Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the gene that codes for the chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Recent advances in CF treatment have included use of small-molecule drugs known as modulators, such as Lumacaftor (VX-809), but their detailed mechanism of action and interplay with the surrounding lipid membranes, including cholesterol, remain largely unknown. To examine these phenomena and guide future modulator development, we prepared a set of wild type (WT) and mutant helical hairpin constructs consisting of CFTR transmembrane (TM) segments 3 and 4 and the intervening extracellular loop (termed TM3/4 hairpins) that represent minimal membrane protein tertiary folding units. These hairpin variants, including CF-phenotypic loop mutants E217G and Q220R, and membrane-buried mutant V232D, were reconstituted into large unilamellar phosphatidylcholine (POPC) vesicles, and into corresponding vesicles containing 70 mol% POPC +30 mol% cholesterol, and studied by single-molecule FRET and circular dichroism experiments. We found that the presence of 30 mol% cholesterol induced an increase in helicity of all TM3/4 hairpins, suggesting an increase in bilayer cross-section and hence an increase in the depth of membrane insertion compared to pure POPC vesicles. Importantly, when we added the corrector VX-809, regardless of the presence or absence of cholesterol, all mutants displayed folding and helicity largely indistinguishable from the WT hairpin. Fluorescence spectroscopy measurements suggest that the corrector alters lipid packing and water accessibility. We propose a model whereby VX-809 shields the protein from the lipid environment in a mutant-independent manner such that the WT scaffold prevails. Such ‘normalization’ to WT conformation is consistent with the action of VX-809 as a protein-folding chaperone.

Die Genexpression ist ein stochastischer Prozess, dessen strenge Regulation einen ungestörten Zellzyklusverlauf ermöglicht. Jeglicher Stress löst eine Neuprogrammierung der Expression und somit einen Stillstand des Zellzyklus aus. Um ein besseres Verständnis des eukaryotischen Zellzyklus zu erlangen, wurde in dieser Arbeit die Fluoreszenzmikroskopie einzelner Zellen (S.cerevisiae) mit stochastischer Modellierung der Hauptregulatorgene des G1/S-Übergangs (SIC1, CLN2, CLB5) kombiniert. Mithilfe des MS2-CP-Systems wurden mRNA-Level von SIC1 in lebenden Zellen bestimmt und verschiedene Transportwege von SIC1-mRNA visualisiert. RNA-FISH in Kombination mit genetischen und morphologischen Markierungen ermöglichte es, die absolute Quantifizierung von SIC1-, CLN2- und CLB5-mRNA in allen Zyklusphasen vorzunehmen. Die Auswirkung von Osmostress, in Hinblick auf eine transkriptionale Verzerrung, wurde untersucht. Basierend auf den experimentellen-Daten wurde ein stochastisches Model entwickelt, dass die Expression von SIC1, CLN2 und CLB5 mRNA und Proteinlevel in Abhängigkeit von Osmostress über den gesamten Zellzyklus hinweg abbildet. Die Modellierung ermöglichte eine in silico Synchronisation und somit die Extraktion kinetischer Parameter. Die Expression der beobachteten Gene wurde im Verlauf des Zellzyklus nicht ein- und ausgeschaltet, stattdessen kam es zu Phasen hoher oder niedriger Expression. Niedriger SIC1 Expression gewährleistete niedriger Sic1 Protein Verzerrung und robustes G1/S Timing. CLN2 und CLB5 zeigten ein maximales Expressionslevel in G1 und auch eine erhöhte Expression in der späten Mitose. Osmostress induzierte einen langanhaltenden Effekt auf die Transkription und die Dauer der Zellzyklusphasen. Der hier vorgestellte Ansatz ermöglichte quantitative Einblicke in die Genexpression und zeitliche Koordination des Zellzyklus von S.cerevisiae. Einige der hier beobachteten Regulationsmechanismen könnten allgemeine Gültigkeit im eukaryotischen Zellzyklus besitzen. / Gene expression is a stochastic process and its appropriate regulation is critical for cell cycle progression. Cellular stress response requires expression reprogramming and cell cycle arrest. Time-resolved quantitative methods on single cells are needed to understand eukaryotic cell cycle in context of noisy gene expression and external perturbations. We applied single-cell fluorescence microscopy and stochastic modeling to SIC1, CLN2 and CLB5, the main G1/S regulators in S. cerevisiae. Using MS2-CP system we estimated SIC1 mRNA levels and visualized different types of transport for SIC1 mRNA particles in living cells. With RNA-FISH combined to genetic and morphological markers we monitored absolute numbers of mRNA and transcriptional noise over cell cycle phases with and without osmostress. Stochastic modeling enabled in silico synchronization, the extraction of kinetic parameters as well as expanded the static mRNA data into time courses for mRNAs, proteins and their noise. Based on our experimental data we developed a stochastic model of G1/S timing centered on SIC1 and a second one for the entire cell cycle involving SIC1, CLN2 and CLB5 and the response to osmostress. All three genes exhibited basal expression throughout cell cycle enlightening that transcription is not divided in on and off but rather in high and low phases. A low SIC1 transcript level ensured a low protein noise and a robust timing of the G1/S transition. CLN2 and CLB5 showed main expression peaks in G1 as well as an expression upshift in late mitosis. Osmostress induced different periods of transcriptional inhibition for CLN2 and CLB5 and long-term impact on cell cycle phase duration. Our approach disclosed detailed quantitative insights into gene expression and cell cycle timing, not available from bulk experiments. Importantly some regulation mechanisms specific to SIC1, CLN2 and CLB5 might be generalized to other genes as well as to other organisms.

A new method, probability distribution of diffusivities (time scaled square displacements between succeeding video frames), was developed to analyze single molecule tracking (SMT) experiments. This method was then applied to SMT experiments on ultrathin liquid tetrakis(2-ethylhexoxy)silane (TEHOS) films on Si wafer with 100 nm thermally grown oxide, and on thin semectic liquid crystal films. Spatial maps of diffusivities from SMT experiments on 220 nm thick semectic liquid crystal films reveal structure related dynamics. The SMT experiments on ultrathin TEHOS films were complemented by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The observed strongly heterogeneous single molecule dynamics within those films can be explained by a three-layer model consisting of (i) dye molecules adsorbed to the substrate, (ii) slowly diffusing molecules in the laterally heterogeneous near-surface region of 1 - 2 molecular diameters, and (iii) freely diffusing dye molecules in the upper region of the film. FCS and SMT experiments reveal a strong influence of substrate heterogeneity on SM dynamics. Thereby chemisorption to substrate surface silanols plays an important role. Vertical mean first passage times (mfpt) in those films are below 1 µs. This appears as fast component in FCS autocorrelation curves, which further contain a contribution from lateral diffusion and from adsorption events. Therefore, the FCS curves are approximated by a tri-component function, which contains an exponential term related to the mfpt, the correlation function for translational diffusion and a stretched exponential term for the broad distribution of adsorption events. Lateral diffusion coefficients obtained by FCS on 10 nm thick TEHOS films, thereby, are effective diffusion coefficients from dye transients in the focal area. They strongly depend on the substrate heterogeneity. Variation of the frame times for the acquisition of SMT experiments in steps of 20 ms from 20 ms to 200 ms revealed a strong dependence of the corresponding probability distributions of diffusivities on time, in particular in the range between 20 ms and 100 ms. This points to average dwell times of the dye molecules in at least one type of the heterogeneous regions (e.g. on and above silanol clusters) in the range of few tens of milliseconds. Furthermore, time series of SM spectra from Nile Red in 25 nm thick poly-n-alkyl-methacrylate (PnAMA) films were studied. In analogy to translational diffusion, spectral diffusion (shifts in energetic positions of SM spectra) can be studied by probability distributions of spectral diffusivities, i.e. time scaled square energetic displacements. Simulations were run and analyzed to study contributions from noise and fitting uncertainty to spectral diffusion. Furthermore the effect of spectral jumps during acquisition of a SM spectrum was investigated. Probability distributions of spectral diffusivites of Nile Red probing vitreous PnAMA films reveal a two-level system. In contrast, such probability distributions obtained from Nile Red within a 25 nm thick poly-n-butylmethacrylate film around glass transition and in the melt state, display larger spectral jumps. Moreover, for longer alkyl side chains a solvent shift to higher energies is observed, which supports the idea of nanophase separation within those polymers.

La Spectroscopie par Effet Tunnel Inélastique (IETS) avec un Microscope à Effet Tunnel (STM) est une nouvelle technique de spectroscopie vibrationnelle, qui permet de caractériser des propriétés très fines de molécules adsorbées sur des surfaces métalliques. Des règles de selection d’excitation vibrationnelle basées sur la symétrie ont été proposées, cependant, elles ne semblent pas exhaustives pour expliquer la totalité du mécanisme et des facteurs en jeu; elles ne sont pas directement transposables pour les propriétés d'un adsorbat et sont lourdes d'utilisation. Le but de cette thèse est donc d'améliorer ces règles de selection par une étude théorique. Un protocole de simulation de l'IETS a été développé, paramétré, et évalué, puis appliqué pour calculer des spectres IETS pour différentes petites molécules, qui sont systématiquement liées, sur une surface de cuivre. Des principes additifs de l'IETS ont été developpés, notamment concernant l’extension dans le vide de l’état de tunnel, l'activation/ quench sélectif de certains modes du aux propriétés électroniques de certains fragments moléculaires, et l'application de certaines règles d'addition de signaux IETS. De plus, des empreintes vibrationnelles par des signaux IETS ont été determinées pour permettre de différentier entre les orientations des adsorbats, la nature chimique des atomes et les isomères de structures. Une stratégie simple utilisant les propriétés de distribution de la densité électronique de la molécule isolée pour prédire les activités IETS sans des couts importants de calculs a aussi été développée. Cette expertise a été utilisée pour rationaliser et interpréter les mesures expérimentales des spectres IETS pour des métalloporphyrines et métallophtalocyanines adsorbées. Ces études sont les premières études IETS pour des molécules aussi larges et complexes. L'approche expérimentale a permis de déterminer les limitations actuelles des simulations IETS. Les défauts associés à l'identification ont été résolus en faisant des simulations d'images STM complémentaires. / Inelastic Electron Tunneling Spectroscopy (IETS) with the Scanning Tunneling Microscope (STM) is a novel vibrational spectroscopy technique that permits to characterize very subtle properties of molecules adsorbed on metallic surfaces. Its proposed symmetry-based propensity selection rules, however, fail to fully capture its exact mechanism and influencing factors; are not directly retraceable to an adsorbate property and are cumbersome. In this thesis, a theoretical approach was taken to improve them. An IETS simulation protocol has been developed, parameterized and benchmarked, and consequently used to calculate IETS spectra for a set of systematically related small molecules on copper surfaces. Extending IETS principles were deduced that refer to the tunneling state’s vacuum extension, the selective activating/quenching of certain types of modes due to the moieties’ electronic properties, and the applicability of a sum rule of IETS signals. Also, fingerprinting IETS-signals that enable discrimination between adsorbate orientations, the chemical nature of atoms and structural isomers were determined and a strategy using straightforward electronic density distribution properties of the isolated molecule to predict IETS activity without (large) computational cost was developed. This expertise was used to rationalize and interpret experimentally measured IETS spectra for adsorbed metalloporphyrins and metallophthalocyanines, being the first IETS studies of this large size. This experimental approach permitted to determine the current limitations of IETS-simulations. The associated identification shortcomings were resolved by conducting complementary STM-image simulations.

Funktionalisierte organische Perylenbisimidfarbstoffe (PBI) und aus Cadmiumselenid bestehende Halbleiternanokristalle werden hinsichtlich physikalischer sowie chemischer Wechselwirkungsprozesse miteinander und mit ihrer Umgebung mittels zeitaufgelöster optischer Spektroskopie untersucht. Im Mittelpunkt der Studien an diesem organisch/anorganischen Modellsystem nanoskopischer Größe steht die Aggregatbildungskinetik und die Identifikation und Quantifizierung von Transferpozessen. Die Anbindung der gut löslichen PBI-Farbstoffe an die Oberfläche solcher Halbleiternanokristalle mittels spezieller Ankergruppen wird durch Selbstorganisation in Lösung realisiert. Die Kombination von Absorptions- und zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie zeigt einen unterschiedlich starken Einfluss von Liganden und Farbstoffen auf die Fluoreszenzlöschung der Nanokristalle und belegt, dass Resonanzenergietransfer zum Farbstoff nur in sehr geringem Maße die physikalische Ursache der Fluoreszenzlöschung ist. Die Anzahl adsorbierter Farbstoffe und die Stärke der Fluoreszenzlöschung eines einzelnen Farbstoffmoleküls werden aus zeitaufgelösten Einzelmolekülexperimenten an immobilisierten Emittern gewonnen, welche den direkten spektroskopischen Zugang zur Verteilung gebundener und freier Farbstoffe/Nanokristalle erlaubt. Darüber hinaus werden ankergruppen- und umgebungsspezifische Einflüsse auf die Konformations- und Orientierungsdynamik von Perylenbisimidmolekülen dargestellt. Abschließend werden photo-physikalische Gemeinsamkeiten chemisch unterschiedlich hervorgerufener Fluoreszenzlöschungsprozesse herausgearbeitet und im Kontext von Einzelkristall-Blinkprozessen diskutiert.