Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-10-03T18:10:48Z No. of bitstreams: 1 karinadeoliveirayounan_dissert.pdf: 994368 bytes, checksum: d0380b444a2b69e0b3248499e6a74c26 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T18:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karinadeoliveirayounan_dissert.pdf: 994368 bytes, checksum: d0380b444a2b69e0b3248499e6a74c26 (MD5) Previous issue date: 2014-08-22 / Introduction: The parasite Toxoplasma gondii infects a high percentage of individuals worldwide and disturbances resulting from this infection contribute to the aggravations of health conditions and may affect the intellectual development of children and adults. It has been suggested that the D antigen (Rh0) a glycoprotein that is the biochemical basis Rh but is absent in the nervous tissue, influence the motor response in the presence of T. gondii infection. Objectives: This study aims to evaluate the motor response and the reaction time for visual stimulus in the presence and in the absence of infection by the parasite T. gondii in individuals with good visual acuity, Rh positive and Rh negative. Methods: 212 volunteers from both sexes underwent visual acuity testing and measurement of average response time to visual stimulus (ART) by using a specific software. The collected blood samples were used to identify the erythrocyte RH phenotypes (positive and negative) and antibodies of IgG class anti-T. gondii (presence or absence). Average response times were compared according to sex, presence (reagents) and absence (non-reagent) infection and erythrocyte Rh phenotypes (positive and negative). The t test for comparison of average and the values of Odds Ratio (OR) and 95% confidence interval were calculated using the GraphPad Instat (version 6.3) software. The p-value equal to or less than 0.05 was considered significant. Results: The differences between the average age of reagents individuals (n = 134) and non-reagent (n = 38) to T. gondii were considered statistically significant (54.1 ± 18.7 vs 34.4 ± 18.9; p = 0.0001). The Rh phenotype positive (n = 189) was present in 89% of individuals, while the Rh-negative (n = 23) in 11%. The ART of reagents individuals for T. gondii was lower in males (0.672 ± 0.303) than in females (0.819 ± 0.270) (p = 0.0036). This same difference was observed between the non-reagent (0.475 ± 0.140 vs 0.791 ± 0.323), respectively (p <0.0001). Infected men (0.658 ± 0.282) had higher ART xi than uninfected men (0.488 ± 0.129) for T. gondii, both Rh positive (p = 0.0004). Women, infected or not, did not differ for ART even when compared by phenotype (positive or negative) Rh. Conclusions: Rh positive men infected with T. gondii have a higher ART than uninfected Rh positive men. Infected women do not differ in ART compared to women uninfected by T. gondii. / Introdução: O parasito Toxoplasma gondii infecta elevado percentual de indivíduos em todo o mundo e os distúrbios resultantes da infecção contribuem para os agravos da saúde e podem acometer o desenvolvimento intelectual de crianças e adultos. Tem sido proposto que o antígeno D (Rh0), uma glicoproteína que constitui a base bioquímica sistema Rh mas que se encontra ausente no tecido nervoso, influencia a resposta motora na presença de infecção por T. gondii. Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta motora e o tempo de reação a estímulos visuais na presença e na ausência de infecção pelo parasito T.gondii em indivíduos com boa acuidade visual, Rh positivos e Rh negativos. Métodos: foram analisados 212 indivíduos voluntários, de ambos os sexos, submetidos a exame de acuidade visual e teste de medição de tempo médio de reação a estímulos visuais (TMR) com o uso de um software específico. As amostras de sangue coletadas foram utilizadas na identificação dos fenótipos eritrocitários Rh (positivo e negativo) e dos anticorpos da classe IgG, anti-T. gondii (presença ou ausência). Os tempos médios de reação foram comparados de acordo com o sexo, presença (reagentes) e ausência (não reagentes) de infecção e fenótipos eritrocitários Rh (positivo e negativo). O teste t para comparação das médias e os valores de Odds Ratio (OR) e do intervalo de confiança a 95% foram calculados com o uso do software GraphPad Instat (versão 3.06). O valor p igual ou menor que 0,05 foi considerado significante. Resultados: As diferenças entre as médias de idade de indivíduos reagentes (n=134) e não reagentes (n=78) ao T. gondii foram consideradas estatisticamente significante (54,1 ± 18,7 vs 34,4 ± 18,9; p=0,0001). O fenótipo Rh positivo (n=189) esteve presente em 89% dos indivíduos, enquanto o Rh negativo (n=23) em 11%. O TMR dos indivíduos reagentes para o T. gondii foi menor no sexo masculino (0.672 ± 0.303) que no feminino (0.819 ± 0.270) (p=0,0036). Esta mesma diferença foi observada entre os não reagentes (0.475 ± 0.140 vs 0.791 ± 0.323), respectivamente (p<0,0001). Homens infectados (0.658 ± 0.282) apresentam TMR maiores que homens não infectados (0.488 ± 0.129) por T. gondii, ambos Rh positivo (p=0,0004). Mulheres, infectadas ou não, não diferiram quanto ao TMR mesmo quando comparadas pelo fenótipo Rh (positivo ou negativo). Conclusões: Homens Rh positivos infectados por T. gondii apresentam TMR maior que homens Rh positivos não infectados. Mulheres infectadas não diferem quanto ao TMR em comparação a mulheres não infectadas por T. gondii.

INTRODUÇÃO: A determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo oferecido a gestantes RhD negativo que apresentam potencial de sensibilização e/ou Doença Hemolítica Perinatal. Atualmente, este exame é realizado de rotina em diversos países, mas não no Brasil. A Clínica Obstétrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) oferece atendimento terciário a gestantes RhD negativo, com monitorização dos títulos de anticorpos irregulares, administração da imunoglobulina anti-D e/ou terapêutica fetal, quando necessários. OBJETIVO: Avaliar a acurácia do teste semiautomatizado para determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno. METODOLOGIA: Foram coletadas prospectivamente amostras de sangue de 220 gestantes RhD negativo, com idade gestacional entre 8-28 semanas. O plasma foi obtido em no máximo 2 horas após a coleta, e uma alíquota de 1 mL foi submetida à extração de ácidos nucléicos no equipamento automatizado MagNA Pure Compact (Roche), empregando o kit Large Volume. O DNA extraído foi submetido a PCR em tempo real (Step One Plus - Applied Biosystems), usando o protocolo do grupo SAFE, que tem como alvos os éxons 5 e 7 do gene RHD. RESULTADOS: Ocorreu exclusão de 35 amostras devido a problemas pré-analíticos, aborto ou desconhecimento do fenótipo do recém-nascido. Entre as 185 amostras analisadas, 130 (70,2%) foram genotipadas como RHD+ e 55 (29,8%) RHD-. Os resultados obtidos foram comparados com a fenotipagem do cordão umbilical, e houve concordância completa (100%). Sete amostras exibiram amplificação exclusiva para o éxon 7. Essas amostras foram submetidas aos protocolos em PCR convencional, e PCR em tempo real específico para o pseudogene RHD. Ambos os ensaios apresentaram os mesmos resultados: cinco positivos e dois negativos. Nesses mesmos 7 casos, após extração da camada de leucócitos materna, os protocolos foram repetidos, e o resultado confirmou que cinco mães eram RHD. As duas amostras com resultado negativo foram submetidas ao protocolo Multiplex, envolvendo os éxons 3-9 do gene RHD, com resultados negativos, confirmando que as mães são verdadeiramente RHD- portanto o sinal do éxon 7 é provindo dos fetos que são D variantes. CONCLUSÃO: O método para a determinação do RHD fetal no plasma materno descrito demonstrou ser rápido, de fácil execução, alta precisão e reprodutível, além de indicar possíveis variantes RHD em nossa população / BACKGROUND: Fetal RHD genotype determination in maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test performed in RhD negative pregnant women at risk of alloimmunization and/or Hemolytic Disease of Fetus and Newborn. Currently, this test is routinely performed in many countries but not in Brazil. The Department of Obstetrics at Hospital das Clínicas, São Paulo University Medical School provides tertiary antenatal care for RhD negative pregnant women including anti-D immunoglobulin administration, antibody levels monitoring and intrauterine treatment if necessary. AIMS: To validate the accuracy of a semi-automated test for fetal RHD genotype determination in maternal plasma. METHODS: Two-hundred and twenty blood samples were prospectively collected between 8 and 28 weeks of gestational age. Plasma processing was performed within 2 hours after blood collection, and nucleic acids were extracted from 1mL aliquots with an automated extraction platform (MagNA Pure Compact Roche) and the Large Volume kit. RHD gene exons 5 and 7 were amplified with real-time PCR (Step One Plus - Applied Biosystems) using the SAFE group protocol. RESULTS: Thirty-five samples were excluded due to pre-analytical problems, miscarriage and missing follow-up. In the remaining 185 samples, 130 (70.2%) were genotyped as RhD+ and 55 (29.8%) RhD-. Comparison with umbilical cord blood group phenotype showed 100% concordance. Seven samples showed amplification for exon 7 only. These were further investigated with conventional and real-time PCR with an specific protocol for RHD? pseudogene: 5 were positive and 2, negative. In these 7 cases, maternal buffy-coat DNA analysis also confirmed that 5 women were RHD?. In the remaining 2 cases, a multiplex protocol directed at RHD gene exons 3-9 confirmed that both mothers were truly RhD negative so exon 7 signal comes from the fetuses, further found to harbor D variants. CONCLUSION: The present study demonstrates that fetal RHD determination in maternal plasma is a fast, easy-to-perform and reproducible technique with high accuracy in our population. Moreover, it helps in the identification of possible RHD variants in our population

INTRODUÇÃO: A determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo oferecido a gestantes RhD negativo que apresentam potencial de sensibilização e/ou Doença Hemolítica Perinatal. Atualmente, este exame é realizado de rotina em diversos países, mas não no Brasil. A Clínica Obstétrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) oferece atendimento terciário a gestantes RhD negativo, com monitorização dos títulos de anticorpos irregulares, administração da imunoglobulina anti-D e/ou terapêutica fetal, quando necessários. OBJETIVO: Avaliar a acurácia do teste semiautomatizado para determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno. METODOLOGIA: Foram coletadas prospectivamente amostras de sangue de 220 gestantes RhD negativo, com idade gestacional entre 8-28 semanas. O plasma foi obtido em no máximo 2 horas após a coleta, e uma alíquota de 1 mL foi submetida à extração de ácidos nucléicos no equipamento automatizado MagNA Pure Compact (Roche), empregando o kit Large Volume. O DNA extraído foi submetido a PCR em tempo real (Step One Plus - Applied Biosystems), usando o protocolo do grupo SAFE, que tem como alvos os éxons 5 e 7 do gene RHD. RESULTADOS: Ocorreu exclusão de 35 amostras devido a problemas pré-analíticos, aborto ou desconhecimento do fenótipo do recém-nascido. Entre as 185 amostras analisadas, 130 (70,2%) foram genotipadas como RHD+ e 55 (29,8%) RHD-. Os resultados obtidos foram comparados com a fenotipagem do cordão umbilical, e houve concordância completa (100%). Sete amostras exibiram amplificação exclusiva para o éxon 7. Essas amostras foram submetidas aos protocolos em PCR convencional, e PCR em tempo real específico para o pseudogene RHD. Ambos os ensaios apresentaram os mesmos resultados: cinco positivos e dois negativos. Nesses mesmos 7 casos, após extração da camada de leucócitos materna, os protocolos foram repetidos, e o resultado confirmou que cinco mães eram RHD. As duas amostras com resultado negativo foram submetidas ao protocolo Multiplex, envolvendo os éxons 3-9 do gene RHD, com resultados negativos, confirmando que as mães são verdadeiramente RHD- portanto o sinal do éxon 7 é provindo dos fetos que são D variantes. CONCLUSÃO: O método para a determinação do RHD fetal no plasma materno descrito demonstrou ser rápido, de fácil execução, alta precisão e reprodutível, além de indicar possíveis variantes RHD em nossa população / BACKGROUND: Fetal RHD genotype determination in maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test performed in RhD negative pregnant women at risk of alloimmunization and/or Hemolytic Disease of Fetus and Newborn. Currently, this test is routinely performed in many countries but not in Brazil. The Department of Obstetrics at Hospital das Clínicas, São Paulo University Medical School provides tertiary antenatal care for RhD negative pregnant women including anti-D immunoglobulin administration, antibody levels monitoring and intrauterine treatment if necessary. AIMS: To validate the accuracy of a semi-automated test for fetal RHD genotype determination in maternal plasma. METHODS: Two-hundred and twenty blood samples were prospectively collected between 8 and 28 weeks of gestational age. Plasma processing was performed within 2 hours after blood collection, and nucleic acids were extracted from 1mL aliquots with an automated extraction platform (MagNA Pure Compact Roche) and the Large Volume kit. RHD gene exons 5 and 7 were amplified with real-time PCR (Step One Plus - Applied Biosystems) using the SAFE group protocol. RESULTS: Thirty-five samples were excluded due to pre-analytical problems, miscarriage and missing follow-up. In the remaining 185 samples, 130 (70.2%) were genotyped as RhD+ and 55 (29.8%) RhD-. Comparison with umbilical cord blood group phenotype showed 100% concordance. Seven samples showed amplification for exon 7 only. These were further investigated with conventional and real-time PCR with an specific protocol for RHD? pseudogene: 5 were positive and 2, negative. In these 7 cases, maternal buffy-coat DNA analysis also confirmed that 5 women were RHD?. In the remaining 2 cases, a multiplex protocol directed at RHD gene exons 3-9 confirmed that both mothers were truly RhD negative so exon 7 signal comes from the fetuses, further found to harbor D variants. CONCLUSION: The present study demonstrates that fetal RHD determination in maternal plasma is a fast, easy-to-perform and reproducible technique with high accuracy in our population. Moreover, it helps in the identification of possible RHD variants in our population