The second part of this thesis focuses on the electronic structure of acenes adsorbed on a metallic substrate. By applying the novel method of on-surface reduction, single and isolated hexacene (6-acene) molecules are investigated on Au(111). Scanning tunneling spectroscopy (STS) measurements indicate a weak interaction with the substrate and reveal five accessible molecular resonances at the organic-metal interface. The differential conductance maps with high spatial resolution at the respective resonant bias values compare well to elastic scattering quantum chemistry-based calculations. Finally, the experimental investigations of Br-substituted precursors show the stabilization of genuine unsubstituted heptacene (7-acene), as confirmed by imaging of the molecular structure via atomic-resolution STM. Accordingly, the precise characterization of this molecule via STS allows more insight into the electronic structure of adsorbed acenes with respect to their length. / Acene sind eine Klasse von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen mit linear kondensierten Benzolringen. Sie gelten weithin als vielversprechende Materialien für die organische und molekulare Elektronik. Jedoch sind die größeren Moleküle dieser Klasse mit mehr als fünf Ringen chemisch extrem reaktiv und zeigen eine sehr geringe Löslichkeit, daher gibt es bisher nur wenige experimentelle Untersuchungen ihrer Eigenschaften. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Acene mit unterschiedlichen Längen auf einer metallischen Oberfläche stabilisieren und untersuchen zu können. Dabei wird der experimentelle Ansatz der Oberflächensynthese verfolgt und die jeweiligen Acene durch Reduktion von geeigneten Präkursoren direkt an einer metallischen Grenzfläche hergestellt. Hochauflösende Rastersondenmikroskopie an einzelnen Molekülen bei einer Temperatur von 5K nimmt dabei eine Schlüsselrolle im Nachweis der chemischen Umwandlung auf der Oberfläche ein. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Oberflächensynthese von Acenen am Beispiel von Tetracen (4-Acen) auf Cu(111) eingeführt. Die Ausgangsmoleküle mit funktionellen Gruppen adsorbieren bevorzugt mit ihrer sauerstoffreichen Seite auf dem Substrat und können dort sowohl thermisch als auch mithilfe der Spitze des Rastersondenmikroskops umgewandelt werden. In beiden Fällen wird die planare Adsorptionsgeometrie von Tetracen auf der Oberfläche mittels Rasterkraftmikroskopie mit atomarer Auflösung abgebildet. Darauf aufbauend wird Rastertunnelmikroskopie genutzt, um die Selbstassemblierung von Anthracen (3-Acen) und Tetracen nach der jeweiligen Synthese auf Au(111) zu untersuchen. Die Messungen zeigen unerwartete organische Nanostrukturen und supramolekulare Netzwerke, welche sich an der metallischen Grenzfläche durch die induzierte Oberflächenreduktion bilden können. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit den elektronischen Eigenschaften von adsorbierten Acenen. Durch die neuartige Methode der Oberflächenreduktion können einzelne Hexacene (6-Acen) auf Au(111) untersucht werden. Messungen basierend auf Rastertunnelspektroskopie geben Hinweise auf die schwache Wechselwirkung mit dem Substrat und zeigen fünf molekulare Eigenzustände, die im Experiment zugänglich sind. Die entsprechenden Abbildungen der differentiellen Leitfähigkeiten mit hoher Ortsauflösung sind in guter Übereinstimmung mit einer quantenmechanischen Modellierung. Schließlich wird die Stabilisierung von Heptacen (7-Acen) von Br-substituierten Präkursoren mittels Rastertunnelmikroskopie mit atomarer Auflösung gezeigt. Dadurch kann die elektronische Struktur von adsorbierten Acenen anhand ihrer Länge verglichen werden.

Die Genexpression ist ein stochastischer Prozess, dessen strenge Regulation einen ungestörten Zellzyklusverlauf ermöglicht. Jeglicher Stress löst eine Neuprogrammierung der Expression und somit einen Stillstand des Zellzyklus aus. Um ein besseres Verständnis des eukaryotischen Zellzyklus zu erlangen, wurde in dieser Arbeit die Fluoreszenzmikroskopie einzelner Zellen (S.cerevisiae) mit stochastischer Modellierung der Hauptregulatorgene des G1/S-Übergangs (SIC1, CLN2, CLB5) kombiniert. Mithilfe des MS2-CP-Systems wurden mRNA-Level von SIC1 in lebenden Zellen bestimmt und verschiedene Transportwege von SIC1-mRNA visualisiert. RNA-FISH in Kombination mit genetischen und morphologischen Markierungen ermöglichte es, die absolute Quantifizierung von SIC1-, CLN2- und CLB5-mRNA in allen Zyklusphasen vorzunehmen. Die Auswirkung von Osmostress, in Hinblick auf eine transkriptionale Verzerrung, wurde untersucht. Basierend auf den experimentellen-Daten wurde ein stochastisches Model entwickelt, dass die Expression von SIC1, CLN2 und CLB5 mRNA und Proteinlevel in Abhängigkeit von Osmostress über den gesamten Zellzyklus hinweg abbildet. Die Modellierung ermöglichte eine in silico Synchronisation und somit die Extraktion kinetischer Parameter. Die Expression der beobachteten Gene wurde im Verlauf des Zellzyklus nicht ein- und ausgeschaltet, stattdessen kam es zu Phasen hoher oder niedriger Expression. Niedriger SIC1 Expression gewährleistete niedriger Sic1 Protein Verzerrung und robustes G1/S Timing. CLN2 und CLB5 zeigten ein maximales Expressionslevel in G1 und auch eine erhöhte Expression in der späten Mitose. Osmostress induzierte einen langanhaltenden Effekt auf die Transkription und die Dauer der Zellzyklusphasen. Der hier vorgestellte Ansatz ermöglichte quantitative Einblicke in die Genexpression und zeitliche Koordination des Zellzyklus von S.cerevisiae. Einige der hier beobachteten Regulationsmechanismen könnten allgemeine Gültigkeit im eukaryotischen Zellzyklus besitzen. / Gene expression is a stochastic process and its appropriate regulation is critical for cell cycle progression. Cellular stress response requires expression reprogramming and cell cycle arrest. Time-resolved quantitative methods on single cells are needed to understand eukaryotic cell cycle in context of noisy gene expression and external perturbations. We applied single-cell fluorescence microscopy and stochastic modeling to SIC1, CLN2 and CLB5, the main G1/S regulators in S. cerevisiae. Using MS2-CP system we estimated SIC1 mRNA levels and visualized different types of transport for SIC1 mRNA particles in living cells. With RNA-FISH combined to genetic and morphological markers we monitored absolute numbers of mRNA and transcriptional noise over cell cycle phases with and without osmostress. Stochastic modeling enabled in silico synchronization, the extraction of kinetic parameters as well as expanded the static mRNA data into time courses for mRNAs, proteins and their noise. Based on our experimental data we developed a stochastic model of G1/S timing centered on SIC1 and a second one for the entire cell cycle involving SIC1, CLN2 and CLB5 and the response to osmostress. All three genes exhibited basal expression throughout cell cycle enlightening that transcription is not divided in on and off but rather in high and low phases. A low SIC1 transcript level ensured a low protein noise and a robust timing of the G1/S transition. CLN2 and CLB5 showed main expression peaks in G1 as well as an expression upshift in late mitosis. Osmostress induced different periods of transcriptional inhibition for CLN2 and CLB5 and long-term impact on cell cycle phase duration. Our approach disclosed detailed quantitative insights into gene expression and cell cycle timing, not available from bulk experiments. Importantly some regulation mechanisms specific to SIC1, CLN2 and CLB5 might be generalized to other genes as well as to other organisms.

Les ARNm sont des molécules centrales pour la régulation des gènes, aidant à convertir l'information génétique stockée dans l'ADN en protéines fonctionnelles. En tant que polymère simple brin, mesurant des centaines à des milliers de nucléotides, les ARNm peuvent former des structures secondaires et tertiaires étendues formant des particules appelés ribonucléoprotéines messagères (RNPm) en s’assemblant avec des protéines. L'organisation 3D des (pré-)RNPm influence de nombreux aspects de leur métabolisme, incluant la régulation de leur maturation, de leur export et de leur traduction dans le cytoplasme. Malgré leur importance, notre compréhension de l'organisation structurelle des (pré-)RNPm in vivo, et des principes qui la régissent est minime. Au cours de ma thèse, j'ai analysé l'organisation des (pré-)mRNP en développant une vision centrée sur l'ARN. Pour cela, j'ai mis en place une approche combinant l'hybridation in situ d'ARN monomoléculaire (smFISH) avec la microscopie à illumination structurée (SIM) et l'ai utilisée pour étudier l'organisation des mRNP dans le noyau et le cytoplasme. Nos résultats suggèrent que l'organisation (pré-)mRNP varie à différents stades de sa vie. Nous montrons que l'empaquetage (pré-)mRNP commence de manière co-transcriptionnelle, avec des introns organisés en conformations compactes. Cette organisation est modifiée au cours de la transcription au fur et à mesure que la polymérase se déplace le long du gène, assemblant finalement un intron avec les extrémités à proximité l’une de l’autre, d'une manière dépendante du spliceosome, suggérant que l'organisation co-transcriptionnelle des introns pourrait être critique pour déterminer son excision. Une fois libérés, les mRNP ont une organisation linéaire compacte dans le nucléoplasme et éventuellement une conformation en tige. L'organisation d’un mRNP dans le cytoplasme est influencée par sa traduction. Alors que la traduction ouvre les mRNP, la séparation des extrémités de l'ARNm, l'inhibition de la traduction et la libération de ribosomes, ou le recrutement dans les granules de stress, donnent aux mRNP une structure très compacte. Fait intéressant, nous trouvons rarement des ARNm avec les extrémités 5' et 3' à proximité, ce qui suggère que la traduction en boucle fermée n'est pas un état universel pour tous les ARNm en cours de traduction. Ensemble, nos résultats fournissent une image essentielle de l'organisation du mRNP dans les cellules et souligne le rôle important de la conformation du RNPm dans la régulation de la traduction et de la maturation d’une RNPm. / mRNAs act as the central molecules in gene regulation, helping convert the genetic information stored in the DNA to functional proteins. As a single-stranded polymer, hundreds to thousands of nucleotides in length, mRNAs can form extensive secondary and tertiary structures and, together with proteins, are packaged into assemblies called messenger ribonucleoproteins (mRNPs). The 3D organisation of (pre-)mRNPs influences many aspects of what happens to them, including regulating their processing, export and translation in the cytoplasm. Despite their significance, our understanding of the structural organisation of (pre-)mRNPs in vivo is minimal, as is our comprehension of the principles that govern it. During my PhD, I have developed an RNA-centric view on (pre-)mRNP organisation. For this, I have established an approach combining single-molecule RNA in situ hybridisation (smFISH) with structured illumination microscopy (SIM) and used it to study mRNP organisation in the nucleus and cytoplasm. Our results suggest that (pre-)mRNP organisation is altered at various stages during its lifetime. We show that (pre-)mRNP packaging starts co-transcriptionally, with introns organised into compact conformations. This organisation is altered during the course of transcription as the polymerase travels along the gene, finally assembling an intron with the ends in proximity in a spliceosome dependent manner, suggesting that co-transcriptional intron organisation could be critical in determining its excision. Once released, mRNPs have a compact linear organisation in the nucleoplasm and possibly a rod-like conformation. mRNP organisation in the cytoplasm is influenced by its translational status. While translation opens up mRNPs, separating the ends of the mRNA, translation inhibition and release of ribosomes, or recruitment to stress granules result in mRNPs having a highly compact structure. Interestingly, we rarely find mRNAs with the 5’ and 3’ ends in proximity, suggesting that closed-looped translation is not a universal state for all translating mRNAs. Together, our results provide a unique and essential view of mRNP organisation in cells and reveal important insight into the role of mRNP conformation in regulating translation and mRNP processing.

Heterogeneous line broadening and spectral diffusion of the fluorescence emission spectra of perylene diimide molecules have been investigated by means of time dependent single molecule spectroscopy. The influence of temperature and environment has been studied and reveals strong correlation to spectral diffusion processes. We followed the freezing of the molecular mobility of quasi free molecules on the surface upon temperature lowering and by embedding into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) polymer. Thereby changes of optical transition energies as a result of both intramolecular changes of conformation and external induced dynamics by the surrounding polymer matrix could be observed. Simulations of spectral fluctuations within a two-level system (TLS) model showed good agreement with the experimental findings.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Verwendung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe in Form photostabiler Perylenbisimide sowie etallischer Nanopartikel zur Untersuchung von Polymeren und nanoskopischen Flüssigkeitsfilmen. Einzelmoleküluntersuchungen zeigen, dass eine chemische Modifizierung der Farbstoffe durch löslichkeitserhöhende Seitengruppen, Molekülkonformationen mit stark variierenden Emissionswellenlängen je nach Seitengruppen-orientierung zur Folge hat. Zeitabhängige Fluoreszenzmessungen an einzelnen Molekülen ermöglichen eine direkte Beobachtung von Übergängen zwischen diesen molekularen Konformationen deren Dynamik vorwiegend durch die Eigenschaften der umgebenden Polymermatrix bestimmt wird. Die gewonnenen Ergebnisse lassen somit Rückschlüsse auf die nanoskopische Umgebung des Moleküls zu. Es werden diskrete Zustände innerhalb der Molekülumgebung sowie eine erhöhte Konformationsdynamik im Falle von alkylsubstituierten Perylenbisimiden beobachtet. Darüber hinaus werden die nanoskopischen Auswirkungen von makroskopischen, mechanischen Deformationen auf amorphe Polymerfilme mikrorheologisch mit Hilfe von stäbchenförmigen Perylenbisimiden studiert. Die gewonnenen Einzelmoleküldaten ermöglichen die Berechnung der lokalen, mikroskopischen Deformation sowie der Orientierung der Sondenmoleküle, welche gut mit einem Model für stäbchenförmige Objekte in einem uniaxial deformierten Kontinuum übereinstimmt. In weiteren Experimenten gelingt der Nachweis ultradünner Wasserfilme auf SiO2-Oberflächen durch Messung der Diffusion von Silbernanopartikeln. Die verwendeten Nanopartikel weisen hierbei eine monodisperse Größenverteilung im Bereich von einem Nanometer als Resultat ihrer Synthese in Y-Zeolith-Kristallen auf. Die Untersuchungen ergeben eine Filmdickenabhängigkeit des Diffusionsverhaltens sowie einen starken Einfluss durch Oberflächensilanisierung bzw. Hydroxylierung.

In this work, low dimensional iron group clusters have been studied by application of high magnetic fields. The magnetization has been probed with an MPMS as function of temperature and field. The combination with pulse field measurements up to 52\,T allowed determination of the magnetic exchange coupling parameters, and to probing the effective spin of the ground state. The main focus was on tunable high-field/high-frequency (tHF) ESR in static fields < 17 T and pulse field ESR up to 36 T. This magnetic resonance method has been used for the characterization of the local magnetic properties: The detailed analysis of the field dependence of dedicated spin states allowed to determine the magnetic anisotropy and g-factors. The results were analyzed in the framework of the appropriate effective spin Hamiltonians in terms of magnetization fits and ESR spectrum simulations.

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Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the gene that codes for the chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Recent advances in CF treatment have included use of small-molecule drugs known as modulators, such as Lumacaftor (VX-809), but their detailed mechanism of action and interplay with the surrounding lipid membranes, including cholesterol, remain largely unknown. To examine these phenomena and guide future modulator development, we prepared a set of wild type (WT) and mutant helical hairpin constructs consisting of CFTR transmembrane (TM) segments 3 and 4 and the intervening extracellular loop (termed TM3/4 hairpins) that represent minimal membrane protein tertiary folding units. These hairpin variants, including CF-phenotypic loop mutants E217G and Q220R, and membrane-buried mutant V232D, were reconstituted into large unilamellar phosphatidylcholine (POPC) vesicles, and into corresponding vesicles containing 70 mol% POPC +30 mol% cholesterol, and studied by single-molecule FRET and circular dichroism experiments. We found that the presence of 30 mol% cholesterol induced an increase in helicity of all TM3/4 hairpins, suggesting an increase in bilayer cross-section and hence an increase in the depth of membrane insertion compared to pure POPC vesicles. Importantly, when we added the corrector VX-809, regardless of the presence or absence of cholesterol, all mutants displayed folding and helicity largely indistinguishable from the WT hairpin. Fluorescence spectroscopy measurements suggest that the corrector alters lipid packing and water accessibility. We propose a model whereby VX-809 shields the protein from the lipid environment in a mutant-independent manner such that the WT scaffold prevails. Such ‘normalization’ to WT conformation is consistent with the action of VX-809 as a protein-folding chaperone.

A new method, probability distribution of diffusivities (time scaled square displacements between succeeding video frames), was developed to analyze single molecule tracking (SMT) experiments. This method was then applied to SMT experiments on ultrathin liquid tetrakis(2-ethylhexoxy)silane (TEHOS) films on Si wafer with 100 nm thermally grown oxide, and on thin semectic liquid crystal films. Spatial maps of diffusivities from SMT experiments on 220 nm thick semectic liquid crystal films reveal structure related dynamics. The SMT experiments on ultrathin TEHOS films were complemented by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The observed strongly heterogeneous single molecule dynamics within those films can be explained by a three-layer model consisting of (i) dye molecules adsorbed to the substrate, (ii) slowly diffusing molecules in the laterally heterogeneous near-surface region of 1 - 2 molecular diameters, and (iii) freely diffusing dye molecules in the upper region of the film. FCS and SMT experiments reveal a strong influence of substrate heterogeneity on SM dynamics. Thereby chemisorption to substrate surface silanols plays an important role. Vertical mean first passage times (mfpt) in those films are below 1 µs. This appears as fast component in FCS autocorrelation curves, which further contain a contribution from lateral diffusion and from adsorption events. Therefore, the FCS curves are approximated by a tri-component function, which contains an exponential term related to the mfpt, the correlation function for translational diffusion and a stretched exponential term for the broad distribution of adsorption events. Lateral diffusion coefficients obtained by FCS on 10 nm thick TEHOS films, thereby, are effective diffusion coefficients from dye transients in the focal area. They strongly depend on the substrate heterogeneity. Variation of the frame times for the acquisition of SMT experiments in steps of 20 ms from 20 ms to 200 ms revealed a strong dependence of the corresponding probability distributions of diffusivities on time, in particular in the range between 20 ms and 100 ms. This points to average dwell times of the dye molecules in at least one type of the heterogeneous regions (e.g. on and above silanol clusters) in the range of few tens of milliseconds. Furthermore, time series of SM spectra from Nile Red in 25 nm thick poly-n-alkyl-methacrylate (PnAMA) films were studied. In analogy to translational diffusion, spectral diffusion (shifts in energetic positions of SM spectra) can be studied by probability distributions of spectral diffusivities, i.e. time scaled square energetic displacements. Simulations were run and analyzed to study contributions from noise and fitting uncertainty to spectral diffusion. Furthermore the effect of spectral jumps during acquisition of a SM spectrum was investigated. Probability distributions of spectral diffusivites of Nile Red probing vitreous PnAMA films reveal a two-level system. In contrast, such probability distributions obtained from Nile Red within a 25 nm thick poly-n-butylmethacrylate film around glass transition and in the melt state, display larger spectral jumps. Moreover, for longer alkyl side chains a solvent shift to higher energies is observed, which supports the idea of nanophase separation within those polymers.

La Spectroscopie par Effet Tunnel Inélastique (IETS) avec un Microscope à Effet Tunnel (STM) est une nouvelle technique de spectroscopie vibrationnelle, qui permet de caractériser des propriétés très fines de molécules adsorbées sur des surfaces métalliques. Des règles de selection d’excitation vibrationnelle basées sur la symétrie ont été proposées, cependant, elles ne semblent pas exhaustives pour expliquer la totalité du mécanisme et des facteurs en jeu; elles ne sont pas directement transposables pour les propriétés d'un adsorbat et sont lourdes d'utilisation. Le but de cette thèse est donc d'améliorer ces règles de selection par une étude théorique. Un protocole de simulation de l'IETS a été développé, paramétré, et évalué, puis appliqué pour calculer des spectres IETS pour différentes petites molécules, qui sont systématiquement liées, sur une surface de cuivre. Des principes additifs de l'IETS ont été developpés, notamment concernant l’extension dans le vide de l’état de tunnel, l'activation/ quench sélectif de certains modes du aux propriétés électroniques de certains fragments moléculaires, et l'application de certaines règles d'addition de signaux IETS. De plus, des empreintes vibrationnelles par des signaux IETS ont été determinées pour permettre de différentier entre les orientations des adsorbats, la nature chimique des atomes et les isomères de structures. Une stratégie simple utilisant les propriétés de distribution de la densité électronique de la molécule isolée pour prédire les activités IETS sans des couts importants de calculs a aussi été développée. Cette expertise a été utilisée pour rationaliser et interpréter les mesures expérimentales des spectres IETS pour des métalloporphyrines et métallophtalocyanines adsorbées. Ces études sont les premières études IETS pour des molécules aussi larges et complexes. L'approche expérimentale a permis de déterminer les limitations actuelles des simulations IETS. Les défauts associés à l'identification ont été résolus en faisant des simulations d'images STM complémentaires. / Inelastic Electron Tunneling Spectroscopy (IETS) with the Scanning Tunneling Microscope (STM) is a novel vibrational spectroscopy technique that permits to characterize very subtle properties of molecules adsorbed on metallic surfaces. Its proposed symmetry-based propensity selection rules, however, fail to fully capture its exact mechanism and influencing factors; are not directly retraceable to an adsorbate property and are cumbersome. In this thesis, a theoretical approach was taken to improve them. An IETS simulation protocol has been developed, parameterized and benchmarked, and consequently used to calculate IETS spectra for a set of systematically related small molecules on copper surfaces. Extending IETS principles were deduced that refer to the tunneling state’s vacuum extension, the selective activating/quenching of certain types of modes due to the moieties’ electronic properties, and the applicability of a sum rule of IETS signals. Also, fingerprinting IETS-signals that enable discrimination between adsorbate orientations, the chemical nature of atoms and structural isomers were determined and a strategy using straightforward electronic density distribution properties of the isolated molecule to predict IETS activity without (large) computational cost was developed. This expertise was used to rationalize and interpret experimentally measured IETS spectra for adsorbed metalloporphyrins and metallophthalocyanines, being the first IETS studies of this large size. This experimental approach permitted to determine the current limitations of IETS-simulations. The associated identification shortcomings were resolved by conducting complementary STM-image simulations.