Este trabalho apresenta dados relativos a oxidação de melatonina catalisada por peroxidase de rábano (HRP, horseradish peroxidase) e mieloperoxidase (MPO). Em presença de peróxido de hidrogênio (H2O2), HRP catalisa a oxidação de melatonina com formação de um produto de clivagem do anel indólico, a N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina. Esta reação consome oxigênio e apresenta quimiluminescência na região de 440-540 nm. Quimiluminescência e a formação da quinuramina também foram observados quando HRP/H2O2 foram substituídos por neutrófilos ativados por acetato de forbol miristato ou zimosan opsonizado. Em neutrófilos, tanto a emissão de luz quanto a formação do produto foram inibidos pela adição de azida, um inibidor de MPO. Superóxido dismutase tem um forte efeito inibidor sobre a emissão de luz enquanto que catalase e ácido úrico não apresentam qualquer efeito. A oxidação de melatonina por neutrófilos ativados pode ser relevante in vivo e estar associada com algumas das funções descritas para mieloperoxidase e melatonina. A possível implicação biológica da oxidação de melatonina por neutrófilos, especialmente em condições inflamatórias, é discutida. / In the presence of hydrogen peroxide, horseradish peroxidase (HRP) catalyzes the production of N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine from melatonin. This reaction consumes oxygen and exhibits chemiluminescence in the 440-540 nm region. The excited cleavage product derived from the thermolysis of an intermediate dioxetane is suggested to be the emitting species. Chemiluminescence and the indole ring cleavage product were also observed when HRP/H2O2 was replaced by phorbol myristate acetate or opsonized zymosan-activated neutrophils. Azide, a myeloperoxidase inhibitor, strongly suppressed melatonin oxidation. Superoxide dismutase has a strong inhibitory effect on light emission but catalase and uric acid are without effect on the emission. The oxidation of melatonin by activated neutrophils may be relevant to the in vivo functions of myeloperoxidase and melatonin. The possible biological implication of melatonin oxidation by neutrophils, especially in inflammatory conditions, is discussed.

Reações quimiluminescentes envolvem geralmente a formação de um intermediário de alta energia que pode ocorrer em um ou vários passos seguida pela reação térmica deste intermediário, conduzindo a um produto eletronicamente excitado e consequente liberação da energia de excitação em forma de emissão de fluorescência ou fosforescência. O mecanismo de grande parte das reações orgânicas quimiluminescentes ainda não foi completamente esclarecido, especificamente no que diz respeito ao passo de quimiexcitação, o passo elementar onde a energia \"química\" da reação se transforma em energia de excitação eletrônica. O uso de peróxidos cíclicos (1,2­-dioxetanos e 1,2-­dioxetanodionas) como compostos-­modelo e a observação de sua decomposição quimiluminescente, permitiram a formulação dos mecanismos pelos quais estados excitados eletronicamente se formam nos processos quimiluminescentes. Neste trabalho são apresentadas diversas tentativas de síntese e a síntese de um 1,2-­dioxetano. De modo a obter maiores informações sobre a decomposição unimolecular dos 1,2-­dioxetanos, os parâmetros de ativação para a decomposição térmica unimolecular destes 1,2-dioxetanos foram determinados, demonstrando a alta estabilidade dos compostos e os valores calculados dos parâmetros de ativação mostram que não há a participação de decomposição escura dos dioxetanos. O aumento do grupo substituinte mostra um aumento na estabilidade dos dioxetanos. A decomposição induzida por fluoreto do derivado contendo um substituinte 3-­ sililóxi-­fenila ocorre com altos rendimentos quânticos de quimiluminescência. A velocidade da reação apresenta uma diminuição com o aumento da concentração de água no meio, mostrando a influência da solvatação dos íons fluoretos na reação de desproteção do grupo sililóxi. Os parâmetros de ativação mostram variação com a concentração de água. Também é relatado um estudo mecanístico do sistema peróxi-­oxalato, o único com alta eficiência comprovada que pode envolver o mecanismo CIEEL, com o objetivo de observar o passo de formação do intermediário de alta energia, proposto como a 1,2-dioxetanodiona, envolvendo a saída de dois grupos fenólicos na etapa lenta da reação, monitorados tanto pela cinética de decaimento da emissão, quanto pela absorbância dos grupos de partida fenólicos. Foram sintetizados ésteres assimétricos, simétricos e derivados perácidos, caracterizados por RMN de 13C. Foi utilizada a base não nucleofílica, 2,6­dimetilpiridina (lutidina), para garantir a reação direta do peróxido de hidrogênio com o éster oxálico. Relacionando as constantes de velocidades observadas nos diferentes ésteres assimétricos, simétricos e derivados perácidos pode-­se propor um mecanismo para a saída independente dos fenóis e verificar que 1,2-­dioxetanodiona é o mais provável intermediário de alta energia / Chemiluminescent reactions usually involve the formation of a high energy intermediary, which occurs in one or several steps, followed by the thermal reaction of this intermediary, leading to an electronically excited product, and the liberation of excitation energy by fluorescence or phosphorescence. The mechanism of most of the chemiluminescent organic reactions is not known yet, in special the chemiexcitation step, where the \"chemical\" energy is transformed in electronic excitation energy. The use of cyclic peroxides (1,2-­dioxetanes and 1,2-dioxetanones) as model and the observation of the chemiluminescent decomposition, lead to formulate mechanisms where the electronic excitated states are formed in chemiluminescent process. In this work are presented several attempts of synthesis and one 1,2-dioxetane synthesis. The activated parameters for the thermal unimolecular decomposition of these 1,2-­dioxetanes were determinated, showing the high stability of the compounds and the obtained values shown no dark decomposition process of the 1,2-­dioxetanes. The increase of size of the substituent group leads to a higher stability of 1,2-­dioxetanes. The induced decomposition by fluoride of the derivative containing substituent 3-­phenyl-­silyloxy occurs with high chemiluminescent quantum yields. The rate constant shows a decrease with the increase of the water concentration, which indicates the fluoride solvatation influence on the deprotection of silyloxy group. The activation parameters also show variation with the water concentration. Also is reported a mechanistic study of peroxyoxalate system, the only which high efficiency can involve the mechanism CIEEL, with the aim of observing the formation step of the high energy intermediate, proposed as the 1,2-­ dioxetanodione, involving the departure of two phenolic groups in the slow step of reaction, monitored both by the kinetics of light emission decay, as the absorbance of the leaving phenolic groups. Assymetric esters, symetric esters and peracid derivate were synthesized and characterized by 13C RMN. A non-­nucleophilic base was used, 2,6-­dimethylpyridine (lutidine), to guarantee the direct reaction of hydrogen peroxide with oxalic ester. Relating the rate constants observed in different asymmetric and symmetric esters and peroxyacids derivatives can propose a mechanism for independent phenol release and 1,2-­dioxetanodione verifies that it is most likely the high energy intermediate.

Como intuito de contribuir para a elucidação do mecanismo de quimi-excitação da reação peroxi-oxalato, a transformação quimiluminescente mais eficiente conhecida que envolve a versão intermolecular do mecanismo \"Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence\" - CIEEL, foram efetuados estudos cinéticos e determinados os rendimentos quânticos de quimi-excitação desta reação em diferentes solventes e misturas de solventes. A cinética da reação de oxalato de bis-2,4,6-triclorofenila com peróxido de hidrogênio, catalisada por imidazol foi estudada na presença de 9,10-difenilantraceno como ativador (ACT) em diferentes solventes. O comportamento das constantes de velocidade observados em função da polaridade e viscosidade dos solventes indica que o mecanismo dos passos iniciais desta transformação até a formação do intermediário de alta energia (IAE) não sofre modificações drásticas em função das propriedades de solventes, permitindo a escolha de solventes e misturas de solventes adequados para o estudo do mecanismo de quimi-excitação do sistema. A influência da viscosidade sobre os rendimentos quânticos singlete (Φs) e os rendimentos quânticos singlete na concentração infinita do ACT (Φs∞ - obtidos de gráficos duplo recíprocos entre os (Φs) e a [ACT]) foi estudada em misturas entre acetato de etila e ftalato dimetilico (que possuem viscosidades diferentes e parâmetros de polaridade similares, além de levarem a rendimentos quânticos altos), indicando um aumento considerável dos rendimentos quânticos singlete com o aumento da viscosidade do meio. Os dados foram tratados com base nos modelos colisional e friccional, obtendo indicação clara da operação de um efeito de gaiola do solvente no processo de quimi-excitação da reação neste sistema de alta eficiência. A influência da polaridade do meio sobre os parâmetros de quimi-excitação da reação peroxi-oxalato foi analisada, de maneira análoga, em misturas entre tolueno e acetato de etila e entre acetato etila e acetona. Os rendimentos quânticos singlete aumentam inicialmente em função da polaridade do meio até um valor máximo, a partir do qual eles sofrem diminuição com o aumento da polaridade. Este comportamento indica a melhor solvatação dos pares de íons radicais pelo aumento da polaridade de solvente levando ao aumento dos rendimentos, entretanto, polaridades maiores do meio podem levar à formação de pares de íons separados por solvente e íons separados, desta maneira diminuindo a eficiência da quimi-excitação. Os parâmetros de quimiluminescência da reação peroxi-oxalato foram ainda estudados em uma série de solventes puros com diferentes valores de polaridade e viscosidade. Os rendimentos quânticos obtidos foram correlacionados com os parâmetros de viscosidade, polaridade e polarizabilidade, utilizando-se uma regressão linear múltipla. Deste ajuste se pode confirmar que a viscosidade exerce a maior influência sobre os rendimentos quânticos e o aumento da polaridade contribui também para maiores rendimentos, entretanto, os parâmetros de ajuste contêm erros muito grandes devido à dispersão dos valores. Contrariamente, o aumento da polarizabilidade do meio parece diminuir a eficiência de quimi-excitação. / In order to contribute to the elucidation of the chemiexcitation mechanism of peroxyoxalate reaction, the most efficient chemiluminescence reaction known that involves the intermolecular \"Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence\" - CIEEL mechanism, kinetically studies were performed and chemiexcitation quantum yields determined in different solvents and solvent mixtures. The reaction kinetics of bis(2,4,6-trichlorophenyl) oxalate with hydrogen peroxide catalyzed by imidazole in the presence of 9,10-diphenylanthracene as an activator (ACT) was studied in different solvents. The behavior of the observed rate constants in function of solvents polarity and viscosity indicates that the initials reaction steps leading to high energy intermediate formation (HEI) do not change drastically in function of the solvent properties, allowing to choose suitable solvents and solvent mixtures for a study of its the chemiexcitation mechanism. The viscosity influence on the singlet quantum yields (Φs) and singlet quantum yields at infinite ACT concentration (Φs∞ - obtained from double reciprocal plots between Φs and [ACT]) was studied in mixtures of ethyl acetate and dimethyl phthalate (which have different viscosities and similar polarity parameters), indicating a considerable increasing in singlet quantum yields with the increasing of medium viscosity. Data were analyzed by the collisional and the free volume model, which clearly indicates the occurrence of a solvent cage effect in the chemiexcitation process of this high efficient system. The influence of medium polarity on the chemiexcitation parameters of the peroxyoxalate reaction were studied, in a similar way, in mixtures of toluene and ethyl acetate and in mixtures of ethyl acetate and acetone. Singlet quantum yields increase in function of medium polarity for low polar solvents, reaching a maximum value, where a further polarity increase leads to a decrease in quantum yields. This behavior indicates better solvation of radical íon pairs by solvent polarity increase, leading to increased quantum yields, however, higher solvent polarities can lead to the formation of solvent separated ion pairs and individually solvate ions, thereby decreasing chemi-excitation efficiency. Chemiluminescence parameters of the peroxyoxalate reaction were also studied in pure solvents with different viscosities and polarities. The obtained singlet quantum yields were correlated with viscosity, polarity and polarizability parameters by multiple linear regression analysis. The correlations obtained show that viscosity exerts the most significant influence on the quantum yields and an increase in solvent polarity also contributes to higher quantum yields; however, these fitting parameters possess high standard deviations due to the considerable dispersion of quantum yield values. Contrary, an increase in medium polarizability appears to decrease the chemi-excitation efficiency.

Investigou-se a influência de íons metálicos Al(III), Ca(II), Fe(III), Pb(II), Cu(II) e Cr(III) (10-6 a 10 -3 mol L-1 na intensidade relativa de fluorescência (IRF) do ácido húmico (AH, 10 mg L-1). os íons Cu(ii), Pb(II) e Cr (III) produziram um efeito de supressão, enquanto os íons Fe(III), Al(III) e Ca(II) não influenciaram significativamente nos valores de IRF. A partir dos valores de IRF foram calculadas a constante de estabilidade (K) dos complexos e a capacidade complexante do AH com Cu(II), Pb(II) e Cr(III). Os valores de K seguiram a ordem: Cr(III)> Pb(II) > Cu(II) e a capacidade complexante: Cr(III) ~ Pb(II)> Cu(II). Desenvolveu-se um novo método analítico baseado na reação quimiluminescente da oxidação do AH com peroxomonosulfato de potássio (PMS; 0,6 mol L-1</SUP) ) em meio básico (NaOH 1,0 mol L-1 ). A intensidade máxima de radiação emitida (Imáx ) e a área em função do tempo foram lineares com a quantidade de AH em solução na faixa de 0,5 a 20 mg L-1, com o limite de detecção de 0,24 mg L-1 , com limite de detecção de 0,24 mg L-1 . Um estudo comparativo foi realizado utilizando-se H2O2 (0,58 mol L-1 na presença de CH2O (0,44 mol L-1) em meio básico (NaOH 0,16 mol L-1) com limite de detecção de 0,4 mg L-1. As adições dos íons Cl-, NO3- , PO43- , CO32- , Fe(III), Cu(II), Cr(III) e Ca(II) na reação quimiluminescente de AH com PMS, não interferiram significativamente no sinal. Adições de 50 mg L-1 de Co(II) ou Mn(II) à solução de AH Aldrich, na forma de complexos de EDTA ou cloretos, aumentaram o valor Imáx devido à formação de espécies fortemente oxidantes como SO5°-, SO4°- HO° durante a reação de decomposição do PMS. O método foi aplicado para determinar a concentração de AH em amostra de água do Rio Miranda - MS, obtendo-se valores entre 2,9 a 12,3 mg L-1 . As reações de oxidação, com emissão de radiação, de alguns compostos orgânicos com PMS em meio básico foram estudadas. Com os polifenóis obtiveram- se intensidades de radiação mais significativas e os valores de área seguiram a seguinte ordem: floroglucinol >> ácido fúlvico > ácido húmico > resorcinol > ácido pirogálico > catecol > hidroquinona. Desta forma, como polifenóis existem na estrutura de substâncias húmicas, acredita-se que essas porções da molécula devem ser as responsáveis pela produção de quimiluminescência. / The influence of Al(III), Ca(II), Fe(III), Pb(II), Cu(II), and Cr(III) metal ions (10-6 to 10-3 mol L-1) on the relative fluorescence intensity (RFI) of humic acid (HA, 10 mg L-1) was investigated. Cu(II), Pb(II), and Cr(III) ions produced a quenching effect, while Fe(III), Al(III), and Ca(II) ions did not significantly interfere with RFI values. Stability constants (K) and complexing capacities of HA with Cu(II), Pb(II), and Cr(III) were obtained using RFI values. Stability values of complexes followed the order: Cr(III)> Pb(II) > Cu(II) and the complexing capacity values: Cr(III) ~ Pb(II) > Cu(II). A new analytical method was developed based on the chemiluminescent oxidation of HA by peroxymonosulfate (PMS; 0.6 mol L-1) in basic medium (NaOH 1.0 mol L-1). The intensity of radiation emission (Imax) and area vs. time were linear functions of HA concentration range of 0.5-20 mg L-1. The detection limit was 0.24 mg L-1. A comparative study was conducted using H2O2 (0.58 mol L-1) in the presence of CH2O (0.44 mol L-1) in basic medium (NaOH 0.16 mol L-1). The detection limit was 0.4 mg L-1 of HA. The addition of Cl-, NO3-, PO43-, CO32-, Fe(III), Cu(II), Cr(III), and Ca(II) to the chemiluminescent reaction of HA with PMS did not interfere with the signal. The addition of 50 mg L-1 Co(II) or Mn(II) (as EDTA complexes or chloride salts) to the HA sample enhanced radiation emission, due to the formation of strong oxidant species such as SO5o-, SO4o-, and HOo during PMS decomposition reaction. This method was applied to determine HA concentration in a sample of river water (Miranda River - MS), obtaining values between 2.9 and 12.3 mg L-1. Oxidation reactions of some organic compounds by PMS in basic medium were studied, which produced radiation emission. Polyphenols produced the highest emissions and the area values followed the order: phloroglucinol> fulvic acid> humic acid> resorcinol> pyrogalic acid> cathecol> hydroquinone. Since polyphenolic groups are supposed to exist within humic acid structure, those portions of the molecule are most likely to be responsible for that chemiluminescence.

O sistema quimiluminescente peróxi-oxalato vem sendo estudado por diversos grupos de pesquisa ao redor do mundo desde os anos 60. Esse interesse em especial se deve ao fato de que em comparação com a maioria dos sistemas quimiluminescentes, que apresentam rendimentos quânticos da ordem de 1%, esse sistema apresenta rendimentos quânticos de emissão consideravelmente maiores, cerca de 30%. O sistema peróxi-oxalato consiste na reação de ésteres fenólicos substituídos derivados do ácido oxálico com peróxido de hidrogênio, catalisada por uma base e em presença de compostos aromáticos policondensados fluorescentes com baixo potencial de oxidação, chamados de ativadores (ACT). O mecanismo desta reação, apesar de intensamente estudado, ainda não se encontra completamente esclarecido. Especificamente, a estrutura do intermediário formado durante a reação, que é responsável pela quimiexcitação do ativador, não é conhecida ainda. No presente trabalho, foram completados estudos previamente efetuados no nosso grupo com derivados perácidos, intermediários na reação peróxi-oxalato. Foram sintetizados e caracterizados dois novos derivados perácido, o O,Ohidrogênio monoperóxi-oxalato de 3-clorofenila e o O,O-hidrogênio monoperóxioxalato de 3-nitrofenila. Dos estudos cinéticos da reação destes perácidos com imidazol, na presença de 9,10-difenilantraceno como ativador, foram obtidos constantes de velocidade de ciclização e rendimentos quânticos singlete. As constantes de velocidade determinadas, junto com os dados obtidos anteriormente no grupo, mostram correlação linear de energia livre com as constantes de substituintes de Hammett, obtendo-se um valor de = 2,18 ± 0,16, o que indica a formação de alta densidade de carga negativa no estado de transição do passo lento. A correlação linear entre as constantes de velocidade e os valores de pKa dos grupos de partida fenólicos levou à determinação do valor de &#946;GP = -1,07 ± 0,08, indicando que a quebra da ligação para o grupo de partida é muito avançada no estado de transição no passo lento da reação. Os rendimentos quânticos singlete mostram dependência com as propriedades eletrônicas dos substituintes, aumentando inicialmente com o aumento das propriedades de atração de elétron do substituinte, porém, com substituintes mais atraentes que hidrogênio, observa-se uma leve diminuição no rendimento quântico. O conjunto de dados apresentados neste trabalho, junto com os resultados obtidos anteriormente pelo grupo, demonstra claramente que a reação de ciclização dos perácidos, catalisada por imidazol, deve ocorrer de maneira concertada, ou seja, a saída do grupo de partida fenólico ocorre em conjunto com o ataque nucleofílico do íon percarboxilato à função éster no passo lento da reação. Conseqüentemente, foram obtidas neste trabalho evidências experimentais fundamentadas para a ocorrência da 1,2- dioxetanodiona como intermediário de alta energia na reação peróxi-oxalato. / The peroxyoxalate chemiluminescence has been intensely studied since the sixties by several research groups all around the world. This interest is mainly due to the fact that the peroxyoxalate system is highly efficient, showing quantum yields of around 30 %, much higher than other well known chemiluminescence reactions which commonly show quantum yields of around 1% or less. The peroxyoxalate system consists in the base catalyzed reaction of activated oxalate esters with hydrogen peroxide in the presence of highly fluorescent polycondensed aromatic hydrocarbons with low oxidation potentials, called activators (ACT). Although intensely investigated, the mechanism of this complex transformation is still not yet completely clarified. This is true specifically for the structure of the high-energy intermediate, formed during the reaction sequence, which is responsible for chemiexcitation, not known at all up to now. In the present work, former studies of our group on peracid derivatives, intermediates in the peroxyoxalate reaction, were completed. Two new peracid derivatives, 3-chlorophenyl O,O-hydrogen monoperoxyoxalate and 3- nitrophenyl O,O-hydrogen monoperoxyoxalate were synthesized and characterized. Kinetic studies on the reaction of these peracid derivatives with imidazole, in the presence of 9,10-diphenylanthracene as activator, led to the determination of cyclization rate constants and singlet quantum yields. These rate constants, together with data formerly obtained by our group, show linear free-energy correlation with the Hammett substituent constants, resulting in a reaction constant of = 2,18 ± 0,16, that indicates the formation of a high negative charge density in the transition state of the rate-limiting step. Similarly, the linear correlation of the rate constants with the pKa values of the phenolic leaving groups leads to the determination of a value &#946;GP = -1,07 ± 0,08, indicating a high degree of leaving group bond cleavage in the transition state of the rate-limiting step. The singlet quantum yields also show dependence on the electronic properties of the substituents, initially increasing with the increase in the electron withdrawing nature of the substituent, however, a slight decrease in the quantum yields is observed with substituents more electron withdrawing than hydrogen. The data accumulated in this work, together with results earlier obtained in our group, clearly demonstrate that the cyclization reaction of the peracid derivatives, catalyzed by imidazole, proceeds in a concerted manner, i.e. the phenolic leaving group departure occurs together with the nucleophilic percarboxylate attach to the ester function in the rate-limiting reaction step. Consequently, it was possible to obtain in this work solid experimental evidence for the occurrence of 1,2-dioxetandione as the high-energy intermediate in the peroxyoxalate reaction.

O sistema peróxi-oxalato consiste na reação entre ésteres oxálicos e peróxido de hidrogênio, na presença de um catalisador básico e/ou nucleofílico e de um composto fluorescente com baixo potencial de oxidação (ACT), resultando em uma emissão eficiente de quimiluminescência. O sistema é amplamente utilizado em diversas aplicações analíticas, entretanto, sua aplicação é limitada devido às dificuldades de sua adaptação em meios aquosos. Nesse trabalho foram realizados estudos cinéticos da reação peróxi-oxalato em uma mistura binária de 1,2-dimetóxietano/água (1/1) em tampão fosfato (pH 6, 7 e 8), utilizado-se os ésteres oxalato bis(2,4,6-triclorofenila) (TCPO), oxalato de bis(4- metilfenila) (BMePO) e oxalato de bis(4-nitrofenila) (BNPO). A partir da dependência da constante de velocidade de decaimento da intensidade de emissão (kobs) com a concentração de peróxido de hidrogênio e do tampão fosfato obteve-se evidências da ação do fosfato como catalisador básico específico na reação de TCPO. Porém, os resultados indicam também que na reação de BMePO o fosfato age principalmente como catalisador ácido. A reação peróxi-oxalato (TCPO, H2O2, ACT e imidazol) foi realizada também em meio de 80% de líquidos iônicos. Três líquidos iônicos contendo o cátion 1-butil- 3-metilimidazólio (bmim) com os contra-íons tetrafluroborato, hexafluorofosfato e hexafluoroantimonato foram utilizados obtendo-se valores de kobs maiores em bmimPF6, seguida do meio em bmimBF4e por fim em bmimSbF6. Os rendimentos quânticos determinados alcançaram valores de quase 20% em meio de bmimSbF6, além disso, foram obtidas evidências experimentais de que o mecanismo CIEEL esteja envolvido no passo de quimi-excitação da reação peróxi-oxalato nestes meios / The peroxyoxalate system consists in the reaction of oxalic esters with hydrogen peroxide in the presence of basic and/or nucleofilic catalysts and a fluorescent compound with low oxidation potential (ACT), resulting in efficient chemiluminescence emission. This system is widely utilized in various analytical applications; however, its use is limited due to the difficulties to adapt it to aqueous media. In this work, kinetic studies of the peroxyoxalate reaction were performed in phosphate buffered (pH 6, 7 and 8) binary 1,2-dimethoxyethane/water mixtures (1/1), using the oxalate esters bis(2,4,6-trichlorophenyl) oxalate (TCPO), bis(4- methylphenyl) oxalate (BMePO) and bis(4-nitrophenyl) oxalate (BNPO). Evidence for the action of the phosphate as a specific base catalyst in the reaction of TCPO was obtained from the dependence of the emission decay rate constant (kobs) on the hydrogen peroxide and phosphate buffer concentration. However, the results also indicate that phosphate acts mainly as an acid catalyst in the reaction of BMePO. The peroxyoxalate reaction (TCPO, H2O2, ACT and imidazole) was also performed in 80 % of ionic liquids. Three ionic liquids containing the cation 1-butyl- 3-methylimidazolium (bmim) with contra-ions tetrafluoroborate, hexafluorophosphate and hexafluoroantimonate were used obtaining higher rate constant values for bmimPF6, followed by bmimBF4 media and finally bmimSbF6. The quantum yields determined reached almost 20% in the medium bmimSbF6, additionally, experimental evidence was obtained for the occurrence of the CIEEL mechanism in the chemiexcitation step of the peroxyoxalate reaction in these media

O fenômeno da bio- e quimiluminescência tem atraído o interesse da comunidade científica nas últimas décadas não só pelo seu inerente interesse acadêmico, mas também devido as incontáveis aplicações analíticas que dele têm surgido. A maior parte do trabalho acadêmico que tem sido desenvolvido está relacionado ao estudo do mecanismo de geração de estados excitados e a eficiência de desativação radiativa. Por outro lado, do ponto de vista das aplicações tecnológicas, as metodologias para análise de enzimas, drogas e metabólitos, aplicadas à imunologia, microbiologia, medicina forense, etc., que se baseiam em quimiluminescência, estão entre as mais utilizadas em procedimentos de rotina em laboratórios. O desenvolvimento de substratos e, conseqüentemente, novas técnicas quimiluminescentes tem se tornado cada vez mais importante devido a alta sensibilidade desses ensaios, tipicamente equivalente ou melhor do que aqueles que utilizam rótulos radioativos. Esta tese apresenta o desenvolvimento de novas metodologias quimiluminescentes para a determinação de atividade enzimática. O princípio químico é a geração de peróxidos cíclicos instáveis, conhecidos como 1,2-dioxetanos, após a hidrólise de substratos específicos, catalisada pela enzima objeto de estudo. Anéis dioxetânicos são conhecidos pela sua propriedade de gerar produtos em estados eletronicamente excitados quando decompostos. A emissão de luz pode ser relacionada à atividade enzimática. Foi desenvolvido o substrato (fosfato dissódico de 2-metil-1-propenila, NA-MPP) (I)), capaz de produzir o composto 2-metil-1-propen-1-ol quando hidrolisado via a ação catalítica das enzimas fosfatase alcalina (ALP) ou fosfatase ácida (ACP). Este enol é oxidado, sob ação catalítica da enzima peroxidase de raiz forte (HRP), gerando acetona em estado excitado triplete. A emissão de luz direta ou sensibilizada da acetona excitada pode ser correlacionada a atividade enzimatica da ALP ou ACP. A determinação da atividade dessas enzimas livres ou ligadas em anticorpos (conjugados ALP-IgG) tem grande aplicação em tecnologias de diagnóstico, seja como um marcador de diversas doenças, seja como uma sonda em ensaios imuno-enzimáticos (EIA). A sensibilidade alcançada com este substrato foi de 10-15 mols de ALP, 0,0027 unid. de ACP e diluições de até 300.000 de um conjugado (ALP-IgG) por ensaio. Também foi possível correlacionar a atividade de ALP à velocidade de consumo do oxigênio dissolvido no meio de reação, que é uma característica dessa oxidação. Partindo do mesmo princípio delineado no parágrafo anterior, desenvolveu-se um composto para determinação de proteases. Para isso, o composto N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida (II) foi preparado, pois a clivagem de sua ligação amídica geraria uma enamina, que também pode ser oxidada pela ação catalítica da HRP. No entanto, nossos estudos mostraram que este composto não é reconhecido como substrato das proteases. Tomando como base a bem conhecida característica de gerar uma fraca emissão de luz quando derivados indólicos são oxidados por agentes oxidantes clássicos, como KMnO4, K2S2O4, etc., foi estudado o potencial quimiluminescente de alguns derivados indólicos quando submetidos ao sistema HRP/H2O2/O2. Como era esperado, detectou-se quimiluminescência de baixa intensidade para a maioria dos derivados indólicos. Também neste caso a clivagem do anel indólico, via um intermediário dioxetânico, parece ser a responsável pela emissão observada na maioria dos compostos testados. Além disso, a oxidação do composto 2-metilindol (III) mostrou uma eficiência de quimiluminescência com cerca de 3 ordens de grandeza maior que os demais derivados. Verificou-se que o comportamento diferenciado desse composto estava relacionado à exclusiva formação de um composto secundário. A estrutura desse composto foi parcialmente atribuída ao 2,2\'-dimetil-2,2\'-diindoxil. Então, utilizando o 2-metilindol como substrato, desenvolveu-se uma metodologia analítica para determinação de HRP livre ou ligada em anticorpos (conjugados HRP-IgG). Assim como no caso da enzima ALP, conjugados do tipo HRP-IgG são largamente utilizados em EIA. Também com base nas características quimiluminescentes de \'alfa\'-hidroperóxi-cetonas quando submetidas a um forte meio alcalino, desenvolveu-se um potencial substrato para análise de esterases. A hidrólise catalisada por esterase de 2-peracetoxiadamantano-2-carboxialdeído (IV) geraria um \'alfa\'-hidroperóxi-aldeído, que por um ataque nucleofílico intramolecular, levaria a um intermediário dioxetânico. Este composto mostrou-se instável, gerando quimiluminescência mesmo na ausência da enzima. Este fato inviabilizou o seu uso como planejado. / The bio- and chemiluminescent phenomena have attracted the scientists attention in the last decades not only because its inherent academic interests, but also due the uncounted analytical applications that it has originated. Most of the academic work was devoted to the study of the mechanism responsible for the generation of the excited states and the efficiency of radiative deactivation. On the other hand, the technological developments pointed to methodologies for enzyme, drug, and metabolite determination applied to immunological, microbiology, forensic science, etc., based on chemiluminescence, which are already among the most applied techniques in routine laboratory procedures. The development of chemiluminescent substrates has become increasingly important due to their high sensitivity, typically equivalent to or better than assays using radioactive labels. This thesis reports the development of new chemiluminescent methodologies for enzymatic activity determination. The chemical basis is the generation of unstable cyclic peroxides, called 1,2-dioxetanes, upon hydrolysis of specific substrates catalyzed by the target enzyme. Dioxetanes rings are known by their properties to generate electronically excited products upon decomposition. The light emission can be related to enzymatic activity. It was developed a substrate (dissodium 2-methyl-1-propenyl phosphate) (Na-MPP) (I) able to produce 2-methyl-1-propen-1-ol when catalytically hydrolyzed by alkaline (ALP) or acid (ACP) phosphatases enzymes. This enol is oxidized, upon horseradish peroxidase (HRP) action, yielding acetone in triplet excited state. The direct or sensitized light emission of the excited acetone can be correlated to enzymatic activity of ALP or ACP. The activity of this enzyme, free or bound to antibody (ALP conjugates), is widely used in diagnostic technologies, either as a direct marker of several diseases or as an enzymatic probe in enzyme immunoassays (EIA). The sensibility reached with this substrate was 10-15 mols to ALP, 0,0027 u/mL to ACP and dilutions up to 300.000 of ALP-IgG per assay. Since the HRP system consumes dissolved oxygen during the oxidation of the enol, ALP quantification may be performed by following the oxygen uptake rate. By applying the same principle above delineated, it was synthesized a compound for proteases activity determination. Thus, the compound N-ethyl-N-(2-methylpropen-1-yl)benzenamide (II) was prepared, since its hydrolysis would lead to an enamine , which is known to be oxidized via HRP with light emission. However, our studies showed that II is not recognized as a substrate by proteases. Owning to the well known weak emission elicited when indole derivatives are oxidized by classical oxidants like KMnO4, K2S2O4, etc., it was studied the chemiluminescent potential when indoles are submitted to the HRP/H2O2/O2 oxidant system. Indeed, weak chemiluminescence was detected for almost all derivatives. Likewise, the oxidation of 2,3-bond of indoles, through a dioxetane intermediate leading to an open-ring product, seems responsible for this emission. Furthermore, the oxidation of 2-methylindole (III) showed a chemiluminescence efficiency about 3 orders of magnitude higher. It was observed that the high chemiluminescent yield was related to exclusive formation of a secundary product. Its structure was partially attributed to 2,2\'-dimethyl-2,2\'-diindoxil. Thus, using 2-methylindole as substrate was possible to develop an analytical procedure to quantify HRP activity, free or bound to antibodies (conjugates HRP-IgG). In EIA the enzymes HRP and ALP are the most important labels. From the also known chemiluminescent characteristics of \'alpha\'-hidroperoxy-ketones, when submitted to strong alkaline medium, it was developed a potential substrate to esterases. The esterase catalyzed hydrolysis of 2-acetylperoxiadamantane-2-carboxaldeyde (IV) would generate an \'alpha\'-hidroperoxy-aldeyde which, by an intramolecular nucleofilic attack, would lead to a dioxetane intermediate. This compound showed to be unstable and it generated chemiluminescence in the absence of the enzyme. This fact impaired its use as planned.

Foi sintetizada e caracterizada a spiro-ciclopentil-1,2-dioxetanona, um derivado de 1,2-dioxetanona inédito, de forma a se contribuir com informações acerca da quimiluminescência de peróxidos orgânicos. Estudos mecanísticos da decomposição quimiluminescente de 1,2-dioxetanonas são escassos, principalmente quando comparados à enorme quantidade de resultados existentes sobre a formação de estados excitados na decomposição de 1,2-dioxetanos. A spiro-ciclopentil-1,2-dioxetanona foi preparada pela ciclização do 1-carbóxi-1- hidroperóxiciclopentano com N,N-diciclohexilcarbodiimida, com rendimento de 1,2%, e caracterizada por RMN de 1H e 13C a baixa temperatura e pelo comportamento cromatográfico da solução peroxídica. Evidências para a ocorrência do mecanismo de Luminescência Iniciada Quimicamente por Troca de Elétron (CIEEL) na formação de estados excitados, na sua variante intermolecular, foram obtidas por estudos cinéticos da decomposição quimiluminescente dessa 1,2-dioxetanona por diferentes ativadores (ACTs). Entretanto, a decomposição desse peróxido ocorre com rendimentos de formação de estados excitados singlete baixos (&#934;S&#8776; 10-4 E mol-1), indicando que essa 1,2-dioxetanona também possui baixa eficiência de formação de estados excitados, conforme constatado recentemente para outros derivados. Foram encontradas evidências para a ocorrência de uma transferência de elétron na etapa limitante de velocidade, onde o ACT é formado no estado excitado, com um coeficiente de transferência de elétron de &#945; = 0,19. Ainda, foi observada uma correlação entre a energia livre liberada para a formação de estados excitados e os rendimentos quânticos, nos moldes do mecanismo CIEEL. De acordo com os resultados obtidos nesse trabalho e em trabalhos anteriores, postula-se que o tamanho do substituinte alquílico no anel da 1,2-dioxetanona causa um efeito drástico na eficiência da decomposição catalisada do peróxido na seqüência CIEEL, diminuindo o valor da constante de equilíbrio para a formação inicial do complexo de transferência de carga Em uma segunda parte do trabalho, foi averiguado o mecanismo da reação peróxi-oxalato em meios aquosos, uma vez que a maioria dos trabalhos sobre esta transformação nestes meios possui ênfase na aplicação analítica. Foi observado que as reações dos oxalatos de bis(2,4,6-triclorofenila) (TCPO), moderadamente reativo, e bis(2,4-dinitrofenila) (DNPO), altamente reativo, com H2O2 e catálise por imidazol, ocorrem pelo mesmo mecanismo, em 1,2-dimetoxietano e em misturas aquosas desse solvente. Para TCPO, observou-se que há a formação de um intermediário de catálise nucleofílica, previamente ao ataque nucleofílico do H2O2. Para DNPO, há uma adição nucleofílica direta do H2O2 ao éster, com e sem catálise básica por imidazol. Em meios aquosos, a hidrólise do éster oxálico ocorre paralelamente à peridrólise, que leva à emissão de luz. Entretanto, as constantes de velocidade para a peridrólise do éster são significativamente maiores do que as para a sua hidrólise. Observou-se que a reação de TCPO com H2O2 em meios orgânico e aquoso, catalisada por 2,6-lutidina (2,6-dimetilpiridina), ocorre com essa base agindo como um catalisador não-nucleofílico. Por último, estudou-se a reação de TCPO com H2O2 em tampão carbonato de potássio, um meio essencialmente aquoso, onde a espécie reativa é a base conjugada do H2O2; entretanto, a constante de velocidade da peridrólise se mostrou similar à de hidrólise do éster oxálico. Nessa última parte do trabalho, foi demonstrado que a reação peróxi-oxalato também pode ser conduzida em meios aquosos. / Spiro-cyclopentyl-1,2-dioxetanone, a new 1,2-dioxetanone derivate, was synthesized and characterized, in order to contribute to the present mechanistic knowledge on organic peroxide chemiluminescence. Mechanistic studies on the chemiluminescent 1,2-dioxetanone decomposition are highly limited, especially when compared to the huge amount of data available for 1,2-dioxetanes. The spiro-cyclopentyl-1,2-dioxetanone was prepared by 1-carboxy-1-hydroperoxycyclopentane cyclization with N,N-dicyclohexylcarbodiimide, in a 1.2% yield and characterized by low temperature 1H and 13C NMR and the chromatographic behavior of the peroxide solution. Evidence for the occurrence of the Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence (CIEEL) mechanism for excited states formation, in its intermolecular version, was obtained from kinetic studies of the chemiluminescent decomposition of this 1,2-dioxetanone with different activators (ACTs). However, the decomposition of this peroxide occurs with low yields of singlet excited state formation (&#934;S&#8776; 10-4 E mol-1), showing that also this 1,2-dioxetanone possesses low excitation efficiency, as recently found for other derivatives. Evidence was found for the occurrence of an electron transfer in the rate limiting step, where the ACT is formed in its electronically excited state, with an electron transfer coefficient &#945;= 0.19. Moreover, a correlation between the free energy released upon excited states formation and the quantum yields is observed, in agreement with the CIEEL mechanism. The results obtained in the present work together with previous data, allow to postulate that the size of the alkyl substituent on the 1,2-dioxetanone ring plays a crucial role for the efficiency of the catalyzed peroxide decomposition in the CIEEL sequence, by lowering the equilibrium constant for initial charge transfer complex formation. In a second part of this work, the mechanism of the peroxyoxalate reaction in aqueous media was studied, due to the fact that most of recent work on this system is mainly concerned only to analytical application aspects. The reaction of the moderately reactive bis(2,4,6-trichlorophenyl) (TCPO) and the highly reactive bis(2,4- dinitrophenyl) oxalate (DNPO) with H2O2 and imidazol catalysis, showed to occur by the same mechanism, in 1,2-dimethoxyethane as well as in its aqueous mixtures. For TCPO, the formation of an intermediate due to nucleophilic catalysis by imidazole was observed, preceding the H2O2 nucleophilic attack. For DNPO, direct nucleophilic addition of H2O2 to the ester occurs, with and without imidazole catalysis. In aqueous media, oxalic ester hydrolysis also occurs concomitantly to its perhydrolysis, which leads to light emission. However, the rate constants for perhydrolysis are significantly higher than the hydrolysis rate constants. For the reaction of TCPO with H2O2 in organic and aqueous medium, catalyzed by 2,6-lutidine (2,6-dimethylpyridine), it was shown that this base acts as a nonnucleophilic catalyst. Finally, the reaction of TCPO with H2O2 in potassium carbonate buffer, an essentially aqueous media, was studied, where the reactive species is the H2O2 conjugate base; however, the oxalic ester perhydrolysis rate constant proofed to be similar to its hydrolysis rate constant. In this last part it is also shown that the peroxyoxalate reaction can be carried out in aqueous media.

A reação peroxioxalato é o sistema quimiluminescente não enzimático de maior eficiência, alcançando rendimentos quânticos de até 50%. A quimiluminescência deste sistema vem sendo amplamente utilizada em aplicações analíticas e bioanalíticas visando a detecção de analitos de interesses biológicos e medicinais. O presente trabalho consistiu em se estudar a reação peroxioxalato com diferentes catalisadores e determinação de seu mecanismo em condições experimentais distintas das que vinham sendo estudadas até o momento, visando sua adaptação a meios aquosos para futuras aplicações. Foi estudada a utilização do salicilato de sódio como catalisador deste sistema em meio puramente orgânico, em substituição ao imidazol, e verificou-se a atuação do salicilato como catalisador básico geral e/ou específico. O rendimento quântico máximo desta transformação foi da ordem de 10-3 E mol-1. Ensaios cinéticos de emissão também foram realizados com ésteres oxálicos de diferentes reatividades em um sistema binário composto por 1,2-dimetoxietano/água contendo tampão fosfato como catalisador, em diferentes valores de pH. Nestas condições se observou a ocorrência de catálise ácida geral e catálise básica geral, uma vez que as constantes de velocidade se mostraram dependentes da concentração de tampão no meio reacional. Além disso, também se utilizou salicilato de sódio como catalisador no sistema binário 1,2-dimetoxietano/água, o qual também apresentou um papel catalítico importante no percurso desta transformação com diferentes ésteres oxálicos. Verificou-se nestes estudos a boa reprodutibilidade da reação peroxioxalato com salicilato de sódio como catalisador em meios parcialmente aquosos, que pode ampliar a utilização deste sistema quimiluminescente em aplicações analíticas e bioanalíticas. Quando se realizou os ensaios em um meio majoritariamente aquoso, o salicilato não se mostrou um catalisador eficiente, porém, mesmo sem catalisador, a reação peroxioxalato se mostrou reprodutível nestas condições / The peroxyoxalate reaction is the non-enzymatic chemiluminescence system with the highest efficiency, achieving quantum yields of up to 50%. The chemiluminescence of this system has been widely used in analytical and bionanalytical applications in order to detect analytes of biological and medicinal interests. The present work consisted in a study of the peroxyoxalate reaction with different catalysts and the determination of its mechanism in experimental conditions different from those studied before, aiming its adaptation to aqueous media for future applications. The use of sodium salicylate as base catalyst for this system in pure organic medium, in substitution to imidazole, was studied and shown that salicylate acts as a general and/or specific base catalyst. The maximum quantum yield obtained for the transformation in these conditions was in the order of 10-3 E mol-1. Emission experiments were also performed in a binary solvent system composed of 1,2- dimethoxyethane/aqueous phosphate buffer at different pH values as catalyst, using oxalic esters with different reactivities. In these conditions the occurrence of general acid catalysis and general base catalysis was observed, since the rate constants proved to be dependent on the buffer concentration. In addition, sodium salicylate was also used as catalyst in the binary 1,2-dimethoxyethane/water system with different oxalic esters, indicating its important catalytic role in the transformation. These studies allowed it to establish a reproducible peroxyoxalate system in partially aqueous media using sodium salicylate as base catalyst, which may increase the use of the chemiluminescence of this system in analytical and bioanalytical applications. However, when the experiments were performed in a medium containing mostly water, salicylate did not act as an efficient catalyst in these conditions. Even in the absence of catalyst, the reaction proved to be reproducible in the medium containing mostly water as solvent

O presente trabalho apresenta estudos da reação de autoxidação de Ni(II)/tetraglicina ou Cu(II)/tetraglicina induzida por S(IV). Estudos espectrofotométricos enfocaram a formação do respectivo íon metálico no estado de oxidação 3+. Verificou-se que S(IV) acelera a autoxidação de Ni(II)/tetraglicina em pH=9,2 (tampão borato), com a determinação de alguns parâmetros cinéticos desta reação. A autoxidação de Cu(II)/tetraglicina induzida por S(IV), caracterizada por efeito sinérgico positivo de Ni(II), foi empregada no desenvolvimento de método analítico para S(IV) na faixa de (0-0,12) milimolar. Este método foi utilizado para estudo da autoxidação de S(IV) catalisada por traços de íons metálicos de transição, em meio não-complexante. Estudos por quimiluminescência abordaram a interação das espécies geradas na autoxidação de Ni(II)/tetraglicina e Cu(II)/tetraglicina induzida por S(IV) com o íon tris-bipiridil-2,2´-rutênio(II). Foi avaliado o efeito de intensificação da radiação emitida, causado por tensoativos ou adições sucessivas de S(IV). A interação das espécies produzidas na autoxidação de Ni(II)/tetraglicina induzida por S(IV) com luminol foi aproveitada para desenvolvimento de método quimiluminescente para determinação de sulfito. O método proposto foi aplicado para determinação de S(IV) livre em amostras de bebidas, açúcar e água de chuva (limite de detecção 0,28 nanomolar). / The current work shows studies concerning the sulfite induced Ni(II)/tetraglycine (NiIIG4) and Cu(II)/tetraglycine (CuIIG4) autoxidation reaction in aqueous medium. Spectrophotometric studies focused on the formation of the correspondent metallic ion in the 3+ oxidation state. It was found that S(IV) accelerates NiIIG4 autoxidation at pH = 9.2 (borate buffer). Some kinetic parameters of this reaction have been successfully determined. S(IV) induced CuIIG4 autoxidation, which is characterized by the remarkable positive synergistic effect of Ni(II), was used in the development of a S(IV) analytical method in the range of (0-12)x10-5 mol L-1. This method was used to study the S(IV) catalyzed autoxidation of metallic transition ions, in non-complexing medium. Chemiluminescence studies approached the interaction between Ru(II)/bipy (tris-bipyridil-2,2´-ruthenium(II) ion) and the species generated in the S(IV) induced NiIIG4 autoxidation. The emitted radiation intensifying effect, which is caused by the presence of certain surfactants or consecutive additions of S(IV), was evaluated. The interaction between the species generated in the S(IV) induced NiIIG4 autoxidation and luminol was used in the development of a sulfite determination method by chemiluminescence. A flow system containing a gas-diffusion unit was used to separate S(IV) from the matrix. Free sulfite was determined in beverages, sugar and rainwater samples, with a detection limit of 2,8 x 10-8 mol L-1.