A epilepsia é um dos mais freqüentes distúrbios do sistema nervoso central e se caracteriza por uma atividade neuronal encefálica hipersincrônica, paroxística e anormal. A dieta cetogênica (KD), uma dieta rica em lipídeos e pobre em carboidratos, tem sido usada como alternativa terapêutica para crises convulsivas de difícil controle, principalmente em crianças. Mas apesar do sucesso clínico do tratamento com KD, seu mecanismo de ação ainda é incerto. O neuromodulador adenosina tem sido relatado como um anticonvulsivante endógeno devido à sua interação com os receptores adenosinérgicos do tipo A1. O neurotransmissor ATP é liberado para o meio extracelular e influencia a atividade sináptica através de sua interação com os receptores do tipo P2. Sua ação é terminada através de uma casacata de enzimas chamadas ectonucleotidases, que incluem as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) e a ecto-5’-nucleotidase. Essas enzimas hidrolisam o ATP extracelular, produzindo o neuromodulador adenosina. Estudos prévios realizados em nosso laboratório mostraram que as atividades nucleotidásicas estão aumentadas em cérebro (hipocampo e córtex cerebral) e soro sangüíneo de ratos submetidos a diferentes modelos de epilepsia. Devido às ações protetoras da KD na epilepsia não estarem claramente identificadas e as nucleotidases estarem associadas a mudanças plásticas induzidas pelo status epilepticus (SE), tem sido importante estudarmos a correlação entre estes dois parâmetros. Os resultados apresentados neste trabalho nos permitem observar, de uma forma geral, que as ectonucleotidases apresentam suas atividades diferentemente alteradas na epilepsia. Em sinaptossoma hipocampal, a indução do SE pelo modelo do lítio-pilocarpina, mas não a KD, promoveu uma diminuição da hidrólise do ATP e um aumento da hidrólise do ADP. Já no soro, a indução do SE por este modelo causou um aumento da hidrólise do ATP e uma diminuição da hidrólise do ADP. Além disso, a KD provocou um aumento da hidrólise de ATP, ADP e AMP, bem como da atividade das enzimas FAL, ALT e AST, levando-nos a propor que a terapia crônica com esta dieta pode levar a danos hepáticos. / Epilepsy is one of the most frequent disorders of the central nervous system and it is characterized by abnormal hypersynchronic neuronal activity. The ketogenic diet (KD), a high-fat and low-carbohydrate diet, has been used as therapeutic alternative to seizures refractory, especially in children. Despite the clinical successes of the KD treatment, the mechanism of action is still unknown. The neuromodulador adenosine has been reported as an endogenous anticonvulsant through activation of adenosine A1 receptors. The neurotransmitter ATP is released to extracellular space and participates of synaptic activity by activation of P2 purinoreceptors. Its action is terminated by enzyme chain named ectonucleotidases, which include NTPDase family (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) and ecto-5’-nucleotidase. These enzymes hydrolyze extracellular ATP to neuromodulator adenosine. Previous studies have shown that nucleotidase activities are increased in brain (hippocampus and cerebral cortex) and blood serum of rats submitted to different animals models of epilepsy. Owing protective actions from KD in epilepsy not been totally clear and nucleotidases were be associated to plasticity induced for status epilepticus (SE), has been important to study the correlation between these two parameters. The results presented in this work leave us to observe that ectonucleotidases presented the activities differently altered in epilepsy. In hippocampus synaptosome, the lithium-pilocarpine-induced SE, but not the KD, promote a decreased in ATP hydrolyze and an increased in ADP hydrolyze. Already in blood serum, the lithium-pilocarpine-induced SE caused an increased ATP hydrolyzes and a decreased ADP hydrolyzes. Moreover, the KD promoted a increased of ATP, ADP and AMP hydrolysis, as well as ALP, AST and ALT activities, suggest that the chronic therapy with the KD can promote a hepatic damages.

O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.

O estudo do sistema opióide no neonato tem sido freqüentemente pesquisado. Os neonatos rotineiramente experimentam dor aguda e crônica causada por procedimentos invasivos em UTI pediátrica e freqüentemente não recebem analgesia adequada. Entretanto, o uso da analgesia opióide vem aumentando nas últimas décadas em consequência das mudanças e avanços na compreensão, na identificação e no tratamento da dor em crianças. Entretanto, ainda existe uma carência em estudos de seus efeitos específicos sobre uma administração em longo prazo nestes pacientes. Adicionalmente, alguns estudos têm demonstrado que a exposição às drogas logo após o nascimento pode ter implicações duradouras no sistema nervoso, e que a exposição à morfina pode influenciar no desenvolvimento e na função de alguns sistemas do neurotransmissores. Existem múltiplos sistemas espinhais que modulam a neurotransmissão nociceptiva no corno dorsal. Propõe-se que a adenosina extracelular esteja envolvida no controle fisiológico da dor a nível espinal e na ação antinociceptiva opióide. Por outro lado, o ATP é um neurotransmissor liberado dos terminais nervosos sensoriais aferentes para atuar na circuitaria central da dor. Os nucleotídeos extracelulares podem ser hidrolisados por E-NTPDase e por 5’nucleotidase. Esta cascata enzimática apresenta dupla função: remover o sinal do ATP e gerar um segundo, adenosina. Esta dissertação teve como objetivos: investigar o efeito da administração repetida da morfina de P8 até P14 nas respostas nociceptiva, inflamatória, comportamental e na atividade das ectonucleotidases em medula espinhal e córtex de ratos em P16, P30 e P60. Além disso, avaliar o efeito de uma segunda exposição repetida de morfina por 7 dias em P80 na resposta nociceptiva, inflamatória e comportamental. Os animais que receberam a morfina por sete dias em P14 não desenvolveram tolerância, porém, quando avaliados em P80, demonstraram maior analgesia da morfina (administração aguda), e após 7 dias de administração diária de morfina (P86), desenvolveram o clássico fenômeno da tolerância. No teste da formalina, observou-se aumento na resposta nociceptiva em P30 e em P60, mas não em P16. No desempenho no campo aberto os animais apresentaram alteração de alguns comportamentos, tais como aumento de grooming em P16, e aumento de rearing e locomoção em P30. Em P88, o grupo que recebeu a morfina diariamente (de P80 até P86) apresentou aumento de rearing. Nas atividades das E-NTPDases, observou-se em P16 um aumento na atividade de hidrólise do ATP em sinaptossomas de córtex cerebral, e uma diminuição na atividade de hidrólise do ADP em sinaptossomas de medula espinhal. Nas demais idades avaliadas (P30 e P60) não formas observadas diferenças nas atividades de hidrólises dos núcleotídeos de ambas as estruturas analisadas. O limiar nociceptivo mais elevado observado no teste da formalina pode ser devido a neuroplasticidade na circuitaria nociceptiva, tais como em neurotransmissores excitatórios em nível espinhal. As alterações comportamentais observadas sugerem que a exposição à morfina, logo após o nascimento, pode desencadear, a curto e longo prazo, fenômenos tais como sensibilização comportamental. Em conclusão, estes resultados indicam que a exposição à morfina durante a segunda semana de vida pode promover aumento na resposta nociceptiva e alterações comportamentais que perderam ao longo da vida. Os efeitos observados após exposição repetida à morfina em animais podem colaborar com o entendimento de conseqüências clínicas decorrentes da administração em longo prazo de opióides. Adicionalmente, estes resultados sugerem a necessidade do desenvolvimento de pesquisas que abordem diferentes sistemas de neurotransmissores objetivando neutralizar tais adaptações comportamentais induzidas pela morfina. Os resultados nas atividades de E-NTPDases destacam a importância do sistema purinérgico de ratos infantes submetidos à exposição repetida da morfina. Essas alterações enzimáticas podem constituir um dos mecanismos responsáveis pelos efeitos secundários da retirada opióide. / The study of the opioid system in the newborn has been frequently researched. The newborns routinely experiencing acute and chronic pain caused by invasive procedures in pediatric ICU and often do not receive adequate analgesia. However, the use of opioid analgesia has been increasing in recent decades as a consequence of changes and advances in the understanding, in the identification, and treatment of pain in children. However, there is still a lack of knowledge on their specific effects in a long-term administration for this population of patients. Additionally, some studies have shown that exposure to drugs soon after birth may have lasting implications in the nervous system, and that exposure to morphine can influence the development and function of some systems of neurotransmitters. There are multiple systems that modulate the spinal nociceptive neurotransmission in the dorsal horn. It has been proposed that the extracellular adenosine is involved in the physiological control of pain in spinal and action antinociceptiva opioid. Moreover, the ATP is a neurotransmitter released from sensory afferent nerve terminals to act in the central circuitaria of pain. The extracellular nucleotides can be hydrolysates by E-NTPDase and by 5’nucleotidase. This enzyme cascade presents dual function: remove the signal from the ATP and generating a second, adenosine. This dissertation had the following objectives: to investigate the effect of repeated administration of morphine from P8 to P14 in nociceptive responses, inflammatory, and behavioral activity ectonucleotidases in the cortex and spinal cord of rats in P16, P30, P60. Moreover, to evaluate the effect of one second repeated morphine exposition per 7 days in P80 in the nociceptive, inflammatory and behaviour response. Animals that received the morphine for seven days in P14 did not develop tolerance, but when evaluated in P80, showed greater the morphine analgesia (acute administration), and after 7 days of daily administration of morphine (P86), developed the classic phenomenon of tolerance. In the formalin test, it was observed increase in response to nociceptive P30 and P60 but not on P16. In performing in the open field the animals showed some change in behavior, such as increased grooming in P16, and increase of rearing and locomotion in P30. At P88, the group that received the morphine daily (from P80 to P86) showed increase of rearing. On the ENTPDases activities were observed at P16 increase in the activity of hydrolysis of ATP in sinaptossomas of cerebral cortex, and a decrease in the activity of ADP in the hydrolysis of sinaptossomas spinal cord. In other ages evaluated (P30 and P60) it was not observed differences on nucleotides hydrolysis activity from both structures.analyzed. The higher threshold nociception observed in the test of formalin can be due to neuroplasticidade in circuitaria nociceptive, such as neurotransmitters in excitatórios in spinal level. The behavioural changes suggest that exposure to morphine, soon after birth, can trigger in the short and long term, phenomena such as behavioral sensitization. In conclusion, these results indicate that exposure to morphine during the second week of life may promote increase in response nociceptive and behavioural changes that have lost their lifetime. These behavioural changes indicate the need for the evaluation of the clinical consequences of long-term opioid administration. Additionally, these results suggest the need for development of research that address different systems of neurotransmitters aiming neutralize the behavioral changes induced by opioid. AThe findings on the E-NTPDases activities highlight the importance of purinergic system of young rats submitted to the repeated morphine exposure. These alterations activities may constitute one of the mechanisms that mediate the development of some of the side effects, such as opioid withdrawal, associated with repeated morphine exposure in early life.

Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração. / Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine.

A epilepsia é um dos mais freqüentes distúrbios do sistema nervoso central e se caracteriza por uma atividade neuronal encefálica hipersincrônica, paroxística e anormal. A dieta cetogênica (KD), uma dieta rica em lipídeos e pobre em carboidratos, tem sido usada como alternativa terapêutica para crises convulsivas de difícil controle, principalmente em crianças. Mas apesar do sucesso clínico do tratamento com KD, seu mecanismo de ação ainda é incerto. O neuromodulador adenosina tem sido relatado como um anticonvulsivante endógeno devido à sua interação com os receptores adenosinérgicos do tipo A1. O neurotransmissor ATP é liberado para o meio extracelular e influencia a atividade sináptica através de sua interação com os receptores do tipo P2. Sua ação é terminada através de uma casacata de enzimas chamadas ectonucleotidases, que incluem as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) e a ecto-5’-nucleotidase. Essas enzimas hidrolisam o ATP extracelular, produzindo o neuromodulador adenosina. Estudos prévios realizados em nosso laboratório mostraram que as atividades nucleotidásicas estão aumentadas em cérebro (hipocampo e córtex cerebral) e soro sangüíneo de ratos submetidos a diferentes modelos de epilepsia. Devido às ações protetoras da KD na epilepsia não estarem claramente identificadas e as nucleotidases estarem associadas a mudanças plásticas induzidas pelo status epilepticus (SE), tem sido importante estudarmos a correlação entre estes dois parâmetros. Os resultados apresentados neste trabalho nos permitem observar, de uma forma geral, que as ectonucleotidases apresentam suas atividades diferentemente alteradas na epilepsia. Em sinaptossoma hipocampal, a indução do SE pelo modelo do lítio-pilocarpina, mas não a KD, promoveu uma diminuição da hidrólise do ATP e um aumento da hidrólise do ADP. Já no soro, a indução do SE por este modelo causou um aumento da hidrólise do ATP e uma diminuição da hidrólise do ADP. Além disso, a KD provocou um aumento da hidrólise de ATP, ADP e AMP, bem como da atividade das enzimas FAL, ALT e AST, levando-nos a propor que a terapia crônica com esta dieta pode levar a danos hepáticos. / Epilepsy is one of the most frequent disorders of the central nervous system and it is characterized by abnormal hypersynchronic neuronal activity. The ketogenic diet (KD), a high-fat and low-carbohydrate diet, has been used as therapeutic alternative to seizures refractory, especially in children. Despite the clinical successes of the KD treatment, the mechanism of action is still unknown. The neuromodulador adenosine has been reported as an endogenous anticonvulsant through activation of adenosine A1 receptors. The neurotransmitter ATP is released to extracellular space and participates of synaptic activity by activation of P2 purinoreceptors. Its action is terminated by enzyme chain named ectonucleotidases, which include NTPDase family (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) and ecto-5’-nucleotidase. These enzymes hydrolyze extracellular ATP to neuromodulator adenosine. Previous studies have shown that nucleotidase activities are increased in brain (hippocampus and cerebral cortex) and blood serum of rats submitted to different animals models of epilepsy. Owing protective actions from KD in epilepsy not been totally clear and nucleotidases were be associated to plasticity induced for status epilepticus (SE), has been important to study the correlation between these two parameters. The results presented in this work leave us to observe that ectonucleotidases presented the activities differently altered in epilepsy. In hippocampus synaptosome, the lithium-pilocarpine-induced SE, but not the KD, promote a decreased in ATP hydrolyze and an increased in ADP hydrolyze. Already in blood serum, the lithium-pilocarpine-induced SE caused an increased ATP hydrolyzes and a decreased ADP hydrolyzes. Moreover, the KD promoted a increased of ATP, ADP and AMP hydrolysis, as well as ALP, AST and ALT activities, suggest that the chronic therapy with the KD can promote a hepatic damages.

O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.

O estudo do sistema opióide no neonato tem sido freqüentemente pesquisado. Os neonatos rotineiramente experimentam dor aguda e crônica causada por procedimentos invasivos em UTI pediátrica e freqüentemente não recebem analgesia adequada. Entretanto, o uso da analgesia opióide vem aumentando nas últimas décadas em consequência das mudanças e avanços na compreensão, na identificação e no tratamento da dor em crianças. Entretanto, ainda existe uma carência em estudos de seus efeitos específicos sobre uma administração em longo prazo nestes pacientes. Adicionalmente, alguns estudos têm demonstrado que a exposição às drogas logo após o nascimento pode ter implicações duradouras no sistema nervoso, e que a exposição à morfina pode influenciar no desenvolvimento e na função de alguns sistemas do neurotransmissores. Existem múltiplos sistemas espinhais que modulam a neurotransmissão nociceptiva no corno dorsal. Propõe-se que a adenosina extracelular esteja envolvida no controle fisiológico da dor a nível espinal e na ação antinociceptiva opióide. Por outro lado, o ATP é um neurotransmissor liberado dos terminais nervosos sensoriais aferentes para atuar na circuitaria central da dor. Os nucleotídeos extracelulares podem ser hidrolisados por E-NTPDase e por 5’nucleotidase. Esta cascata enzimática apresenta dupla função: remover o sinal do ATP e gerar um segundo, adenosina. Esta dissertação teve como objetivos: investigar o efeito da administração repetida da morfina de P8 até P14 nas respostas nociceptiva, inflamatória, comportamental e na atividade das ectonucleotidases em medula espinhal e córtex de ratos em P16, P30 e P60. Além disso, avaliar o efeito de uma segunda exposição repetida de morfina por 7 dias em P80 na resposta nociceptiva, inflamatória e comportamental. Os animais que receberam a morfina por sete dias em P14 não desenvolveram tolerância, porém, quando avaliados em P80, demonstraram maior analgesia da morfina (administração aguda), e após 7 dias de administração diária de morfina (P86), desenvolveram o clássico fenômeno da tolerância. No teste da formalina, observou-se aumento na resposta nociceptiva em P30 e em P60, mas não em P16. No desempenho no campo aberto os animais apresentaram alteração de alguns comportamentos, tais como aumento de grooming em P16, e aumento de rearing e locomoção em P30. Em P88, o grupo que recebeu a morfina diariamente (de P80 até P86) apresentou aumento de rearing. Nas atividades das E-NTPDases, observou-se em P16 um aumento na atividade de hidrólise do ATP em sinaptossomas de córtex cerebral, e uma diminuição na atividade de hidrólise do ADP em sinaptossomas de medula espinhal. Nas demais idades avaliadas (P30 e P60) não formas observadas diferenças nas atividades de hidrólises dos núcleotídeos de ambas as estruturas analisadas. O limiar nociceptivo mais elevado observado no teste da formalina pode ser devido a neuroplasticidade na circuitaria nociceptiva, tais como em neurotransmissores excitatórios em nível espinhal. As alterações comportamentais observadas sugerem que a exposição à morfina, logo após o nascimento, pode desencadear, a curto e longo prazo, fenômenos tais como sensibilização comportamental. Em conclusão, estes resultados indicam que a exposição à morfina durante a segunda semana de vida pode promover aumento na resposta nociceptiva e alterações comportamentais que perderam ao longo da vida. Os efeitos observados após exposição repetida à morfina em animais podem colaborar com o entendimento de conseqüências clínicas decorrentes da administração em longo prazo de opióides. Adicionalmente, estes resultados sugerem a necessidade do desenvolvimento de pesquisas que abordem diferentes sistemas de neurotransmissores objetivando neutralizar tais adaptações comportamentais induzidas pela morfina. Os resultados nas atividades de E-NTPDases destacam a importância do sistema purinérgico de ratos infantes submetidos à exposição repetida da morfina. Essas alterações enzimáticas podem constituir um dos mecanismos responsáveis pelos efeitos secundários da retirada opióide. / The study of the opioid system in the newborn has been frequently researched. The newborns routinely experiencing acute and chronic pain caused by invasive procedures in pediatric ICU and often do not receive adequate analgesia. However, the use of opioid analgesia has been increasing in recent decades as a consequence of changes and advances in the understanding, in the identification, and treatment of pain in children. However, there is still a lack of knowledge on their specific effects in a long-term administration for this population of patients. Additionally, some studies have shown that exposure to drugs soon after birth may have lasting implications in the nervous system, and that exposure to morphine can influence the development and function of some systems of neurotransmitters. There are multiple systems that modulate the spinal nociceptive neurotransmission in the dorsal horn. It has been proposed that the extracellular adenosine is involved in the physiological control of pain in spinal and action antinociceptiva opioid. Moreover, the ATP is a neurotransmitter released from sensory afferent nerve terminals to act in the central circuitaria of pain. The extracellular nucleotides can be hydrolysates by E-NTPDase and by 5’nucleotidase. This enzyme cascade presents dual function: remove the signal from the ATP and generating a second, adenosine. This dissertation had the following objectives: to investigate the effect of repeated administration of morphine from P8 to P14 in nociceptive responses, inflammatory, and behavioral activity ectonucleotidases in the cortex and spinal cord of rats in P16, P30, P60. Moreover, to evaluate the effect of one second repeated morphine exposition per 7 days in P80 in the nociceptive, inflammatory and behaviour response. Animals that received the morphine for seven days in P14 did not develop tolerance, but when evaluated in P80, showed greater the morphine analgesia (acute administration), and after 7 days of daily administration of morphine (P86), developed the classic phenomenon of tolerance. In the formalin test, it was observed increase in response to nociceptive P30 and P60 but not on P16. In performing in the open field the animals showed some change in behavior, such as increased grooming in P16, and increase of rearing and locomotion in P30. At P88, the group that received the morphine daily (from P80 to P86) showed increase of rearing. On the ENTPDases activities were observed at P16 increase in the activity of hydrolysis of ATP in sinaptossomas of cerebral cortex, and a decrease in the activity of ADP in the hydrolysis of sinaptossomas spinal cord. In other ages evaluated (P30 and P60) it was not observed differences on nucleotides hydrolysis activity from both structures.analyzed. The higher threshold nociception observed in the test of formalin can be due to neuroplasticidade in circuitaria nociceptive, such as neurotransmitters in excitatórios in spinal level. The behavioural changes suggest that exposure to morphine, soon after birth, can trigger in the short and long term, phenomena such as behavioral sensitization. In conclusion, these results indicate that exposure to morphine during the second week of life may promote increase in response nociceptive and behavioural changes that have lost their lifetime. These behavioural changes indicate the need for the evaluation of the clinical consequences of long-term opioid administration. Additionally, these results suggest the need for development of research that address different systems of neurotransmitters aiming neutralize the behavioral changes induced by opioid. AThe findings on the E-NTPDases activities highlight the importance of purinergic system of young rats submitted to the repeated morphine exposure. These alterations activities may constitute one of the mechanisms that mediate the development of some of the side effects, such as opioid withdrawal, associated with repeated morphine exposure in early life.

Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração. / Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine.

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose. / Platelets are cytoplasmic fragments derived from bone marrow megakaryocytes rupture, whose major role is related to the vascular integrity maintenance. The extracellular nucleotides ATP and ADP as well as adenosine have been implicated in a great number of physiological functions: ADP is the major factor recruiting platelet, whereas ATP has been considered as a competitive inhibitor of ADP-induced platelet aggregation. Adenosine is a molecule able to induce vasodilatation and to inhibit platelet aggregation. Thus, the maintenance of normal purinergic signalling has been showed as an important issue for the treatment of cardiovascular diseases. The nucleoside di and triphosphate can be hydrolyzed by members of several families of membrane-bound or soluble ectonucleotidases, including ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterases (E-NPPs), that together with an ecto-5’-nucleotidase lead to adenosine formation. On the platelets ecto-surface, both E-NTPDase and ecto-5’-nucleotidase are already described. The renin-angiotensin system is the most important regulator of renal and cardiovascular function developing a fundamental role in the arterial blood pressure homeostasis and in the electrolytic balance. Angiotensin II (ANGII) induces physiologically the platelet activation, probably due to its vasoconstrictors properties. The aims of this study were: 1) to kinetically characterize the enzyme E-NPP from rat blood platelet, using the artificial marker substrate p-Nph-5’TMP and 2) to clarify, even though in part, the effects of ANGII upon extracellular nucleotide hydrolysis by rat platelets ectoenzymes. In the first chapter, we describe an enzymatic activity that shares the major characteristics already described for E-NPPs: optimum alkaline pH; KM and Vmax calculated values of approximately 106.22 ± 17.83 μM and 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively; and divalent cation dependence. Besides, AMP inhibited only p-Nph-5’TMP hydrolysis. On the other hand, sodium azide, in high concentrations, ANGII and gadolinium chloride just changed ATP or ADP or both hydrolysis. In the second chapter, we show that ANGII was able to increase ATP, ADP and AMP hydrolysis in platelets from rats in all tested dosis (5, 50, 500 e 5000 picomoles). However, no modification was observed regarding p-Nph-5'TMP hydrolysis. Additionally, we verified an increase on AMP hydrolysis and a reduction on p-Nph-5'TMP hydrolysis in platelets from spontaneously hypertensive rats (SHR) when compared to Wistar normotensive rats. Finally, this work shows the kinetic and biochemistry characterization of an E-NPP enzyme on the intact platelet surface as being part of a complex system for nucleotide hydrolysis that could contribute for the antiplatelet therapies and vascular diseases treatment. In addition, we present some results showing interactions between rat platelet angiotensinergic and adenosinergic systems that could contribute to the understanding and treatment of cardiovascular diseases such as hypertension and atherosclerosis.

As plaquetas sangüíneas são fragmentos citoplasmáticos, oriundos da ruptura dos megacariócitos, cuja principal função está relacionada à manutenção da integridade vascular. Os nucleotídeos extracelulares, ATP e ADP, bem como a adenosina, têm sido implicados em um grande número de funções fisiológicas: o ADP é o principal fator recrutador de plaquetas, enquanto que o ATP é um inibidor competitivo da agregação induzida por ADP. A adenosina é uma molécula capaz de induzir vasodilatação e inibir a agregação plaquetária. Desta maneira, a manutenção da sinalização purinérgica normal tem se mostrado importante para o tratamento de doenças cardiovasculares. Os nucleosídeos di e trifosfatos circulantes podem ser hidrolisados por membros de várias famílias de ectonucleotidases de membrana e solúveis, incluindo as ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs), que em conjunto com a ecto-5’-nucleotidase, levam à formação de adenosina. Na superfície das plaquetas, ambas enzimas, E-NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, estão descritas. O sistema renina-angiotensina é o principal regulador da função renal e cardiovascular, desenvolvendo um papel fundamental na homeostasia da pressão arterial e do balanço eletrolítico. A angiotensina II (ANGII) induz fisiologicamente a ativação das plaquetas, possivelmente devido às suas propriedades vasoconstritoras. Os objetivos deste trabalho foram, portanto: 1) caracterizar cineticamente a enzima E-NPP em plaquetas de ratos, utilizando o substrato marcador p-Nph-5’TMP e 2) esclarecer, mesmo que em parte, os possíveis efeitos da ANGII sobre a hidrólise extracelular de nucleotídeos por plaquetas de ratos. No primeiro capítulo deste trabalho, descrevemos uma atividade enzimática em plaquetas de ratos que compartilha as principais características bioquímicas já descritas para as E-NPPs: pH ótimo alcalino; valores de KM e Vmax calculados de aproximadamente 106.22 ± 17.83 μM e 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectivamente; e dependência de cátions divalentes. Além disso, o AMP inibiu somente a hidrólise do p-Nph-5’TMP. Por outro lado, a azida de sódio, em altas concentrações, a angiotensina II e o cloreto de gadolínio alteraram apenas as hidrólises de ATP ou ADP ou de ambos. No segundo capítulo, mostramos que a ANGII foi capaz de aumentar as hidrólises de ATP, ADP e AMP em plaquetas em todas as doses testadas (5, 50, 500 e 5000 picomóis). Entretanto, nenhuma alteração foi observada com relação à hidrólise do p-Nph-5'TMP. Em adição, observamos um aumento na hidrólise de AMP e uma diminuição na hidrólise de p-Nph-5'TMP em plaquetas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) quando comparados a ratos Wistar normotensos. De maneira geral, esta dissertação traz a caracterização bioquímica da enzima E-NPP na superfície de plaquetas intactas de ratos como sendo parte de um complexo sistema para a hidrólise de nucleotídeos nestes fragmentos citoplasmáticos, podendo, assim, contribuir para o desenvolvimento de terapias antiplaquetárias e para o tratamento de doenças vasculares. Adicionalmente, apresentamos alguns resultados demonstrando interações entre os sistemas angiotensinérgico e adenosinérgico de plaquetas de ratos, o que poderá contribuir para o entendimento e o tratamento de doenças cardiovasculares como hipertensão e arteriosclerose. / Platelets are cytoplasmic fragments derived from bone marrow megakaryocytes rupture, whose major role is related to the vascular integrity maintenance. The extracellular nucleotides ATP and ADP as well as adenosine have been implicated in a great number of physiological functions: ADP is the major factor recruiting platelet, whereas ATP has been considered as a competitive inhibitor of ADP-induced platelet aggregation. Adenosine is a molecule able to induce vasodilatation and to inhibit platelet aggregation. Thus, the maintenance of normal purinergic signalling has been showed as an important issue for the treatment of cardiovascular diseases. The nucleoside di and triphosphate can be hydrolyzed by members of several families of membrane-bound or soluble ectonucleotidases, including ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterases (E-NPPs), that together with an ecto-5’-nucleotidase lead to adenosine formation. On the platelets ecto-surface, both E-NTPDase and ecto-5’-nucleotidase are already described. The renin-angiotensin system is the most important regulator of renal and cardiovascular function developing a fundamental role in the arterial blood pressure homeostasis and in the electrolytic balance. Angiotensin II (ANGII) induces physiologically the platelet activation, probably due to its vasoconstrictors properties. The aims of this study were: 1) to kinetically characterize the enzyme E-NPP from rat blood platelet, using the artificial marker substrate p-Nph-5’TMP and 2) to clarify, even though in part, the effects of ANGII upon extracellular nucleotide hydrolysis by rat platelets ectoenzymes. In the first chapter, we describe an enzymatic activity that shares the major characteristics already described for E-NPPs: optimum alkaline pH; KM and Vmax calculated values of approximately 106.22 ± 17.83 μM and 3.44 ± 0.18 nmol p-nitrophenol/min/mg, respectively; and divalent cation dependence. Besides, AMP inhibited only p-Nph-5’TMP hydrolysis. On the other hand, sodium azide, in high concentrations, ANGII and gadolinium chloride just changed ATP or ADP or both hydrolysis. In the second chapter, we show that ANGII was able to increase ATP, ADP and AMP hydrolysis in platelets from rats in all tested dosis (5, 50, 500 e 5000 picomoles). However, no modification was observed regarding p-Nph-5'TMP hydrolysis. Additionally, we verified an increase on AMP hydrolysis and a reduction on p-Nph-5'TMP hydrolysis in platelets from spontaneously hypertensive rats (SHR) when compared to Wistar normotensive rats. Finally, this work shows the kinetic and biochemistry characterization of an E-NPP enzyme on the intact platelet surface as being part of a complex system for nucleotide hydrolysis that could contribute for the antiplatelet therapies and vascular diseases treatment. In addition, we present some results showing interactions between rat platelet angiotensinergic and adenosinergic systems that could contribute to the understanding and treatment of cardiovascular diseases such as hypertension and atherosclerosis.