Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2017-06-22T17:47:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016CamileWunsch.pdf: 1221188 bytes, checksum: d4f164f1168ed40c958561be1e994dc5 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2017-06-26T18:42:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016CamileWunsch.pdf: 1221188 bytes, checksum: d4f164f1168ed40c958561be1e994dc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T18:42:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016CamileWunsch.pdf: 1221188 bytes, checksum: d4f164f1168ed40c958561be1e994dc5 (MD5) Previous issue date: 2017-06 / CAPES / Introdução: A doença arterial coronariana (DAC) é a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo, sendo caracterizada como uma doença inflamatória crônica, multifatorial, cuja fisiopatologia é a aterosclerose. Considerando a alta herdabilidade da doença, vários polimorfismos genéticos vêm sendo estudados e associados com o surgimento da DAC e, entre eles, destacam-se variantes nos genes CD14, TLR4, NFKB1 e TNFα, os quais regulam a via de sinalização celular do sistema imune inato e desencadeiam o processo inflamatório na DAC. Objetivo: O objetivo principal deste estudo é verificar a possível associação de polimorfismos nos genes CD14 (rs2569190), TLR4 (rs4986790 e rs4986791), NFKB1 (rs28362491) e TNFα (rs1800629 e rs361525) com a DAC. Metodologia: A amostra foi composta por 707 indivíduos adultos submetidos ao exame de cateterismo cardíaco no Hospital Bruno Born, de Lajeado, RS. Todos os indivíduos assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido e responderam a um questionário semiestruturado. Os indivíduos foram classificados entre casos e controles, por um médico cardiologista, com base no seguinte critério: presença de estenose, com comprometimento maior do que 50%, em pelo menos uma das artérias coronárias. Foram também coletadas amostras de sangue periférico para análises bioquímicas e moleculares. A extração de DNA foi realizada pelo método de salting out. Os polimorfismos dos genes CD14, TLR4 e TNFα foram genotipados pelo sistema de discriminação alélica TaqMan, em equipamento de reação em cadeia da polimerase (PCR) em Tempo Real (StepOnePlus®). O polimorfismo rs28362491, no gene NFKB1, foi amplificado através da técnica convencional de PCR. Resultados: Identificamos uma associação dos polimorfismos rs2569190, localizado no gene CD14, e rs28362491, no gene NFKB1, com a DAC. Além disso, foram detectados efeitos dos polimorfismos dos genes TLR4 e TNFα nos níveis glicêmicos e dos polimorfismos nos genes TLR4, NFKB1 e TNFα no perfil lipídico. Conclusão: Nossos achados sugerem a participação de polimorfismos nos genes CD14 e NFKB1 no desenvolvimento da DAC na nossa amostra, corroborando evidências prévias do envolvimento de genes do processo inflamatório nessa patologia. / Introduction: Coronary artery disease (CAD) is the main cause of morbidity and mortality in the world, being characterized as a chronic, multifactorial inflammatory disease, whose pathophysiology is atherosclerosis. Considering the high heritability of the disease, several genetic polymorphisms have been investigated and associated with CAD and, among them, there are variants in the CD14, TLR4, NFKB1 and TNFα genes, which regulate cell signaling pathways of the innate immune system and inflammatory process in CAD. Objective: The main objective of this study is to verify the association beteween polymorphisms in the CD14 (rs2569190), TLR4 (rs4986790 and rs4986791), NFKB1 (rs28362491) and TNFα (rs1800629 and rs361525) genes and CAD. Methods: The sample group was composed of 707 adult individuals, recruited at the time when they were bought in for coronary angiography procedures at the Hemodynamic Center of the Hospital Bruno Born, City of Lajeado, Rio Grande do Sul. The individuals were classified between cases and controls by a cardiologist, based on the following criteria: presence of stenosis, greater than 50% of the luminal diameter, in at least one of the coronary arteries. Peripheral blood samples were also collected for biochemical and molecular analyzes. DNA extraction was performed using the salting out method. The polymorphisms in the CD14, TLR4 e TNFα genes were genotyped by Taqman® allelic discrimination assays. The rs28362491 polymorphism in the NFKB1 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Results: We identified an association between the polymorphisms rs2569190, located in the CD14 gene, and rs28362491, located in the NFKB1 gene, and CAD. In addition, there were detected significant effects of TLR4 and TNFα gene polymorphisms on glycemic levels and TLR4, NFKB1 and TNFα gene polymorphisms on the lipid profile. Conclusion: Our findings suggest a role for the polymorphisms in CD14 and NFKB1 genes in CAD susceptibility in our sample, corroborating previous evidence of the envolviment of inflamotory process genes in this patology.

Em artrópodes o sistema imune inato contribui para a adaptação de animais como os escorpiões à diferentes ambientes. Esse sistema é composto por mecanismos capazes de agir contra injúrias e a ação de microrganismos e entre esses mecanismos estão os peptídeos antimicrobianos (PAMs). O objetivo deste trabalho foi identificar PAMs presentes na hemolinfa de Tityus serrulatus. Para isso sua hemolinfa foi extraída e separados os hemócitos e plasma, em seguida fracionamos em 3 concentrações de acetonitrila em TFA 0,05% (05, 40 e 80%). Estas frações foram submetidas a uma cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e os picos foram avaliados quanto a sua ação antimicrobiana e hemolítica. Foram identificadas 16 frações que apresentam atividade antimicrobiana. Uma das frações com atividade antimicrobiana, presente nos hemócitos apresentou similaridade com defensina descrita em carrapatos da espécie Ixodes scapularis. Essa fração possui aproximadamente 3486 Da, não apresenta atividade hemolítica e foi denominada como Serrulina. / In arthropods, its innate immune system contributes to the adaptation of animals like scorpions to different environments. This system consists of mechanisms that act avoiding injuries and against the action of microorganisms, among these mechanisms are antimicrobial peptides (AMPs). The aim of this study was to identify AMPs, present in the hemolymph of Tityus serrulatus. The hemolymph was extracted and then we separated hemocyte and plasma. The samples were fractionated in different concentrations of acetonitrile in TFA 0.05% (05, 40 and 80%). These fractions were subjected to high-performance liquid chromatography (HPLC) and the peaks obtained were evaluated for its antimicrobial and hemolytic action. We found sixteen fractions with antimicrobial activity. One of the fractions with antimicrobial activity, present in hemocytes, is similar with a defensin described in ticks, Ixodes scapularis. This fraction has about 3486 Da, has no hemolytic activity and was named as Serrulina.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-06T20:47:13Z No. of bitstreams: 1 alexandrebittencourtpigozzo.pdf: 10260507 bytes, checksum: e1b21df57fb29b16558f5193cb852049 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-06T20:48:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alexandrebittencourtpigozzo.pdf: 10260507 bytes, checksum: e1b21df57fb29b16558f5193cb852049 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-06T20:48:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alexandrebittencourtpigozzo.pdf: 10260507 bytes, checksum: e1b21df57fb29b16558f5193cb852049 (MD5) Previous issue date: 2015-05-29 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Em algumas infecções bacterianas, o sistema imunológico não é capaz de eliminar completamente o patógeno invasor. Nesses casos, o patógeno invasor é bem-sucedido em estabelecer um ambiente favorável para a sobrevivência e persistência no organismo hospedeiro. Os patógenos empregam diversas estratégias para sobreviver no hospedeiro. Dentre elas, destacam-se: o vírus da imunodeficiência humana infecta células T CD4+ que são muito importantes na resposta imune adaptativa, provocando dessa forma uma supressão dessa resposta; a bactéria Mycobacterium tuberculosis persiste no hospedeiro infectando intracelularmente macrófagos; a bactéria Staphylococcus aureus persiste no hospedeiro através da produção de uma rede de fibrina que atua como uma barreira protetora contra o sistema imune inato. No caso do Staphylococcus aureus e de outras espécies de bactéria, a formação da rede de fibrina junto com outros mecanismos, como a secreção de toxinas, dão origem a uma lesão conhecida como abscesso. Um abscesso é caracterizado como uma área composta de bactérias, células do sistema imune (principalmente neutrófilos) e muitos tipos de células mortas. A formação do abscesso pode ser vista como resultado de uma série de estratégias utilizadas pelas bactérias para escapar da resposta imune e estabelecer um ambiente favorável para persistir no hospedeiro. Este trabalho tem como objetivo reproduzir algumas características do processo de formação de abscessos através de simulações computacionais. As simulações computacionais têm como base modelos matemáticos de equações diferenciais parciais. Os modelos matemáticos apresentados neste trabalho foram desenvolvidos adotando-se uma abordagem incremental. Nessa abordagem inicia-se o processo de modelagem desenvolvendo-se um modelo simplificado que é capaz de reproduzir algum comportamento do fenômeno de interesse e, depois, esse modelo é estendido acrescentando-se outras variáveis e processos de interesse. As hipóteses, as variáveis, as relações entre as variáveis e os processos presentes nos modelos matemáticos deste trabalho foram construídos com base em um estudo aprofundado que foi realizado sobre a fisiopatologia do abscesso, envolvendo um contato com especialistas da área experimental (microbiologistas, imunologistas e médicos), uma leitura extensiva da literatura, além de análises de dados experimentais. Os modelos desenvolvidos foram capazes de reproduzir algumas características observadas experimentalmente como, por exemplo, a formação de uma colônia de bactérias na região central do abscesso, cercada por uma rede de fibrina. Ao redor da rede de fibrina, foi observado um acúmulo de neutrófilos mortos e neutrófilos vivos assim como nos dados experimentais. Os modelos também foram capazes de reproduzir algumas características observadas no experimento in vivo de depleção da resposta imune como, por exemplo, um aumento no número de abscessos, com alguns abscessos contendo elevadas concentrações de bactéria e fibrina. / In some bacterial infections, the immune system is not capable of completely eliminating the invading pathogen. In these cases, the invading pathogen is successful in establishing a favorable enviroment to survive and persist in the host organism. The pathogens employ different strategies to survive in the host. Among these strategies, we can highlight: human immunodeficiency virus infects T CD4+ cells that are very important in the adaptive immune response, causing a suppression of this response; bacteria Mycobacterium tuberculosis persist in the host organism through the intracellular infection of macrophages; bacteria Staphylococcus aureus persist in the host through the production of a fibrin network that acts as a protecting barrier against the innate immune response. In the case of Staphylococcus aureus and other bacteria species, the formation of a fibrin network together with other mechanisms as, for instance, the secretion of toxins give rise to a lesion known as abscess. An abscess is characterized as an area comprising bacteria, cells of the immune system (mainly neutrophils) and many types of dead cells. The abscess formation can be seen as the result of a series of strategies employed by bacteria to escape the immune response and to establish a favorable enviroment to persist in the host. This work has the objective of reproducing some characteristics of the process of abscess formation through computational simulations. The computational simulations are based in mathematical models of partial differential equations. The mathematical models presented in this work were developed through an incremental approach. In this approach the modeling process is initiated with the development of a simplified model that is capable of reproducing some behavior of the phenomena of interest and then this model can be extended through the addition of other variables and processes. The hypotheses, the variables, the relation between variables and the processes considered in the mathematical models of this work were constructed based on a study that was conducted about fisiopathology of the abscess, envolving contact with experts of the experimental area (microbiologists, imunologists and medical doctors), reading of the literature and analysis of experimental data. The models developed in this work were capable of reproducing some characteristics observed experimentaly as, for example, the formation of a bacteria colony in the central region of the abscess, surrounded by a fibrin network. Surrounding the fibrin network, it was observed an accumulation of dead neutrophils and healthy neutrophils as in the experimental data. These models were also capable of reproducing some characteristics observed in the in vivo experiment of immune response depletion as, for example, an increase in the number of abscesses, with some abscesses containing high concentrations of bacteria and fibrin.

Em artrópodes o sistema imune inato contribui para a adaptação de animais como os escorpiões à diferentes ambientes. Esse sistema é composto por mecanismos capazes de agir contra injúrias e a ação de microrganismos e entre esses mecanismos estão os peptídeos antimicrobianos (PAMs). O objetivo deste trabalho foi identificar PAMs presentes na hemolinfa de Tityus serrulatus. Para isso sua hemolinfa foi extraída e separados os hemócitos e plasma, em seguida fracionamos em 3 concentrações de acetonitrila em TFA 0,05% (05, 40 e 80%). Estas frações foram submetidas a uma cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e os picos foram avaliados quanto a sua ação antimicrobiana e hemolítica. Foram identificadas 16 frações que apresentam atividade antimicrobiana. Uma das frações com atividade antimicrobiana, presente nos hemócitos apresentou similaridade com defensina descrita em carrapatos da espécie Ixodes scapularis. Essa fração possui aproximadamente 3486 Da, não apresenta atividade hemolítica e foi denominada como Serrulina. / In arthropods, its innate immune system contributes to the adaptation of animals like scorpions to different environments. This system consists of mechanisms that act avoiding injuries and against the action of microorganisms, among these mechanisms are antimicrobial peptides (AMPs). The aim of this study was to identify AMPs, present in the hemolymph of Tityus serrulatus. The hemolymph was extracted and then we separated hemocyte and plasma. The samples were fractionated in different concentrations of acetonitrile in TFA 0.05% (05, 40 and 80%). These fractions were subjected to high-performance liquid chromatography (HPLC) and the peaks obtained were evaluated for its antimicrobial and hemolytic action. We found sixteen fractions with antimicrobial activity. One of the fractions with antimicrobial activity, present in hemocytes, is similar with a defensin described in ticks, Ixodes scapularis. This fraction has about 3486 Da, has no hemolytic activity and was named as Serrulina.

Flagelinas de bactérias gram-negativas ativam o sistema imune inato resultando em efeitos adjuvantes para antígenos co-administrados. No entanto, não existem relatos sobre as propriedades adjuvantes de flagelinas de bactérias gram-positivas. O objetivo do projeto foi estudar os efeitos imunomoduladores da flagelina Hag de B. subtílis. Inicialmente foi purificada a Hag e subseqüentemente avaliada sua propriedade imunológica quando administrada junto com a ovalmbumina (OVA) pelas vias intra-nasal (i.n.) ou subcutânea (s.c.) em camundongos Balb/C e C57BL/6. Os resultados demonstraram as propriedades imunomoduladoras da Hag nas duas linhagens em relação à indução de anticorpos antígeno-específicos. Não foi possível demonstrar a ativação de linfócitos TCD4+ e CD8+ antígenos-específicos em animais Balb/C imunizados com OVA e Hag tanto pela via s.c. como pela i.n.. Resultados mais promissores do efeito adjuvante frente a células T foram encontrados em animais C57BL/6. Os resultados abrem perspectivas para o estudo do potencial da flagelina Hag de B. subtilis como adjuvante vacinal. / Flagellin of gram negatives bacteria actives the innate immune system resulting in adjuvants effects against coadministrated antigens. However, there is not information about immunological properties of flagellins produced by gram positive bacteria. This study aimed the evaluation of immunomodulator effects of Hag flagellin from B. subtilis. Vaccine formulations based in purified Hag and Ovalbumine protein (OVA) were administrated intranasal (i.n.) and subcutaneously (s.c.) in Balb/C and C57BL/6 mice and then the population of B and T lymphocytes were monitored for production of antibodies and citocines and/or surface markers expression. Results showed the immunomodulatory properties of Hag in both mice lineages regarding the induction of antigen specific antibodies when immunized with OVA and Hag by i.n. and s.c. via. Most promising results concerning the adjuvant effects observed on T cells activation were found in C57BL/6 mice. The results obtained open future perspectives for the study of the potential use of B. subtilis Hag flagellin as adjuvant in vaccines.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In aquaculture, eugenol have been used and recommended as anesthetics for several fish species. Moreover, this product has attracted the attention of researchers because of its chemopreventive, anti-inflammatory and antioxidant properties, as well as, its antimicrobial potential. The aim of this study was to evaluate the activity of eugenol against the fish pathogen Aeromonas hydrophila and eugenol s effect on hematological and natural immune parameters in silver catfish (Rhamdia quelen). In vitro, eugenol showed weak activity against A. hydrophila, but in vivo, at a subinhibitory concentration (10 mg L-1), it promoted survival in infected silver catfish. Eugenol (50 μg mL-1) reduced the hemolytic activity of A. hydrophila supernatant in vitro in fish erythrocytes. Subjecting catfish to eugenol baths (5 and 10 mg L-1) for five days did not alter the hematological and immunological parameters studied in this work. Based on these results, eugenol can be used to treat or prevent bacterial diseases in fish. / Na aquicultura o eugenol tem sido utilizado e recomendado como anestésico para várias espécies de peixes. Além disso, este produto tem atraído a atenção de pesquisadores devido a suas propriedades quimiopreventivas, antiinflamatórias e antioxidantes, bem como, o seu potencial antimicrobiano. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade do eugenol contra o patógeno de peixes Aeromonas hydrophila e seu efeito sobre parâmetros hematológicos e de imunidade natural em jundiás (Rhamdia quelen). O eugenol mostrou fraca atividade contra A. hydrophila in vitro, mas in vivo, a uma concentração subinibitória (10 mg/L) promoveu a sobrevivência de jundiás infectados. In vitro o eugenol (50 μg/mL) reduziu a atividade hemolítica do sobrenadante de A. hydrophila em eritrócitos de peixe. A exposição de jundiás ao eugenol (5 e 10 mg/L) através de banhos durante cinco dias não alterou os parâmetros hematológicos e imunológicos estudados neste trabalho. Com base nestes resultados, o eugenol pode ser usado para tratar ou prevenir infecções bacterianas em peixes.

Flagelinas de bactérias gram-negativas ativam o sistema imune inato resultando em efeitos adjuvantes para antígenos co-administrados. No entanto, não existem relatos sobre as propriedades adjuvantes de flagelinas de bactérias gram-positivas. O objetivo do projeto foi estudar os efeitos imunomoduladores da flagelina Hag de B. subtílis. Inicialmente foi purificada a Hag e subseqüentemente avaliada sua propriedade imunológica quando administrada junto com a ovalmbumina (OVA) pelas vias intra-nasal (i.n.) ou subcutânea (s.c.) em camundongos Balb/C e C57BL/6. Os resultados demonstraram as propriedades imunomoduladoras da Hag nas duas linhagens em relação à indução de anticorpos antígeno-específicos. Não foi possível demonstrar a ativação de linfócitos TCD4+ e CD8+ antígenos-específicos em animais Balb/C imunizados com OVA e Hag tanto pela via s.c. como pela i.n.. Resultados mais promissores do efeito adjuvante frente a células T foram encontrados em animais C57BL/6. Os resultados abrem perspectivas para o estudo do potencial da flagelina Hag de B. subtilis como adjuvante vacinal. / Flagellin of gram negatives bacteria actives the innate immune system resulting in adjuvants effects against coadministrated antigens. However, there is not information about immunological properties of flagellins produced by gram positive bacteria. This study aimed the evaluation of immunomodulator effects of Hag flagellin from B. subtilis. Vaccine formulations based in purified Hag and Ovalbumine protein (OVA) were administrated intranasal (i.n.) and subcutaneously (s.c.) in Balb/C and C57BL/6 mice and then the population of B and T lymphocytes were monitored for production of antibodies and citocines and/or surface markers expression. Results showed the immunomodulatory properties of Hag in both mice lineages regarding the induction of antigen specific antibodies when immunized with OVA and Hag by i.n. and s.c. via. Most promising results concerning the adjuvant effects observed on T cells activation were found in C57BL/6 mice. The results obtained open future perspectives for the study of the potential use of B. subtilis Hag flagellin as adjuvant in vaccines.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-02T17:47:54Z No. of bitstreams: 1 pedroaugustoferreirarocha.pdf: 4715587 bytes, checksum: dfef00badf9cc3d7c79c1b4c62d3abfd (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-06T19:58:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pedroaugustoferreirarocha.pdf: 4715587 bytes, checksum: dfef00badf9cc3d7c79c1b4c62d3abfd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-06T19:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pedroaugustoferreirarocha.pdf: 4715587 bytes, checksum: dfef00badf9cc3d7c79c1b4c62d3abfd (MD5) Previous issue date: 2012-08-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dois mecanismos são utilizados pelo Sistema Imunológico Humano (SIH) para defender o organismo contra doenças causadas pelos mais distintos agentes patogênicos: o sistema inato e o sistema adaptativo. O primeiro é composto por células e substâncias químicas que utilizam um mecanismo genérico de defesa para prevenir ou limitar infecções ocasionadas pela maioria dos patógenos. Já o segundo mecanismo é ativado pelo primeiro, baseando-se na habilidade de reconhecer e de recordar agentes patogênicos específicos, colaborando para a montagem de um ataque mais potente a cada vez que o mesmo patógeno é encontrado. Apesar de ser muito estudado, muitas questões sobre o funcionamento do SIH ainda estão em aberto em virtude de sua complexidade e do grande número de interações, nos mais diversos níveis, entre seus distintos componentes. Neste sentido, ferramentas computacionais podem se constituir em um poderoso ferramental para auxiliar nas pesquisas sobre o tema. O presente trabalho está inserido neste escopo, dividindo-se em duas partes. Na primeira parte, o trabalho apresenta os resultados de uma análise de sensibilidade em um modelo matemático-computacional que simula a resposta imunológica inata ao lipopolissacarídeo (LPS), com o objetivo de encontrar os parâmetros mais sensíveis deste modelo. Além disto, a segunda parte do trabalho propõe uma adaptação do modelo original para um modelo tridimensional. As simulações realizadas nas duas partes do trabalho mostraram-se computacionalmente caras, demandando longos períodos de tempo para serem concluídas. Assim, GPGPUs (General Purpose Graphics Processing Units) foram utilizadas para reduzir os tempos de execução. O uso de GPGPUs permitiu que acelerações de 276 vezes para a análise de sensibilidade massiva e de 87 vezes para a computação do modelo em três dimensões fossem obtidas. / Two mechanisms are used by the Humman Immune System (HIS) to protect the body against diseases caused by distinct pathogens: the innate and the adaptive immune system. The first one is composed of cells and chemicals that use a generic mechanism of defense to prevent or limit infections caused by most pathogens. The second mechanism is activated by the first one. It has the ability to recognize and remember specific pathogens, contributing to the assembly of a more powerful attack each time the same pathogen is encountered again. Despite being widely studied, many questions about the functioning of the HIS are still open because of its complexity and the large number of interactions of its components on distinct levels. In this sense, computational tools are a powerful instrument to assist researchers on this field of study. This work is inserted in this scope and it is split into two parts. In the first part, this work presents the results of a sensitivity analysis on a mathematical-computational model that simulates the innate immune response to lipopolysaccharide (LPS). The main objective of the sensitivity analysis was to find the most sensitive parameters of the mathematical model. The second part of this work proposes the extension of the original model to a three-dimensional one. The simulations in the two parts of the work proved to be computationally expensive, requiring long periods of time to complete. Thus, GPGPUs (General Purpose Graphics Processing Units) were used to reduce execution times. The use of GPGPUs allowed speedups of 276 times for sensitivity analysis, when compared to the sequential one, and of 87 times for computations using the three dimensions model.