Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-05T18:13:15Z No. of bitstreams: 1 2017_ElisaCançadoPortoMascarenhas.pdf: 3785190 bytes, checksum: dacd35ecdbfd2e11c871abca02b55626 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-24T22:23:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ElisaCançadoPortoMascarenhas.pdf: 3785190 bytes, checksum: dacd35ecdbfd2e11c871abca02b55626 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-24T22:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ElisaCançadoPortoMascarenhas.pdf: 3785190 bytes, checksum: dacd35ecdbfd2e11c871abca02b55626 (MD5) Previous issue date: 2018-04-24 / O câncer de mama é a segunda neoplasia mais diagnosticada no mundo, sendo a principal causa de morte relacionada ao câncer entre as mulheres. Sua detecção precoce oferece a promessa de um tratamento menos agressivo e aumento na sobrevida. Nesse cenário, surgem os estudos com biomarcadores, sendo a saliva cada vez mais reconhecida como um excelente veículo diagnóstico, uma vez que pode ser coletada de forma simples e não invasiva. Nesse contexto, esse trabalho propõe-se a avaliar a expressão proteica do CA 15.3 na saliva e no sangue de pacientes com câncer de mama e de controles saudáveis. Assim, avaliou-se as concentrações séricas de CA 15.3 pelo ensaio de eletroquimioluminescência, quanto as concentrações salivares de CA 15.3 por ensaios de quimioluminescência e ELISA. O trabalho também correlacionou os níveis de CA 15.3 séricos e salivares com o estadiamento e com o perfil molecular do câncer de mama. A validação diagnóstica foi realizada, determinando sua sensibilidade, especificidade, VPP, VPN e acurácia. Os resultados mostraram que as concentrações séricas e salivares de CA 15.3 não foram capazes de discriminar pacientes saudáveis de pacientes portadoras de câncer de mama. A associação entre os níveis séricos e salivares do CA 15.3 com o perfil molecular e com estadiamento foi negativa. Ainda, o desempenho do método de ELISA para quantificação do CA 15.3 salivar foi superior quanto à sensibilidade, VPP, VPN e acurácia comparativamente ao método de quimioluminescência. Porém, a quimioluminescência das amostras de saliva mostrou melhor desempenho quanto à especificidade em comparação ao método ELISA. Não foi observada correlação entre os níveis séricos e salivares de CA 15.3. Esse estudo confirmou a presença do CA 15.3 na saliva, podendo a mesma ser usada em estudos futuros com esse propósito. No entanto, não foi possível comprovar a utilização do biomarcador CA 15.3 na saliva para finalidade diagnóstica. Futuras investigações devem incluir maior número de pacientes e ampliação dos ensaios e biomarcadores para responder a essa pergunta, bem como, sua utilização para fins prognósticos e monitoramento de tratamento deve ser avaliada em estudos longitudinais. / Breast cancer is the second most diagnosed neoplasia in the world and the leading cause of cancer-related death in women. Its early detection offers the promise of a less aggressive treatment and increases survival’s chance. In this scenario, the research with biomarkers appear and saliva is increasingly being recognized as an excellent mean of diagnosis, once it can be collected in a simple and non-invasive way. In this context, this work proposes to evaluate the protein expression of CA 15.3 in saliva and blood of patients with breast cancer and healthy controls. Therefore, CA 15.3 serum concentrations were evaluated through electrochemiluminescence assay and CA 15.3 salivary concentrations per chemiluminescence and ELISA assay. The work also correlated the serum and salivary levels of CA 15.3 with the staging and the molecular profile of the breast cancer. The diagnosis validation was made in order to determine its sensitivity, specificity, PPV, NPV, and accuracy. The results showed that the serum and salivary concentrations of CA 15.3 were not able to distinguish healthy patients from the ones with breast cancer. The association of the serum and salivary levels of CA 15.3 with the molecular profile and the staging was negative. Still, the performance of ELISA assay for quantification of salivary CA 15.3 was higher for sensitivity, PPV, NPV, and accuracy when comparing to chemiluminescence assay. However, the chemiluminescence of the saliva samples showed a better performance in terms of specificity when comparing to ELISA assay. No correlation between serum and salivary levels of CA 15.3 was observed. This study confirmed the presence of CA 15.3 in saliva and it can be used in future researches with this purpose. However, it was not possible to prove the use of the biomarker CA 15.3 in saliva for diagnosis purposes. Future investigations must include a bigger number of patients and an expansion of the tests and biomarkers in order to answer this question. As well as, their use for prognostic purposes and treatment monitoring must be evaluated in longitudinal studies.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-26T13:20:19Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Lúcia Patrícia.pdf: 1776098 bytes, checksum: 4c638b348b16c6b03bc5454b823bf15a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T13:20:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Lúcia Patrícia.pdf: 1776098 bytes, checksum: 4c638b348b16c6b03bc5454b823bf15a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / CNPq / A inespecificidade dos métodos atualmente adotados para diagnosticar e monitorar o câncer de próstata torna-os incapazes de fornecer um prognóstico preciso para direcionar com eficiência a conduta terapêutica. Por isso, faz-se necessário desenvolver metodologias que forneçam diagnósticos mais precisos e eficientes. Este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de um método quantitativo, empregando as lectinas Concanavalin A (Con A), Ulex europaeus agglutinin (UEA-I) e Peanut agglutinin (PNA) conjugadas a éster de acridina (Lectinas-EA) para avaliar a expressão de carboidratos em tecidos prostáticos: normal, hiperplasia prostática benigna (HPB) e adenocarcinoma prostático (AcP). Os conjugados lectinas-EA foram avaliados quanto a atividade hemaglutinante, conteúdo de proteínas e quimiluminescência expressado em unidades relativa de luz (RLU). Tecidos transformados apresentaram uma menor expressão de resíduos de α-D-glicose/α-D-manose (BPH: 226.931 ± 17.436; AcP: 239.520 ±12.398) e Gal-β(1-3)-GalNAc, (BPH: 28.754 ± 2.157; AcP: 16.728 ± 1.204) quando correlacionados as condições normais (367.566 ± 48.550 e 409.289 ± 22.336, respectivamente). No entanto, a maior expressão de α-L-fucose foi observado em AcP (251.118 ± 14.193) em relação ao tecido normal (200.979 ± 21.318) e HPB (169.758 ± 10.264), que exibem valores menores. A RLU diminuiu significativamente pela inibição da interação entre tecidos e lectinas usando seus açúcares específicos. Esses resultados indicam que o método usado é uma eficiente ferramenta para diferenciação quantitativa entre os tecidos prostáticos analisados.

Do interesse em espécies eletronicamente excitadas geradas por sistemas luminescentes químicos e biológicos, nasceu o interesse dos químicos pelos dioxetanos, seu comportamento e suas propriedades. Propostos como intermediários de tais reações, estes compostos (peróxidos cíclicos de anel tetratômico) sofrem clivagem térmica unimolecular com produção de dois fragmentos carbonílicos, um deles no estado eletronicamente excitado. Em geral, dioxetanos substituídos por grupos alquílicos e arílicos levam a altos rendimentos de estados triplete. Propôs-se, então, reinvestigar a termólise do tetrametildioxetano (TMD) em meio aquoso e utilizar esta fonte de acetona triplete como modelo químico, para o sistema enzimático de produção de acetona triplete (oxidação aeróbica do isobutanal (IBAL)/peroxidase (HRP)), em estudos de supressão e transferência de energia. O TMD tem sido preparado e cristalizado rotineiramente em nosso laboratório, pelo método de Kopecky. Os parâmetros de ativação de termólise (estabilidade térmica e rendimentos de quimiexcitação dos produtos) foram reestudados em solventes aromáticos (benzeno e tolueno), cicloalifáticos (ciclohexano e decalina), próticos (água) e apróticos (acetonitrila e CCl4).Concluiu-se que: (i) a estabilidade do TMD não é afetada pela natureza do solvente (Ea ~ 27,0 kcal mol-1); (ii) a eficiência global de transferência de energia triplete (acetona) → singlete (9,10-dibromoantraceno) nos solventes não aromáticos é praticamente constante (ΦTS ~ 10 %); (iii) em solventes aromáticos onde o doador excitado é na verdade um \"exciplex\" acetona-solvente, ΦTS ~ 30 %. A relação entre os rendimentos de quimiexcitação de triplete e singlete (3Φ /1Φ) em água foi determinada como sendo da ordem de 1x103, que concorda com valores determinados em tolueno e benzeno (7x102 e 8x102, respectivamente). Nos estudos em meio aquoso, o DBAS e o DPAS foram utilizados para monitorar a presença de acetona triplete e singlete, formada química, fotofísica ou enzimaticamente. Ambos foram sintetizados em nosso laboratório e suas propriedades fotofísicas, determinadas em água deionizada a 20°C. Através da medida de fluorescência do DBAS excitado por transferência de energia a partir de acetona triplete, determinou-se a vida média de acetona triplete em meio aquoso aerado e deaerado (τaer ~ 2 µs e τN2 ~ 10 a 20 µs). Seis classes de interceptadores de acetona triplete, gerada na termólise de TMD, foram investigadas em tampão aquoso a 35°C: dienos (ácido sórbico e acrilonitrila), pigmentos xantênicos, riboflavina, tirosina e derivados 3,5-dihalogenados, indol e derivados indólicos, e uma série de quinonas. Em geral, os valores das constantes de supressão de acetona triplete produzida diretamente no seio da solução, a partir de TMD, estão pelo menos uma ordem de grandeza abaixo dos valores correspondentes para acetona triplete produzida enzimaticamente. Estes resultados são consistentes com a hipótese de que acetona triplete gerada dentro da enzima tem vida média mais longa, pois se encontraria parcialmente \"protegida\" da ação supressora de O2. Outros argumentos podem, entretanto, ser igualmente satisfatórios. Parece claro que os supressares indólicos (IP ~ 8 eV) e ácido sórbico exercem sua ação através da formação de complexos de transferência de carga, tirosina e corantes xantênicos (IP ~ 7 eV) por um mecanismo de transferência de elétrons e riboflavina por mecanismo tipo Förster. As quinonas, cuja afinidade eletrônica é bastante alta (IP ~ 10-11 eV), suprimem acetona triplete por um mecanismo controlado por difusão; com estes compostos, o limite superior do esperado para um processo puramente colisional seria atingido (kq ~ 1 a 2x1010 M-1s- 1, em água a 35°C). De fato, derivados metilados de p-benzoquinona e naftoquinona suprimem acetona triplete com velocidade mais baixa, enquanto que em solvente mais viscoso (decalina, em relação a n-hexano), kq também é mais lenta. Por outro lado, observou-se um marcante \"efeito de átomo pesado\" na eficiência de transferência de energia triplete (acetona) → singlete (corante xantênico): ΦTS para fluoresceína, eosina e Rose Bengala na proporção 1:15:320. A oxidação da clorpromazina (CPZ) por reação com o TMD foi estudada em meio aquoso e meio tamponado e verificou-se que esta independe da formação de espécies excitadas, apesar da CPZ apresentar-se como eficiente supressor de acetona triplete. Espectros de RMN1H mostraram que a reaçao entre CPZ e TMD gera a clorpromazina-5-óxido (sulfóxido; CPZO) e o óxido de tetrametiletileno (o epóxido correspondente ao TMD). Estudos de espectroscopia U.V. e de cromatografia gasosa indicam que a estequiometria da reação TMD/CPZ é 1:1 e que a presença de competidores de supressão de acetona triplete não altera a velocidade da reação nem a estequiometria da mesma. Em vista destes resultados, reestudou-se a oxidação de CPZ pelo sistema do IBAL/HRP/O2, estudo feito inicialmente por DURÁN e colaboradores, no qual os autores propõem que a oxidação de CPZ é resultante de transferência de energia de excitação da acetona triplete gerada enzimaticarnente. Usando métodos inexplorados até então, verificamos a possibilidade de esta oxidação ocorrer por reação direta entre CPZ e os radicais de HRP formados durante a oxidação do isobutanal, sem a intervenção da acetona triplete. Outro estudo parelelo a este, foi feito visando determinar parâmetros cinéticos e termodinâmicos em dioxetanos com diferentes tipos de hidrogênios em posição γ do anel. Este estudo visava determinar de que maneira a interação oxigênio do anel-hidrogênio gama influia em tais parâmetros. Sintetizou-se uma série de 3-metil-3-alquildioxetanos (alquil = n-propil, n-butil e neopentil) e determinamos os seus parâmetros de ativação de termólise (Ea, ΔS≠, 3Φ e 1Φ). Constatamos que não há diferença significativa entre estes dioxetanos, sendo assim, a interação hidrogênio gama-oxigênio do anel é inexpressiva. Porém, quando comparados com outros dioxetanos da mesma série, onde alquil = etil, isopropil e terc-butil (estudo em conjunto com outros pesquisadores) nota-se urna expressiva mudança na Ea a medida que aumenta o número de grupos rnetila na posição α, indicando um efeito estérico do tipo 3,3. / The interest in eletronically excited species generated by chemical and biological systems give rise to at interest in dioxetanes, their behavior and their properties. These coumpounds (cyclic four-membered ring), which have been proposed as intermediates in such reactions, undergo unimolecular thermal cleavage yielding two carbonyl fragments, one of which is tipically formed electronically excited. In general, alkyl and aryl substitued dioxetanes give high yields of triplet states. In the present work, the thermolyses of tetramethyldioxetane (TMD) was reinvestigated in agueous medium. This source of triplet acetone was then employed in quenching and energy transfer studies as a chemical model for the enzymatic systems which produces triplet acetone I aerobic oxidations of isobutanal (IBAL) catalysed by horseradish peroxidase (HRP) I. TMD was prepared and crystalised normally in our laboratory using Kopecky\'s method. Thermal activation parameters (thermal stability and chemiexcitation quantum yields) have been determined in several types of solvents, including aromatics (benzene and toluene), cycloaliphatics (cyclohexene and decalin), protic (water) and aprotic (acetonitrile and carbon tetrachloride) .We conclude that: (i) TMD stability is not affected by the nature of the solvente (Ea ~ 27,0 kcal/mol), (ii) the overall energy transfer efficiency 3Ac* → 1DBAS* is practically constant (ΦTS ~ 10%) in non-aromatic solventsi (iii) in aromatic solvents, where the excited donor is an acetone-solvent \"exciplex\", ΦTS ~ 30%. The ratio of triplet and singlet chemiexcitation yields (3Φ /1Φ) in water was deterrnined to be 1x103. This value is in good agreement with these determined in toluene and benzene (7x102 and 8x102, respectivelly). In studies in aqueous medium, DBAS and DPAS were used as probes to monitor the production of triplet and singlet acetone formed chemically, photophysically or enzymatically. Both probes were prepared in our laboratory and their photophysical properties deterrnined in deionized water at 20°C. The lifetime of triplet acetone in aerated and deaerated aqueous media was deterrnined on the basis of the cherniluminescence intensity of DBAS excited by energy transfer (τaer ~ 2 µs e τN2 ~ 10 a 20 µs). Six classes of quenchers were investigated in aqueous buffer at 35°C: dienes (sorbic acid and acrylonitrile), xanthene dyes, tyrosine and its 3,5-dihalogenoderivatives, indole and indolic derivatives, riboflavin and a serie of quinones. In general, rate constants for quenching of triplet acetone produced free in solution via TMD thermolyses are one order of magnitude lower than those for quenching of enzymatically generated triplet acetone. These results are in line with the hypothesis of a longer lifetime of the triplet acetone generated within the enzyme due a parcial \"protection\" for O2 quenching. It seerns clear that the indolic coumpounds (IP ~ 8 eV) and sorbic acid quench triplet acetone through the forrnation of a charge-transfer complex, tyrosine ans xanthene dyes (IP ~ 7 eV) by an electron-transfer mechanism and riboflavin by a Förster type mechanism. The quinones, which have high electronic affinities (IP ~ 10- 11 eV) , quench triplet acetone by a diffusion controlled process (kq ˜ 1 to 2x1010 M-1s-1 in water at 35°C). Methyl derivatives of p-benzoquinone and naphtoquinone quench triplet acetone at a slower rate; kq is also lower in a more viscous solvent (decalin versus n-hexane). On the other hand, the results indicate a strong \"heavy atom effect\" on the energy transfer efficiency from triplet acetone to singlet xanthene dye: ΦTS for fluorescein, eosin and Rose Bengal in the ratio 1:15:320. The chlorpromazine (CPZ) oxidation by reaction with TMD was studied in aqueous and buffered media. This reaction does not depend on the production of excited species, even though CPZ proved to be an efficient trip1et acetone quencher. The NMR1H spectra showed that chlorpromazine-5-oxide and tetrarnethylene oxide are the products of the reaction between CPZ and TMD. UV spectroscopic and gas chromatographic studies indicated a 1:1 stoichiometry for the TMD/CPZ reaction and no competition between this reaction and triplet acetone quenching by indole or sorbate. In view of these results, we reinvestigated the oxidation of CPZ by the IBAL/HRP/02 system, a reaction which has been suggested to occur via energy transfer from triplet acetone to CPZ in an earlier study. Using methods developed since the earlier study, we verified that this reaction in fact occurs via direct reaction between CPZ and HRP radicals produced during IBAL oxidation, without the intervention of triplet acetone. In another parallel study, we determined kinetic and thermodinamic parameters of a series of dioxetanes with different types of γ hydrogens in order to examine how the interaction between oxygen and the γ hydrogens might influence these parameters. Thus, a series of 3-methyl-3-alkyldioxetanes (alkyl = n-propyl, n-butyl and neopentyl) was sintesized and their thermal activation parameters (Ea, ΔS≠, 3Φ and 1Φ) determined. The results indicated that there are no significant differences among these dioxetanes; consequently the oxygen-γ hydrogen interaction is relativelly unimportant. However, when compared with other dioxetanes of similar structure (alkyl=ethyl, isopropyl and terc-butyl; joint study done with other researchers), there is a significant change in Ea upon increasing the number of rnethyl groups at the α position, pointing to a steric effect of the 3,3 type.

Ao contrário das reações bioluminescentes, que apresentam rendimentos quânticos de emissão de luz por volta de 90%, as reações quimiluminescentes, geralmente, apresentam rendimentos abaixo de 1%. Entretanto, existe um sistema quimiluminescente cujo rendimento está na faixa de 30%, o denominado sistema peróxi-oxalato, descoberto na década de 60 e muito utilizado hoje em dia como ferramenta analítica. O sistema peróxi-oxalato consiste na reação de ésteres fenólicos do ácido oxálico com H2O2, catalisada por uma base e em presença de compostos poliaromáticos fluorescentes com baixos potenciais de oxidação (ACT). Um dos principais motivos para que este sistema seja tão pesquisado há trinta anos deve-se ao seu alto rendimento quântico de emissão e à dificuldade em se obter informações sobre o mecanismo de geração de estados excitados. Na verdade, até hoje não se sabe com certeza qual é o intermediário de alta energia (IAE) que transfere a \"energia química\" para o ACT, levando este último para o estado excitado que, pelo decaimento, emite luz. Uma controvérsia ainda maior existe sobre o mecanismo de quimi-excitação. Enquanto a maior parte dos pesquisadores da área aceitam o mecanismo \"Chemically lnitiated Electron Exchange Luminescence\" (CIEEL) como operante no sistema peróxi-oxalato e em muitos outros sistemas quimiluminescentes, alguns pesquisadores argumentam em contrário a este mecanismo, mostrando as suas deficiências e a falta de evidências claras para a comprovação da seqüência de eventos proposta. Os estudos mecanísticos desenvolvidos até o presente momento sobre o sistema peróxi-oxalato permitiram propor (I) diversas moléculas como lAE, responsáveis pela excitação do ACT (I - IV). Neste trabalho é relatado um estudo mecanístico do sistema peróxi-oxalato, o único com alta eficiência comprovada que pode envolver o mecanismo CIEEL, com o objetivo de contribuir para um melhor entendimento do passo de quimi-excitação. Foi sintetizado um derivado do intermediário do tipo 11, o 4-clorofenil O,O-hidrogênio monoperoxalato (1), caracterizado por RMN 13C (INVGATE), infi-avermelho e espectrometria de massa. O resultado mais significativo deste trabalho é o fato de 1, em presença de um ACT (i.e. rubreno, DPA, perileno), não emitir luz, o que exclui, definitivamente, intermediários do tipo fi como intermediários de alta energia. 1 somente emite em presença de um ACT e de bases com pKa adequado (pKa > 6). Tal fato sugere que deve ocorrer uma reação química anterior à emissão, provavelmente uma ciclização, que dá origem ao intermediário de alta energia. Foram feitos estudos cinéticos da reação de 1 com diversas bases [i.e. imidazol, p-clorofenolato e t-butóxido de potássio e 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno], observando-se a emissão de luz em presença de DP A ou a absorção do p-clorofenol liberado em 292 orn. Destes estudos puderam ser propostos esquemas mecanísticos dos processos que antecedem a etapa de quimiexcitação e foram obtidas evidências indiretas para a ocorrência da 1,2-dioxetanodiona (I) como lAE. Visando obter informações sobre a etapa de quimio-excitação foram medidos os rendimentos quânticos de quimiluminescência da reação de 1 com imidazol, em presença de sete ativadores, com diferentes potenciais de oxidação. Destes estudos foram obtidas informações indiretas a respeito da velocidade de transferência de elétron. Com estes dados pode-se verificar a validade do mecanismo CIEEL, propondo um mecanismo condizente com os resultados experimentais. Para finalizar, tentou-se verificar a natureza volátil do lAE e de seqüestrar o lAE, possivelmente a 1,2-dioxetanodiona (I), utilizando-se trifenilantimônio. Apesar de várias tentativas, utilizando diversas condições experimentais, os resultados foram pouco conclusivos. / Contrarily to bioluminescent reactions which present quantum yields of around 90%, chemiluminescent reactions generally present quantum efficiencies of around 1%. However, there is a chemiluminescent system discovered in the 60\'s and widely used nowadays as analytical tool, which quantum yields can reach up to 30%, the so called peroxyoxalate system. This system consists in the reaction of aromatic oxalyl esteres with H2O2 catalyzed by a base in the presence of polyaromatic, highIy fluorescent compounds with low oxidation potentials (ACT). The main reason for the studies of the peroxyoxalate system during 30 years is its highIy chemiluminescence quantum yield and difficulties to obtain informations about the mechanism of the excited states generation. In fact, there is no strong evidence till now about the high energy intermediate (HEI) responsible for the transformation of the \"chemical energy\" into the ACTs electronically excitation, which leads to light emission. There exists a still greater controversy with respect to the chemiexcitation mechanism. While the most chemiluminescence researchers accept the \"Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence\" (CIEEL) mechanism to explain the chemiexcitation process in the peroxyoxalate and many others chemiluminescent systems, some researchers contest it, exposing the lack of clear evidences for the sequence of events proposed. The mechanistic research developed till now about the peroxyoxalate system allowed the proposal of several structures as (I) HEI, as the most probable to excite the ACT (I-IV). In this work is reported a mechanistic study on the peroxyoxalate system, the only one with proven high efficiency supposed to involve the CIEEL mechanism, aiming to contribute to a better knowledge of the chemiexcitation pathway. A type n intermediate derivative, 4-chIorophenyl O,O-hydrogen monoperoxalate (1), was synthesized and characterized by l3C NMR (INVGATE) inftared and mass spectrometry. Perhaps the most significant result in this work is the fact that 1, in the presence of a suitable ACT (i.e. rubrene, DPA, perylene) does not lead to light emission. What excludes definitively type n structures as high energy intermediates in the peroxyoxalate system. Moreover, as 1 only lead to light emission in the presence ofbases with suitable pKa (pKa > 6) and an ACT, it suggests that a chemical reaction has to take place before emission, probably a cyclization leading to the high energy intermediate. Kinetic investigations on the reaction of 1 with several bases [i.e. imidazole, potassiump-chlorophenolate and t-butoxide and 1,8-bis(dimethylamino)naphthaleneJ were performed. The reaction was followed either by light emission in the presence of DPA or by changes in absorption at 292 nm due to p-chlorophenol released. These investigations allow the proposal of mechanistic schemes for the processes that occur before chemiexcitation and indirect evidences for the occurrence of 1,2-dioxetanedione (I) as the HEI could be obtained. The chemiluminescent quantum yields of the reaction of 1 with imidazole in the presence of seven ACTs with different oxidation potentials were measured with the aim to obtain informations about the chemiexcitation pathway. Indirect informations on the electron transfer rate constant could be obtained. The validity of the CIEEL mechanism could be verified with these data and a mechanism proposed which is in agreement with the experimental results. Finally, trapping of the HEI, probably 1,2-dioxetanedione (I), using triphenylantimony was attempted. Several attempts to trap the HEI, although using various experimental conditions, were not successful. The results were not conclusive.

Ao contrário das reações bioluminescentes, que apresentam rendimentos quânticos de emissão de luz por volta de 90%, as reações quimiluminescentes, geralmente, apresentam rendimentos abaixo de 1%. Entretanto, existe um sistema quimiluminescente cujo rendimento está na faixa de 30%, o denominado sistema peróxi-oxalato, descoberto na década de 60 e muito utilizado hoje em dia como ferramenta analítica. O sistema peróxi-oxalato consiste na reação de ésteres fenólicos do ácido oxálico com H2O2, catalisada por uma base e em presença de compostos poliaromáticos fluorescentes com baixos potenciais de oxidação (ACT). Um dos principais motivos para que este sistema seja tão pesquisado há trinta anos deve-se ao seu alto rendimento quântico de emissão e à dificuldade em se obter informações sobre o mecanismo de geração de estados excitados. Na verdade, até hoje não se sabe com certeza qual é o intermediário de alta energia (IAE) que transfere a \"energia química\" para o ACT, levando este último para o estado excitado que, pelo decaimento, emite luz. Uma controvérsia ainda maior existe sobre o mecanismo de quimi-excitação. Enquanto a maior parte dos pesquisadores da área aceitam o mecanismo \"Chemically lnitiated Electron Exchange Luminescence\" (CIEEL) como operante no sistema peróxi-oxalato e em muitos outros sistemas quimiluminescentes, alguns pesquisadores argumentam em contrário a este mecanismo, mostrando as suas deficiências e a falta de evidências claras para a comprovação da seqüência de eventos proposta. Os estudos mecanísticos desenvolvidos até o presente momento sobre o sistema peróxi-oxalato permitiram propor (I) diversas moléculas como lAE, responsáveis pela excitação do ACT (I - IV). Neste trabalho é relatado um estudo mecanístico do sistema peróxi-oxalato, o único com alta eficiência comprovada que pode envolver o mecanismo CIEEL, com o objetivo de contribuir para um melhor entendimento do passo de quimi-excitação. Foi sintetizado um derivado do intermediário do tipo 11, o 4-clorofenil O,O-hidrogênio monoperoxalato (1), caracterizado por RMN 13C (INVGATE), infi-avermelho e espectrometria de massa. O resultado mais significativo deste trabalho é o fato de 1, em presença de um ACT (i.e. rubreno, DPA, perileno), não emitir luz, o que exclui, definitivamente, intermediários do tipo fi como intermediários de alta energia. 1 somente emite em presença de um ACT e de bases com pKa adequado (pKa > 6). Tal fato sugere que deve ocorrer uma reação química anterior à emissão, provavelmente uma ciclização, que dá origem ao intermediário de alta energia. Foram feitos estudos cinéticos da reação de 1 com diversas bases [i.e. imidazol, p-clorofenolato e t-butóxido de potássio e 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno], observando-se a emissão de luz em presença de DP A ou a absorção do p-clorofenol liberado em 292 orn. Destes estudos puderam ser propostos esquemas mecanísticos dos processos que antecedem a etapa de quimiexcitação e foram obtidas evidências indiretas para a ocorrência da 1,2-dioxetanodiona (I) como lAE. Visando obter informações sobre a etapa de quimio-excitação foram medidos os rendimentos quânticos de quimiluminescência da reação de 1 com imidazol, em presença de sete ativadores, com diferentes potenciais de oxidação. Destes estudos foram obtidas informações indiretas a respeito da velocidade de transferência de elétron. Com estes dados pode-se verificar a validade do mecanismo CIEEL, propondo um mecanismo condizente com os resultados experimentais. Para finalizar, tentou-se verificar a natureza volátil do lAE e de seqüestrar o lAE, possivelmente a 1,2-dioxetanodiona (I), utilizando-se trifenilantimônio. Apesar de várias tentativas, utilizando diversas condições experimentais, os resultados foram pouco conclusivos. / Contrarily to bioluminescent reactions which present quantum yields of around 90%, chemiluminescent reactions generally present quantum efficiencies of around 1%. However, there is a chemiluminescent system discovered in the 60\'s and widely used nowadays as analytical tool, which quantum yields can reach up to 30%, the so called peroxyoxalate system. This system consists in the reaction of aromatic oxalyl esteres with H2O2 catalyzed by a base in the presence of polyaromatic, highIy fluorescent compounds with low oxidation potentials (ACT). The main reason for the studies of the peroxyoxalate system during 30 years is its highIy chemiluminescence quantum yield and difficulties to obtain informations about the mechanism of the excited states generation. In fact, there is no strong evidence till now about the high energy intermediate (HEI) responsible for the transformation of the \"chemical energy\" into the ACTs electronically excitation, which leads to light emission. There exists a still greater controversy with respect to the chemiexcitation mechanism. While the most chemiluminescence researchers accept the \"Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence\" (CIEEL) mechanism to explain the chemiexcitation process in the peroxyoxalate and many others chemiluminescent systems, some researchers contest it, exposing the lack of clear evidences for the sequence of events proposed. The mechanistic research developed till now about the peroxyoxalate system allowed the proposal of several structures as (I) HEI, as the most probable to excite the ACT (I-IV). In this work is reported a mechanistic study on the peroxyoxalate system, the only one with proven high efficiency supposed to involve the CIEEL mechanism, aiming to contribute to a better knowledge of the chemiexcitation pathway. A type n intermediate derivative, 4-chIorophenyl O,O-hydrogen monoperoxalate (1), was synthesized and characterized by l3C NMR (INVGATE) inftared and mass spectrometry. Perhaps the most significant result in this work is the fact that 1, in the presence of a suitable ACT (i.e. rubrene, DPA, perylene) does not lead to light emission. What excludes definitively type n structures as high energy intermediates in the peroxyoxalate system. Moreover, as 1 only lead to light emission in the presence ofbases with suitable pKa (pKa > 6) and an ACT, it suggests that a chemical reaction has to take place before emission, probably a cyclization leading to the high energy intermediate. Kinetic investigations on the reaction of 1 with several bases [i.e. imidazole, potassiump-chlorophenolate and t-butoxide and 1,8-bis(dimethylamino)naphthaleneJ were performed. The reaction was followed either by light emission in the presence of DPA or by changes in absorption at 292 nm due to p-chlorophenol released. These investigations allow the proposal of mechanistic schemes for the processes that occur before chemiexcitation and indirect evidences for the occurrence of 1,2-dioxetanedione (I) as the HEI could be obtained. The chemiluminescent quantum yields of the reaction of 1 with imidazole in the presence of seven ACTs with different oxidation potentials were measured with the aim to obtain informations about the chemiexcitation pathway. Indirect informations on the electron transfer rate constant could be obtained. The validity of the CIEEL mechanism could be verified with these data and a mechanism proposed which is in agreement with the experimental results. Finally, trapping of the HEI, probably 1,2-dioxetanedione (I), using triphenylantimony was attempted. Several attempts to trap the HEI, although using various experimental conditions, were not successful. The results were not conclusive.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-15T17:12:41Z No. of bitstreams: 1 2016_AnaCarolinaAlvesRocha.pdf: 1420736 bytes, checksum: 28bb7df1c15c90799ff379ce314b2820 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-16T18:01:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AnaCarolinaAlvesRocha.pdf: 1420736 bytes, checksum: 28bb7df1c15c90799ff379ce314b2820 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T18:01:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AnaCarolinaAlvesRocha.pdf: 1420736 bytes, checksum: 28bb7df1c15c90799ff379ce314b2820 (MD5) / A doença celíaca (DC) é uma desordem sistêmica e imunomediada por glúten em indivíduos geneticamente suscetíveis. A doença está associada ao antígeno leucocitário humano (HLA II), DQ2 e DQ8 e é caracterizada por inflamação intestinal, atrofia das vilosidades e autoimunidade. Os anticorpos IgA contra transglutaminase tecidual (tTG IgA) são marcadores sensíveis empregados no diagnóstico laboratorial da DC. Atualmente, existem duas metodologias laboratoriais mais empregadas na mensuração desse anticorpo, uma delas é a metodologia de ELISA, que é considerada método referência, e amplamente utilizada no diagnóstico de DC, e a outra, é a metodologia de quimioluminescência, cuja performance analítica foi objeto deste estudo. Foram analisadas 182 amostras de soro de pacientes do Laboratório de Pesquisas em Doença Celíaca (LABDC), 11 amostras positivas e 171 amostras negativas dosadas por Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA (método referência). Todas as amostras foram mensuradas empregando ELISA e quimioluminescência, nos equipamentos Best-2000® e Bio-Flash. Os resultados revelaram que a quimioluminescência comparada ao ELISA, é substancialmente concordante (k=0,732) e reprodutível, apresentando CV de controles negativos e positivos respectivamente de 4,4% e 3,4% na avaliação da precisão intraensaio, e na precisão interensaio, demonstrando CV para controles negativos de 2,9% e positivos de 2,7%. O método apresentou sensibilidade de 81,8%, especificidade de 97,6%, e acurácia de 94%, mostrando-se mais sensível que específico quando comparado ao método referência. No que se refere ao desempenho clínico-laboratorial da quimioluminescência, o método demonstrou Valor Preditivo Positivo (VPP) de 69,2% e Valor Preditivo Negativo (VPN) de 98,8%, que demonstra elevada capacidade de discriminar indivíduos celíacos e não-celíacos, por meio da curva ROC, que apresentou área sobre a curva de 0,9972. Diante das análises realizadas, podemos concluir que a metodologia de quimioluminescência além da sua robustez e randomicidade, apresentou cut-off semelhante ao método referência, capacidade discriminatória entre celíacos e não-celíacos, com Risco Relativo de 58,5 vezes maior para o desenvolvimento de DC quando tTG IgA for positivo, e Odds Ratio de 187,9 demonstrando forte associação entre o exame positivo e chance de desenvolver DC. Com estes resultados, podemos inferir que a quimioluminescência pode ser utilizada como método de escolha para o diagnóstico laboratorial da DC. ___________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Celiac disease (CD) is a systemic immune-mediated and gluten disorder in genetically susceptible individuals. The disease is associated with human leukocyte antigen (HLA II) DQ2 and DQ8 and is characterized by intestinal inflammation, atrophy of the villi and autoimmunity. IgA antibodies against tissue transglutaminase (tTG IgA) are sensitive markers used in laboratory diagnosis of CD. Currently, there are two most used laboratory methods to measure the antibody, one of them is the ELISA methodology, which is considered the gold standard and widely used in the diagnosis of CD and the other, is the chemiluminescence method, whose analytical performance was studied in this research. Serum samples of 182 Research Laboratory patients in Celiac Disease (LABDC), 11 positive samples assayed by Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA (gold standard) and 171 negative samples. All samples were measured using ELISA and chemiluminescent Best-2000® and Bio-Flash devices. The results revealed that the chemiluminescence compared to ELISA is substantially consistent (k = 0.732), and reproducible, with CV negative and positive controls respectively 4.4% and 3.4% in the assessment of intra-assay precision, and inter-assay precision negative controls showing CV 2.9% positive and 2.7%. The method showed a sensitivity of 81.8%, specificity 97.6% and accuracy of 94%, being more sensitive than specific when compared to the gold standard. In regards to the clinical and laboratory performance, chemiluminescence method showed Positive Predictive Value (PPV) of 69.2% and Negative Predictive Value (NPV) 98.8%, which demonstrates high ability to discriminate celiac individuals and non-celiac, through the ROC curve, which showed an area of 0.9972 of the curve. On the analysis performed, we conclude that the chemiluminescence methodology beyond its robustness and randomness, presented cut-off similar to the gold standard, discriminatory power among celiacs and non-celiacs, with relative risk 58.5 times for development CD when tTG IgA is positive, and odds ratio of 187.9 demonstrating strong association between positive test and a chance of developing CD. With these results, we can infer that chemiluminescence can be used as a method of choice for laboratory diagnosis of CD.

Do interesse em espécies eletronicamente excitadas geradas por sistemas luminescentes químicos e biológicos, nasceu o interesse dos químicos pelos dioxetanos, seu comportamento e suas propriedades. Propostos como intermediários de tais reações, estes compostos (peróxidos cíclicos de anel tetratômico) sofrem clivagem térmica unimolecular com produção de dois fragmentos carbonílicos, um deles no estado eletronicamente excitado. Em geral, dioxetanos substituídos por grupos alquílicos e arílicos levam a altos rendimentos de estados triplete. Propôs-se, então, reinvestigar a termólise do tetrametildioxetano (TMD) em meio aquoso e utilizar esta fonte de acetona triplete como modelo químico, para o sistema enzimático de produção de acetona triplete (oxidação aeróbica do isobutanal (IBAL)/peroxidase (HRP)), em estudos de supressão e transferência de energia. O TMD tem sido preparado e cristalizado rotineiramente em nosso laboratório, pelo método de Kopecky. Os parâmetros de ativação de termólise (estabilidade térmica e rendimentos de quimiexcitação dos produtos) foram reestudados em solventes aromáticos (benzeno e tolueno), cicloalifáticos (ciclohexano e decalina), próticos (água) e apróticos (acetonitrila e CCl4).Concluiu-se que: (i) a estabilidade do TMD não é afetada pela natureza do solvente (Ea ~ 27,0 kcal mol-1); (ii) a eficiência global de transferência de energia triplete (acetona) → singlete (9,10-dibromoantraceno) nos solventes não aromáticos é praticamente constante (ΦTS ~ 10 %); (iii) em solventes aromáticos onde o doador excitado é na verdade um \"exciplex\" acetona-solvente, ΦTS ~ 30 %. A relação entre os rendimentos de quimiexcitação de triplete e singlete (3Φ /1Φ) em água foi determinada como sendo da ordem de 1x103, que concorda com valores determinados em tolueno e benzeno (7x102 e 8x102, respectivamente). Nos estudos em meio aquoso, o DBAS e o DPAS foram utilizados para monitorar a presença de acetona triplete e singlete, formada química, fotofísica ou enzimaticamente. Ambos foram sintetizados em nosso laboratório e suas propriedades fotofísicas, determinadas em água deionizada a 20°C. Através da medida de fluorescência do DBAS excitado por transferência de energia a partir de acetona triplete, determinou-se a vida média de acetona triplete em meio aquoso aerado e deaerado (τaer ~ 2 µs e τN2 ~ 10 a 20 µs). Seis classes de interceptadores de acetona triplete, gerada na termólise de TMD, foram investigadas em tampão aquoso a 35°C: dienos (ácido sórbico e acrilonitrila), pigmentos xantênicos, riboflavina, tirosina e derivados 3,5-dihalogenados, indol e derivados indólicos, e uma série de quinonas. Em geral, os valores das constantes de supressão de acetona triplete produzida diretamente no seio da solução, a partir de TMD, estão pelo menos uma ordem de grandeza abaixo dos valores correspondentes para acetona triplete produzida enzimaticamente. Estes resultados são consistentes com a hipótese de que acetona triplete gerada dentro da enzima tem vida média mais longa, pois se encontraria parcialmente \"protegida\" da ação supressora de O2. Outros argumentos podem, entretanto, ser igualmente satisfatórios. Parece claro que os supressares indólicos (IP ~ 8 eV) e ácido sórbico exercem sua ação através da formação de complexos de transferência de carga, tirosina e corantes xantênicos (IP ~ 7 eV) por um mecanismo de transferência de elétrons e riboflavina por mecanismo tipo Förster. As quinonas, cuja afinidade eletrônica é bastante alta (IP ~ 10-11 eV), suprimem acetona triplete por um mecanismo controlado por difusão; com estes compostos, o limite superior do esperado para um processo puramente colisional seria atingido (kq ~ 1 a 2x1010 M-1s- 1, em água a 35°C). De fato, derivados metilados de p-benzoquinona e naftoquinona suprimem acetona triplete com velocidade mais baixa, enquanto que em solvente mais viscoso (decalina, em relação a n-hexano), kq também é mais lenta. Por outro lado, observou-se um marcante \"efeito de átomo pesado\" na eficiência de transferência de energia triplete (acetona) → singlete (corante xantênico): ΦTS para fluoresceína, eosina e Rose Bengala na proporção 1:15:320. A oxidação da clorpromazina (CPZ) por reação com o TMD foi estudada em meio aquoso e meio tamponado e verificou-se que esta independe da formação de espécies excitadas, apesar da CPZ apresentar-se como eficiente supressor de acetona triplete. Espectros de RMN1H mostraram que a reaçao entre CPZ e TMD gera a clorpromazina-5-óxido (sulfóxido; CPZO) e o óxido de tetrametiletileno (o epóxido correspondente ao TMD). Estudos de espectroscopia U.V. e de cromatografia gasosa indicam que a estequiometria da reação TMD/CPZ é 1:1 e que a presença de competidores de supressão de acetona triplete não altera a velocidade da reação nem a estequiometria da mesma. Em vista destes resultados, reestudou-se a oxidação de CPZ pelo sistema do IBAL/HRP/O2, estudo feito inicialmente por DURÁN e colaboradores, no qual os autores propõem que a oxidação de CPZ é resultante de transferência de energia de excitação da acetona triplete gerada enzimaticarnente. Usando métodos inexplorados até então, verificamos a possibilidade de esta oxidação ocorrer por reação direta entre CPZ e os radicais de HRP formados durante a oxidação do isobutanal, sem a intervenção da acetona triplete. Outro estudo parelelo a este, foi feito visando determinar parâmetros cinéticos e termodinâmicos em dioxetanos com diferentes tipos de hidrogênios em posição γ do anel. Este estudo visava determinar de que maneira a interação oxigênio do anel-hidrogênio gama influia em tais parâmetros. Sintetizou-se uma série de 3-metil-3-alquildioxetanos (alquil = n-propil, n-butil e neopentil) e determinamos os seus parâmetros de ativação de termólise (Ea, ΔS≠, 3Φ e 1Φ). Constatamos que não há diferença significativa entre estes dioxetanos, sendo assim, a interação hidrogênio gama-oxigênio do anel é inexpressiva. Porém, quando comparados com outros dioxetanos da mesma série, onde alquil = etil, isopropil e terc-butil (estudo em conjunto com outros pesquisadores) nota-se urna expressiva mudança na Ea a medida que aumenta o número de grupos rnetila na posição α, indicando um efeito estérico do tipo 3,3. / The interest in eletronically excited species generated by chemical and biological systems give rise to at interest in dioxetanes, their behavior and their properties. These coumpounds (cyclic four-membered ring), which have been proposed as intermediates in such reactions, undergo unimolecular thermal cleavage yielding two carbonyl fragments, one of which is tipically formed electronically excited. In general, alkyl and aryl substitued dioxetanes give high yields of triplet states. In the present work, the thermolyses of tetramethyldioxetane (TMD) was reinvestigated in agueous medium. This source of triplet acetone was then employed in quenching and energy transfer studies as a chemical model for the enzymatic systems which produces triplet acetone I aerobic oxidations of isobutanal (IBAL) catalysed by horseradish peroxidase (HRP) I. TMD was prepared and crystalised normally in our laboratory using Kopecky\'s method. Thermal activation parameters (thermal stability and chemiexcitation quantum yields) have been determined in several types of solvents, including aromatics (benzene and toluene), cycloaliphatics (cyclohexene and decalin), protic (water) and aprotic (acetonitrile and carbon tetrachloride) .We conclude that: (i) TMD stability is not affected by the nature of the solvente (Ea ~ 27,0 kcal/mol), (ii) the overall energy transfer efficiency 3Ac* → 1DBAS* is practically constant (ΦTS ~ 10%) in non-aromatic solventsi (iii) in aromatic solvents, where the excited donor is an acetone-solvent \"exciplex\", ΦTS ~ 30%. The ratio of triplet and singlet chemiexcitation yields (3Φ /1Φ) in water was deterrnined to be 1x103. This value is in good agreement with these determined in toluene and benzene (7x102 and 8x102, respectivelly). In studies in aqueous medium, DBAS and DPAS were used as probes to monitor the production of triplet and singlet acetone formed chemically, photophysically or enzymatically. Both probes were prepared in our laboratory and their photophysical properties deterrnined in deionized water at 20°C. The lifetime of triplet acetone in aerated and deaerated aqueous media was deterrnined on the basis of the cherniluminescence intensity of DBAS excited by energy transfer (τaer ~ 2 µs e τN2 ~ 10 a 20 µs). Six classes of quenchers were investigated in aqueous buffer at 35°C: dienes (sorbic acid and acrylonitrile), xanthene dyes, tyrosine and its 3,5-dihalogenoderivatives, indole and indolic derivatives, riboflavin and a serie of quinones. In general, rate constants for quenching of triplet acetone produced free in solution via TMD thermolyses are one order of magnitude lower than those for quenching of enzymatically generated triplet acetone. These results are in line with the hypothesis of a longer lifetime of the triplet acetone generated within the enzyme due a parcial \"protection\" for O2 quenching. It seerns clear that the indolic coumpounds (IP ~ 8 eV) and sorbic acid quench triplet acetone through the forrnation of a charge-transfer complex, tyrosine ans xanthene dyes (IP ~ 7 eV) by an electron-transfer mechanism and riboflavin by a Förster type mechanism. The quinones, which have high electronic affinities (IP ~ 10- 11 eV) , quench triplet acetone by a diffusion controlled process (kq ˜ 1 to 2x1010 M-1s-1 in water at 35°C). Methyl derivatives of p-benzoquinone and naphtoquinone quench triplet acetone at a slower rate; kq is also lower in a more viscous solvent (decalin versus n-hexane). On the other hand, the results indicate a strong \"heavy atom effect\" on the energy transfer efficiency from triplet acetone to singlet xanthene dye: ΦTS for fluorescein, eosin and Rose Bengal in the ratio 1:15:320. The chlorpromazine (CPZ) oxidation by reaction with TMD was studied in aqueous and buffered media. This reaction does not depend on the production of excited species, even though CPZ proved to be an efficient trip1et acetone quencher. The NMR1H spectra showed that chlorpromazine-5-oxide and tetrarnethylene oxide are the products of the reaction between CPZ and TMD. UV spectroscopic and gas chromatographic studies indicated a 1:1 stoichiometry for the TMD/CPZ reaction and no competition between this reaction and triplet acetone quenching by indole or sorbate. In view of these results, we reinvestigated the oxidation of CPZ by the IBAL/HRP/02 system, a reaction which has been suggested to occur via energy transfer from triplet acetone to CPZ in an earlier study. Using methods developed since the earlier study, we verified that this reaction in fact occurs via direct reaction between CPZ and HRP radicals produced during IBAL oxidation, without the intervention of triplet acetone. In another parallel study, we determined kinetic and thermodinamic parameters of a series of dioxetanes with different types of γ hydrogens in order to examine how the interaction between oxygen and the γ hydrogens might influence these parameters. Thus, a series of 3-methyl-3-alkyldioxetanes (alkyl = n-propyl, n-butyl and neopentyl) was sintesized and their thermal activation parameters (Ea, ΔS≠, 3Φ and 1Φ) determined. The results indicated that there are no significant differences among these dioxetanes; consequently the oxygen-γ hydrogen interaction is relativelly unimportant. However, when compared with other dioxetanes of similar structure (alkyl=ethyl, isopropyl and terc-butyl; joint study done with other researchers), there is a significant change in Ea upon increasing the number of rnethyl groups at the α position, pointing to a steric effect of the 3,3 type.

Submitted by Milena Dias (milena.dias@ufpe.br) on 2015-03-11T18:45:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Nascimento.pdf: 1454020 bytes, checksum: 73cd5ca8b0b7ae1ddc1a673abfd7e2d9 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T18:45:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Nascimento.pdf: 1454020 bytes, checksum: 73cd5ca8b0b7ae1ddc1a673abfd7e2d9 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES / A inflamação granulomatosa na esquistossomose mansônica acontece quando o ovo fica retido no tecido vivo e não consegue amadurecer ou ser expulso, promovendo alterações patológicas severas no indivíduo infectado. O objetivo deste trabalho foi avaliar quantitativamente as lesões granulomatosas de tecido hepático de camundongos infectados com esquistossomose mansônica, através do uso de lectinas conjugadas a um composto quimiluminescente, o éster de acridina (EA). As lectinas Concanavalina A (Con A), Wheat Germ Agglutin (WGA) e Sambucus Nigra Agglutin (SNA) foram conjugadas ao éster de acridina e incubadas no tecido hepático de camundongos esquistossomóticos. A quimiluminescência foi expressa em Unidades Relativas de Luz (RLU). Fragmentos do tecido hepático infectado e de tecido normal foram incubados com ConA-EA, WGA-EA e SNA-EA e ficou evidenciado que houve um aumento da expressão de α-D-glicose/manose e N-acetilglicosamina nos tecidos infectados em relação ao tecido normal, enquanto que não houve significativa diferença entre os valores de α-NeuNAc-[2→6]-Gal/GalNAc dos fígados infectados e não infectados. Assim, a histoquímica quimiluminescente mostrou-se uma ferramenta eficaz na avaliação de mudanças patológicas causadas por esquistossomose mansônica.

A química de 1,2-dioxetanos tem sido alvo de estudos intensivos desde sua primeira síntese há aproximadamente 25 anos atrás. Tais moléculas de alto conteúdo energético, quando termolisadas, geram dois compostos carbonílicos, um deles podendo ser formado em um estado eletronicamente excitado. Na termólise de dioxetanos contendo substituintes \"simples\", são formadas principalmente espécies excitadas triplete. Entretanto, quando o anel peroxídico contém substituintes doadores de elétrons, tais compostos tornam-se mais lábeis, sofrendo decomposição segundo o mecanismo de transferência de elétron denominado \"Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence\" (CIEEL). Este trabalho relata a síntese e as propriedades quimiluminescentes dos dioxetanos I a IV. O estudo da decomposição em presença de íons fluoreto nos permite distinguir entre catálise por transferência de elétron através da ligação (dioxetano II) e através do espaço (dioxetano IV). Observação: Ilustrações de dioxetanos I-IV disponíveis no resumo em PDF Na síntese de I a IV foi utilizado o clássico método de Kopecky para a obtenção de dioxetanos a partir das respectivas olefinas, via β-bromo-hidroperóxidos. Os 1,2-dioxetanos foram purificados através de cromatografia em coluna a baixas temperaturas e caracterizados pelos dados espectroscópicos (1H-NMR e 13C-NMR). A decomposição unimolecular de I-IV forneceu apenas os produtos de clivagem esperados, os correspondentes compostos carbonílicos. Para I e II, foi observada emissão direta com um máximo em 412 nm, enquanto para III e IV foi necessária a utilização de sensibilizadores para a detecção e a quantificação de compostos carbonílicos eletronicamente excitados. Os parâmetros de ativação para a termólise de I-IV, determinados em tolueno a partir de gráficos de Eyring e de Arrhenius numa faixa de temperaturas de 65 a 80 ºC, apresentaram valores muito semelhantes aos normalmente observados na decomposição unimolecular de dioxetanos trissubstituídos. Além disso, foram observados altos rendimentos quânticos de produtos carbonílicos excitados triplete, similar àqueles obtidos para 1,2-dioxetanos trissubstituídos contendo substituintes alquila e arila. Para a determinação de rendimentos quânticos utilizou-se 9,10-difenilantraceno (DPA), para estados excitados singlete e 9,10-dibromoantraceno (DBA), no caso dos tripletes. Em presença de íons fluoreto, as constantes de velocidade para a decomposição de II e IV são aproximadamente quatro ordens de grandeza superiores àquelas observadas para a decomposição unimolecular a temperatura ambiente: os tempos de meia-vida (t1/2) destes dioxetanos (81 e 24h, respectivamente), são reduzidos a aproximadamente 15s. Além disso, observa-se forte emissão em 560 nm devido à formação preferencial de estados excitados singlete. Os rendimentos quânticos singlete para a decomposição catalisada de II e IV, determinados através de medidas de emissão direta, foram 100 e 1,0 %, respectivamente. Os parâmetros de ativação determinados para as reações de decomposição catalisadas por fluoreto são consideravelmente mais baixos do que aqueles obtidos para as de decomposição unimolecular. Para explicar os resultados obtidos, propusemos um mecanismo detalhado, baseado no esquema mecanístico CIEEL. A primeira transferência de elétron do fenolato gerado para o anel peroxídico ocorre com a mesma eficiência no caso de II e IV. Porém, a diferença observada entre os rendimentos quânticos singlete (Φs) indica que, no caso de IV, a segunda transferência de elétron ocorre com eficiência consideravelmente mais baixa. A observação de catálise na decomposição de IV constitui o primeiro exemplo de mecanismo CIEEL intramolecular em 1,2-dioxetanos iniciado pela transferência de elétron de um doador que não está diretamente ligado ao anel peroxídico (transferência de elétrons através do espaço). Além disso, como os parâmetros de quimiluminescência, especificamente os rendimentos quânticos obtidos para II e IV, podem ser explicados com base na proposta mecanística CIEEL, este trabalho pode ser considerado como mais uma evidência para a validade deste polêmico mecanismo. / The generation of visible light by a living organism or by a chemical reaction is a sufficiently rare and unusual event to attract the interest of biologists, biochemists and chemists. The chemiluminescent reaction most extensively investigated over the past 25 years, is the thermolysis of 1,2-dioxetanes. These high energy molecules generate mainly triplet excited carbonyl compounds on thermal decomposition, except when the dioxetane ring bears electron-donating substituents. In the latter case, such labile dioxetanes follow an intramolecular electron transfer mechanism, probably via the CIEEL (Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence) pathway. This work reports our results on the synthesis and the chemiluminescence properties of the dioxetanes I to IV. These compounds serve as models to distinguish between resonance electron transfer (dioxetane II) and through space electron transfer (dioxetane IV) in their fluoride-catalyzed decomposition. Note: Dioxetanes I-IV illustrations available at the PDFs Summary The classical Kopecky method for the preparation of dioxetanes from the corresponding alkenes via β-bromohydroperoxides was the route used for the synthesis of I to IV. The dioxetanes were purified by low-temperature silica gel cromatography and characterized on the basis of their spectral data (1H-NMR and 13C-NMR). Thermal decomposition of I-IV gave the expected cleavage products, the corresponding carbonyl compounds. For I and II, direct emission was observed with a maximum at 412 nm, while for III and IV it was necessary to use sensitizers for the detection and quantification of the eletronically excited carbonyl compounds. Upon unimolecular decomposition, the dioxetanes I-IV show activation parameters and excited state yields expected for trisubstituted 1,2-dioxetanes; relatively high stability (ΔG≠approximately equal to 25 kcal.mol-1) and preferential formation of triplet excited states are observed. The excitation yields were deterrnined by the well-stablished methods, in which 9,10-diphenylantracene (DPA) is employed for singlet and 9,10-dibromoantracene (DBA) for triplet state counting. In the presence of tetrabutylammonium fluoride, which causes the deprotection of the phenol group to the corresponding phenolate, the decomposition rates of II and IV are increased drastically. The deprotected derivatives decompose about 104 times faster than the protected ones, and a strong direct emission with a maximum at 560 nm is observed. The singlet quantum yields for the catalyzed decomposition of II and IV were 100 and 1,0 % respectively. The activation parameters for the fluoride catalyzed decomposition are considerably lower than that for the unimolecular one. These facts indicate the occurrence of an intramolecular \"Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence\" (CIEEL) mechanism, leading to the preferential formation of singlet excited states. The proposed mechanism, based on the CIEEL scheme, involves removal of the silyl protecting group, promoted by fluoride, to generate the phenoxy-anion, which subsequently acts as an electron donor to the dioxetane moiety, leading to dioxetane cleavage and excited states formation. The first electron transfer from the phenolate to the peroxide ring occurs with the same rate in both cases. Therefore, the observed difference between the singlet quantum yields indicate that the back electron transfer occurs with lower efficiency in the case of IV. The observation of fluoride catalysis in the decomposition of dioxetane IV constitutes the first example of an intramolecular CIEEL mechanism in 1,2-dioxetanes initiated by electron transfer from a donor which is not directly bond to the peroxide ring (\"through space electron transfer\"). Moreover, as the chemiluminescence parameters, specifically the quantum yields of II and IV, can be explained based on the proposed pathways for the CIEEL mechanism, this work supplies additional evidence for the validity of this widely cited but still polemic mechanism.

A reação peroxioxalato está sendo amplamente utilizada para as mais variadas aplicações analíticas e bioanalíticas, porém, esta transformação é pouco estudada em meios aquosos, importantes principalmente para aplicações bioanalíticas. Neste trabalho foi estudada a reação de oxalato de bis(2,4,6-triclorofenila) (TCPO) com peróxido de hidrogênio (H2O2), em 1,2-dimetoxietano e em água, catalisada por 2,6-lutidina (2,6-dimetilpiridina). Observou-se que a reação ocorre com essa base agindo como um catalisador não-nucleofílico. A reação peroxioxalato foi realizada também em tampão borato onde a espécie reativa é a base conjugada do H2O2. A partir da dependência da constante de velocidade de decaimento da intensidade de emissão (kobs) com a concentração de peróxido de hidrogênio e do tampão borato se obtiveram evidências que a reação neste meio ocorre por catálise básica específica. Por último, a reação foi estudada em meio tampão borato contendo os líquidos iônicos (LIs) tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio (bmimBF4), cloreto de 1-alil-3- metilimidazólio (AmimCl) e acetato de 1-alil-3-metilimidazólio (AmimAc). A presença dos LIs no tampão resulta em um aumento dos rendimentos de formação de estados excitados singlete (Φs). Contrariamente, o aumento da concentração de sais comuns, como cloreto e acetato de tetrabutilamonio e NaCl, causou a diminuição dos valores dos rendimentos quânticos de quimiluminescência. As constantes de velocidade observadas aumentaram tanto com a concentração dos LIs quanto dos sais comuns. Os valores dos rendimentos quânticos de quimiexitação obtidos foram correlacionados com os parâmetros de viscosidade e polaridade das misturas. De maneira geral, foi mostrado neste trabalho que a reação peroxioxalato pode ser conduzida em meios essencialmente aquosos e a presença de LIs leva a um aumento do rendimento quântico de emissão, fatos importantes para potenciais aplicações analíticas. / The peroxyoxalate reaction is being widely used for a variety of analytical and bioanalytical applications, however, this transformation is very little studied in aqueous media, important mainly for bioanalytical applications. In this work was studied the reaction of bis(2,4,6-trichlorophenil) oxalate (TCPO) with hydrogen peroxide (H2O2) in 1,2-dimethoxyethane and water catalyzed by 2,6-lutidine (2,6-dimethylpyridine) was studied and it is observed that it occurs with this base acting as a non-nucleophilic catalyst. The peroxyoxalate reaction was also performed in aqueous borate buffer where the reactive species is the conjugate base of H2O2. Evidence is obtained that this reaction occurs through specific base catalysis from the dependence of the emission decay rate constant (kobs) with the hydrogen peroxide and borate buffer concentration. Finally, the reaction was studied in borate buffer media containing the ionic liquids (ILs) 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate (bmimBF4), 1-allyl-3-methylimidazolium chloride (AmimCl) and 1-allyl-3-methylimidazolium acetate (AmimAc). The presence of ILs in the buffer results in a concentration dependend increase of the yields of excited state formation (Φs). In contrast, the increase of the concentration of common salts, such as tetrabutylammonium chloride, tetrabutylammonium acetate and NaCl, caused a decrease in the emission quantum yields. The observed rate constants increased with both, the concentration of ILs and common salts. The chemiexcitation quantum yields values obtained were correlated with the viscosity and polarity parameters of the mixtures. In conclusion, it was shown in this work that the peroxyoxalate reaction can be conducted in essentially aqueous media and the presence of ILs leads to an increase in the emission quantum yields, important facts for potential analytical applications.