O estudo do processo da peroxidação de lipídios tem aumentado nos últimos anos, principalmente devido à implicação dos hidroperóxidos de lipídios (LOOH) em diversos processos patológicos. A decomposição destes LOOH é capaz de gerar subprodutos capazes de promover danos em biomoléculas, incluindo proteínas e DNA. No presente trabalho, utilizando hidroperóxidos de ácido linoléico isotopicamente marcado com átomo de oxigênio-18 (LA18O18OH), fomos capazes de demonstrar que estas moléculas gerararam oxigênio singlete marcado [18(1O2)] em células em cultura. A detecção de tal espécie foi possível através da utilização de uma nova metodologia utilizando um derivado antracenico. Para este propósito foi utilizado o derivado de antraceno 3,3\'-(9,10-antracenodiil) bisacrilato (DADB), cujo produto especifico da reação com o 1O2 (o endoperóxido do DADB DADBO2) do pode ser facilmente detectado por HPLC-MS/MS. De forma a expandir a compreensão dos efeitos tóxicos desses LOOH, investigamos o efeito destes compostos gerados intracelularmente. Para tal, foi utilizado o Rosa bengala (RB), um fotosensibilizador que tem afinidade por espaços apolares como membranas e lisossomos. A fotosenssibilização deste composto foi capaz de induzir a morte celular, e esta morte estaria relacionada a uma maior formação de 1O2 e a um maior acumulo de peróxidos. Nestes estudos foi possível demonstrar que carotenóides e sistemas antioxidantes dependentes de glutationa foram capazes de proteger contra os efeitos tóxicos da fotosensibilização na presença de RB. Adicionalmente foram avaliados os efeitos da hemoglobina (Hb) e do hidroperóxido do ácido linoléico (LAOOH) em uma série de parâmetros toxicológicos, como citotoxicidade, estado redox, a peroxidação lipídica e dano ao DNA. Nós demonstramos que a pré-incubação das células com Hb e sua posterior exposição à LAOOH (Hb + LAOOH) levou a um aumento na morte celular, a oxidação do DCFH, formação de malonaldeído e fragmentação do DNA e que esses efeitos estavam relacionados com o grupo peróxido e ao heme presentes na Hb. Foi demonstrado que as células incubadas com LAOOH e Hb apresentaram um nível maior das lesões de DNA; 8-oxo-7,8-diidro-2 \'desoxiguanosina e 1,N2-etheno-2\'-desoxiguanosina. Além disso, as incubações com Hb levaram a um aumento nos níveis de ferro intracelular, e este alto nível de ferro correlacionada com a oxidação do DNA, avaliadas através da medida de sitios EndoIII e Fpg sensíveis. Nossos resultados comprovam que os LAOOHs apresentaram efeito citotóxico e genotóxico, mesmo em concentrações muito baixas, podendo contribuir para o desencadeamento de processos patologicos como o câncer e doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. / The study of the process of lipid peroxidation has increased in recent years, mainly due to the involvement of lipid hydroperoxide (LOOH) in a series of pathological processes. The decomposition of LOOH is able to generate products that can promote damage to biomolecules, including proteins and DNA. In the present work, using linoleic acid hydroperoxide isotopically labeled with 18O2 (LA18O18OH), we demonstrate that these molecules were able to generate labeled singlet oxygen [18(1O2)] in cultured cells. The detection of such species was possible using a new methodology using an anthracene derivative .For this purpose we used the anthracene derivative of 3,3\'-(9,10-antracendiil) bisacrilate (DADB), whose specific reaction product with 1O2 (DADB endoperoxide DADBO2) can be easily detected by HPLC-MS/MS. In order to expand the understanding of the toxic effects of LOOH, we investigated the effect of these compounds generated intracellularly. For this porpoise, we used Rose Bengal (RB), a photosensitizer that has affinity for apolar spaces such as membranes and lysosomes. The photosensitization of this compound was able to induce cell death, and this death was related to increased formation of 1O2 and a higher accumulation of peroxides. In these studies we have shown that carotenoids and glutathione-dependent antioxidant systems were capable of protecting against the toxic effects of photosensitization in the presence of RB. Additionally, we evaluated the effects of hemoglobin (Hb) and linoleic acid hydroperoxide (LAOOH) in a series of toxicological endpoints such as cytotoxicity, redox status, lipid peroxidation and DNA damage. We demonstrated that preincubation of cells with Hb and its subsequent exposure to LAOOH (Hb + LAOOH) led to an increase in cell death, DCFH oxidation, formation of malonaldehyde and DNA fragmentation, and that these effects were related to the peroxide and the heme group. It was demonstrated that cells incubated with LAOOH and Hb showed a higher level of the DNA lesions, 8-oxo-7,8-dihydro-2\'deoxyguanosine and 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine. Furthermore, incubations with Hb led to an increase in intracellular iron levels, and this high level of iron correlates with the oxidation of DNA, measured as EndoIII and Fpg-sensitive sites. Our results show that the LOOHs showed cytotoxic and genotoxic, even at very low concentrations and may contribute to the onset of chronic malignancies like cancer, cardiovascular and neurodegenerative diseases.

Neste trabalho avaliamos a formação de oxigênio singlete in vitro em fagócitos, (células mononucleares e neutrófilos) isolados de sangue periférico humano, e eosinófilos, de lavado bronco alveolar de camundongos balb/c, ativados por estímulo partículado: zimosan opsonizado contendo o 9,10difenilantraceno (DPA) adsorvido como sonda captadora de 1O2. Por este método, a formação do 1O2 pode ser verificada pela formação do 9,10-difenilantraceno endoperóxido (DPAO2), que é detectado por HPLC. Observamos, que os fagócitos formam 1O2 e que esta formação parece ocorrer de forma diferenciada para os dois tipos celulares (neutrófilos e células mononucleares). Visando ampliar os estudos anteriores sobre o papel da melatonina (MLT) no processo inflamatório, foi testado seu efeito em fagócitos e a relação na produção de 1O2 destas células. Observamos que MLT inibe a formação de 1O2 totalmente no caso de neutrófilos e parcialmente no caso de células mononucleares e eosinófilos. Paralelamente, foi desenvolvida a síntese de um novo captador químico de 1O2, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE), cuja finalidade principal é o acúmulo no interior da célula, depois de sofrer hidrólise enzimática. Esta sonda, terá facil acesso ao interior das células em sua forma ester. Este novo captador de 1O2 foi testado em células mononucleares e neutrófilos estimulados de formas diferentes: via receptor independente e dependente. Os resultados demonstraram produção equivalente de 1O2 nestes fagócitos. / In this study, we evaluated the singlet oxygen (1O2) formation in vitro from phagocytes (neutrophils and mononuclear cells) isolated from human blood cells and eosinophils isolated from bronchoalveolar lavage fluid of mice balb/c activated, by opsonized zymosan. To determine whether singlet oxygen is produced by phagocytes, zymosan particles were coated with a specific chemical trap for 1O2, 9,10-diphenylanthracene (DPA). The production of 1O2 was followed using HPLC, to measure its product, 9,10-diphenylanthracene endoperoxide (DPAO2). We also noticed that the 1O2 production occurs at different levels of for two cell types, neutrophils and mononuclear cells. In order to broaden previous studies on the role of melatonin (MLT) in inflammatory processes, its effect was tested in phagocytes was tested in relation to 1O2 formation by these cells. We observed that MLT inhibits the 1O2 formation totallymt neutrophils and partiallym mononuclear cells and eosinophils. At the some time, it was also developed the synthesis of a new probe for 1O2, the 9,10-anthracene-bis-3-ethyl-propionate (ABEP), with the purpose to accumulate inside the cells, after its enzymatic hydrolysis. This probe presents easy acess to the inferior of the cells in its ester form. This new probe for trapping 1O2 was tested in mononuclear cells and neutrophils stimulated in two ways: via independent and dependent receptor. The results showed equivalent production of 1O2 for both cell types.

Estudos envolvendo o oxigênio molecular singlete (1O2) tem uma relevância biológica, uma vez que esta espécie, devido ao caráter eletrofílico, reage com moléculas ricas em elétrons como proteínas, lipídeos e DNA provocando danos que resultam em perdas de função e integridade celular. Em sistemas biológicos, a presença de outras espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, dificultam a identificação de lesões específicas causadas por 1O2 .Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido objetivando a síntese de endoperóxidos isotopicamente marcados com 17O para serem utilizados como fonte geradora limpa de 17[1O2] em estudos mecanísticos. A capacidade de geração de 17[1O2] pelo endoperóxido N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\'-(1,4 naftilideno) dipropanamida 17O (DHPN17O2) foi confirmada utilizando o captador químico sulfato mono-{2-[10-(2-sulfoxi-etil)-antracen-9-il]-etil}éster de sódio e o nucleosídeo 2\'- desoxiguanosina. Os produtos isotopicamente marcados com 17O formados foram analisados por espectrometria de ressonância magnética nuclear e cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massa. Os lipídeos, em especial o colesterol ao reagir com o 1O2 geram hidroperóxidos de colesterol como produtos de oxidação primária e na presença de metais resulta em compostos de maior reatividade e toxicidade, como os radicais peroxila, que contribuem para a propagação da peroxidação lipídica. Neste trabalho, demonstramos que os hidroperóxidos de colesterol são capazes de gerar 1O2 na presença de metal através de medidas de luminescência, utilização de supressores e captador químico de 1O2. Os mecanismos de reação envolvidos foram estudados e determinados por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida de alta eficiência. Por fim, a caracterização detalhada dos produtos formados por espectrometria de ressonância magnética nuclear e massa na reação do colesterol com 1O2 mostrou que além dos hidroperóxidos a reação também produz um aldeído, o 3&#946; -hidroxi-5&#946;-hidroxi-B-norcolestano-6&#946;-carboxialdeído. Até o momento, este composto havia sido identificado como um produto específico da ozonização do colesterol. Neste estudo, baseado nos estudos por reações de quimiluminescência, é proposto o mecanismo de formação deste aldeído em reações de oxidação de colesterol por 1O2 envolvendo intermediário dioxetano. / Studies involving singlet molecular oxygen (1O2) has biological relevance, once this species, due to its eletrophylic character, reacts with rich electron molecules such as proteins, lipids and DNA causing damages that result in loss of function and cellular integrity. In biological system, the presence of other reactive species of oxygen and nitrogen impair the identification of lesions caused by 1O2. In this context, this work was developed with the aim of synthesizing <SUP17O-labeleded endoperoxides to be used as a clean source of (1O2) in mechanistic studies. The ability of 17[1O2]generation by N,N\'-di(2,4-dihydroxypropyl)-1,4-naphthalene-dipropanamide labeled with 17O(DHNP17O2) was observed using the disodium salt of anthracene-9,10-diyldiethyl disulfate as a chemical trap and the nucleoside 2\'-deoxyguanosine. The products isotopically labeled with 17O were analyzed by nuclear magnetic resonance spectroscopy and high performance liquid chromatography coupled to a mass spectrometer. Lipds, in special the cholesterol, when reacting with singlet molecular oxygen generate cholesterol hydroperoxides as primary products and in the presence of metals result in compounds of higher reactivity and toxicity, such as peroxyl radicals which contribute to the propagation of lipid peroxidation. In this work, we demonstrated that cholesterol hydroperoxides are able to generate singlet molecular oxygen in the presence of metal by chemiluminescence measurements by testing the effect of singlet molecular oxygen quencher and by chemical trap. The involved reaction mechanisms were studied and determined by mass spectrometry coupled to the high performance liquid chromatography. Finally, we detailed characterization of the products formed in the reaction of cholesterol with 1O2 by nuclear magnetic resonance and mass spectroscopy showed that besides cholesterol hydroperoxides, the reaction also produces an aldehyde, 3&#946;hydroxy-5&#946;-hydroxy-B-norcholestan-6&#946;-carboxyaldehyde which had been identified as a specific product of cholesterol ozonization. In this study, based on the studies of chemiluminescence reactions, the mechanism of formation of this aldehyde in reaction of oxidation of cholesterol by 1O2 involving a dioxetane intermediate has been proposed.

Estudos envolvendo o oxigênio molecular singlete (1O2) tem uma relevância biológica, uma vez que esta espécie, devido ao caráter eletrofílico, reage com moléculas ricas em elétrons como proteínas, lipídeos e DNA provocando danos que resultam em perdas de função e integridade celular. Em sistemas biológicos, a presença de outras espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, dificultam a identificação de lesões específicas causadas por 1O2 .Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido objetivando a síntese de endoperóxidos isotopicamente marcados com 17O para serem utilizados como fonte geradora limpa de 17[1O2] em estudos mecanísticos. A capacidade de geração de 17[1O2] pelo endoperóxido N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-3,3\'-(1,4 naftilideno) dipropanamida 17O (DHPN17O2) foi confirmada utilizando o captador químico sulfato mono-{2-[10-(2-sulfoxi-etil)-antracen-9-il]-etil}éster de sódio e o nucleosídeo 2\'- desoxiguanosina. Os produtos isotopicamente marcados com 17O formados foram analisados por espectrometria de ressonância magnética nuclear e cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massa. Os lipídeos, em especial o colesterol ao reagir com o 1O2 geram hidroperóxidos de colesterol como produtos de oxidação primária e na presença de metais resulta em compostos de maior reatividade e toxicidade, como os radicais peroxila, que contribuem para a propagação da peroxidação lipídica. Neste trabalho, demonstramos que os hidroperóxidos de colesterol são capazes de gerar 1O2 na presença de metal através de medidas de luminescência, utilização de supressores e captador químico de 1O2. Os mecanismos de reação envolvidos foram estudados e determinados por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida de alta eficiência. Por fim, a caracterização detalhada dos produtos formados por espectrometria de ressonância magnética nuclear e massa na reação do colesterol com 1O2 mostrou que além dos hidroperóxidos a reação também produz um aldeído, o 3&#946; -hidroxi-5&#946;-hidroxi-B-norcolestano-6&#946;-carboxialdeído. Até o momento, este composto havia sido identificado como um produto específico da ozonização do colesterol. Neste estudo, baseado nos estudos por reações de quimiluminescência, é proposto o mecanismo de formação deste aldeído em reações de oxidação de colesterol por 1O2 envolvendo intermediário dioxetano. / Studies involving singlet molecular oxygen (1O2) has biological relevance, once this species, due to its eletrophylic character, reacts with rich electron molecules such as proteins, lipids and DNA causing damages that result in loss of function and cellular integrity. In biological system, the presence of other reactive species of oxygen and nitrogen impair the identification of lesions caused by 1O2. In this context, this work was developed with the aim of synthesizing <SUP17O-labeleded endoperoxides to be used as a clean source of (1O2) in mechanistic studies. The ability of 17[1O2]generation by N,N\'-di(2,4-dihydroxypropyl)-1,4-naphthalene-dipropanamide labeled with 17O(DHNP17O2) was observed using the disodium salt of anthracene-9,10-diyldiethyl disulfate as a chemical trap and the nucleoside 2\'-deoxyguanosine. The products isotopically labeled with 17O were analyzed by nuclear magnetic resonance spectroscopy and high performance liquid chromatography coupled to a mass spectrometer. Lipds, in special the cholesterol, when reacting with singlet molecular oxygen generate cholesterol hydroperoxides as primary products and in the presence of metals result in compounds of higher reactivity and toxicity, such as peroxyl radicals which contribute to the propagation of lipid peroxidation. In this work, we demonstrated that cholesterol hydroperoxides are able to generate singlet molecular oxygen in the presence of metal by chemiluminescence measurements by testing the effect of singlet molecular oxygen quencher and by chemical trap. The involved reaction mechanisms were studied and determined by mass spectrometry coupled to the high performance liquid chromatography. Finally, we detailed characterization of the products formed in the reaction of cholesterol with 1O2 by nuclear magnetic resonance and mass spectroscopy showed that besides cholesterol hydroperoxides, the reaction also produces an aldehyde, 3&#946;hydroxy-5&#946;-hydroxy-B-norcholestan-6&#946;-carboxyaldehyde which had been identified as a specific product of cholesterol ozonization. In this study, based on the studies of chemiluminescence reactions, the mechanism of formation of this aldehyde in reaction of oxidation of cholesterol by 1O2 involving a dioxetane intermediate has been proposed.