Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare but fatal disease with an annual mortality rate of 15% despite current therapies. Uncontrolled proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) results in adverse vascular remodeling contributing to PAH. Understanding the mechanisms of PASMC proliferation may identify new targets for treatment. Chloride currents/channels (ICl) are expressed in PASMCs and their roles in proliferation have been suggested based on their importance in resting membrane potential and cell volume regulation. The present study explored the role of ICl in proliferation in rat and human PASMCs. We found that either nonspecific ICl inhibitors (DIDS or NPPB) or a putative specific blocker of swelling-activated ICl (ICl,swell) reduced proliferation of PASMCs cultured in serum-containing media. Patch-clamp studies showed that proliferating PASMCs had increased baseline ICl and ICl,swell in association with depolarized membrane potentials. Quantitative real-time RT-PCR studies identified expressions of CLC-3, a candidate gene of ICl,swell, and several other CLC genes in proliferating PASMCs. While selective knockdown of CLC-3 with lentiviral shRNA reduced PASMC proliferation, it had no effect on ICl,swell. These findings are consistent with the conclusion that ICl regulate proliferation of PASMCs and suggest that selective ICl inhibition may be useful in treating pulmonary arterial hypertension.

Immunopathological disorders are no longer defined by dysregulated T-helper (Th) type 1/ Th2 responses but account for modulatory cell types such as regulatory and Th17 cells. The newly defined Th17 subset is an effector memory subtype which regulates mucosal host defense responses. A distinctive feature of interleukin (IL)-17 is its ability to invoke neutrophilic responses and to synergize cytokine responses in proximal structural cells. This effect is most evident for proinflammatory cytokines and neutrophil-mobilizing chemokines which are under the regulatory control of the canonical, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) pathway. The uniqueness of the IL-17A receptor (IL-17RA) signal transduction pathway however has been a limiting factor in uncovering IL-17-mediated effector functions since the receptor bears little homology to other known receptors and contains a unique cytoplasmic consensus binding motif. Hence, the composition, dynamics and subunit interactions of the IL-17R complex have become an emerging area of research where novel recruitment motifs and adaptor proteins are actively being explored. Our study sought to uncover the signal transduction and molecular mechanisms mediating the initiation and amplification responses induced by IL-17. We hypothesize that (i) IL-17 represents a key cytokine which initiates inflammatory responses by acting on proximal structural cells to rapidly release neutrophil-mobilizing chemokines and myeloid growth factors and that (ii) IL-17 directly promotes survival responses of immune effector cells. Genomic analysis of stimulated human airway smooth muscle cells support the proinflammatory nature of IL-17 as NF-κB associated genes and chemokines were most significantly upregulated within 2 hours. However, IL-17 induced a modest fold increase in gene expression levels whereby only 4 genes achieved greater than 2 fold increases. This, along with the observation that IL-17 enhanced IL-1β-mediated CXCL8 expression via transcriptional promoter activation levels and post-transcriptional mRNA stabilization mechanisms suggests that IL-17 cooperatively functions with secondary cytokines to mediate inflammatory responses. Despite activating the p38-mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway in peripheral blood neutrophils, IL-17 did not directly affect the apoptotic capacity of these cells but unexpectedly antagonized the survival response mediated by the granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF). Collectively, our results suggest that IL-17 is a potent synergistic cytokine which signals via the MAPK-NF-κB pathway to indirectly recruit neutrophils via CXC-chemokines produced by non-hematopoietic cells and that IL-17 may potentially dampen inflammatory responses by directly antagonizing inflammatory effector cells.

Il a été démontré que les chevaux atteints du souffle présentent une augmentation de la masse de muscle lisse entourant les voies respiratoires comparativement à des chevaux sains (Herszberg, Ramos-Barbon et al. 2006, Leclere, Lavoie-Lamoureux et al. 2011). L’augmentation de la masse de muscle lisse ainsi observée résulte d’une hyperplasie, et possiblement, d’une hypertrophie des myocytes. Les traitements usuels du souffle ne sont que partiellement efficaces à diminuer cette augmentation. L’objectif de cette étude était d’explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans ces changements affectant la cellule musculaire lisse dans la pathologie du souffle chez le cheval. Pour ce faire, nous avons examiné les effets d’une exposition antigénique sur l’expression du «Serum Response Factor» (SRF) dans le muscle lisse bronchique. Le SRF est un facteur de transcription localisé dans le noyau de la cellule musculaire lisse et régulant l’expression génique de celle-ci en favorisant un phénotype prolifératif ou contractile. Les résultats démontrent qu’avant exposition antigénique, les pourcentages de cellules exprimant le SRF sont faibles. Une augmentation significative du pourcentage de myocytes exprimant le SRF survient suite à une stimulation antigénique chez les chevaux atteints de souffle alors qu’aucune augmentation n’est observée chez les chevaux contrôles. Ces résultats suggèrent que le SRF pourrait contribuer au remodelage du muscle lisse péribronchique dans la pathologie du souffle. / Previous studies have shown that heaves-affected horses, when compared to age-matched control horses, have an increased smooth muscle mass surrounding their airways (Herszberg, Ramos-Barbon et al. 2006, Leclere, Lavoie-Lamoureux et al. 2011). Also, it is shown that hyperplasia, and possibly hypertrophy, contribute to this finding. Current therapies are only partially effective at reversing this finding. The goal of this study was to explore the molecular pathways involved in airway smooth muscle remodelling during heaves. We studied the Serum Response Factor (SRF), a nuclear transcriptional factor that controls gene expression in the smooth muscle cell and favour either a proliferative or a contractile phenotype. The results show that before antigenic exposition, the percentage of cells expressing SRF is low. A significant increase in the percentage of SRF-expressing myocytes occurs after antigenic stimulation in heaves-affected horses whereas no increase is observed in control subjects. These results suggest that the transcription factor SRF may contribute to airway smooth muscle remodeling in heaves-affected horses.

Šio eksperimentinio darbo tikslas buvo įvertinti 1,4-dihidropiridino ir benzimidazolo junginių poveikį jūros kiaulyčių širdies papiliarinių raumenų izometrinei funkcijai bei žmogaus kraujagyslių segmentų susitraukimui ir atsipalaidavimui. Buvo atlikti eksperimentiniai tyrimai su izoliuotais jūros kiaulyčių širdies papiliarinių raumenų preparatais ir izoliuotais žmogaus v.saphena magna ir a.thoracica interna kraujagyslių segmentais. Kraujagyslių preparatai gauti iš pacientų, kuriems buvo atliekamos širdies vainikinių arterijų jungčių suformavimo operacijos LSMU ligoninės Kauno klinikos Kardiochirurgijos klinikoje. Žmogaus izoliuotų kraujagyslių preparatų tyrimams išduotas Kauno regioninio bioetikos komiteto leidimas Nr. BE–2–64, data 2010–11–05. Buvo tiriamas 1,4-dihidropiridinų bei benzimidazolo junginių poveikis izometrinei jūros kiaulyčių širdies papiliarinių raumenų funkcijai, registruojant preparatų elektromechaninį susitraukimo jėgos ir transmembraninio veikimo potencialus. Eksperimentiniai tyrimai, atlikti in vitro sąlygomis, įvertinant 1,4-dihidropiridinų bei benzimidazolo junginių poveikį žmogaus izoliuotų kraujagyslių (v.saphena magna ir a.thoracica interna) segmentų susitraukimui ir atsipalaidavimui, skirtingų ekstraląstelinio Ca2+ koncentracijų įtaką tiriamųjų junginių poveikiui kraujagyslių segmentų susitraukimui ir atsipalaidavimui. Tiriamieji 1,4–dihidropiridinų junginiai sintezuoti Latvijos Organinės Sintezės institute. / This study aim was to evaluate the effects of 1,4-dihydropiridines and benzimidazole deriva¬tives on the isometric function of guinea pig papillary cardiac muscles and the contraction and relaxation of vascular segments in humans. The experiments were carried out on isolated samples of human great saphenous vein (v. saphena magna) and internal thoracic artery (a. tho¬racica interna). The vein and arteries samples were taken from patients who underwent coronary artery bypass. The study was approved by the Regional Ethics Committee of the Biomedical Research on 05/11/2010, license No. BE-2-64, Kaunas, Lithuania. The inotropic activity and transmembrane AP duration of the dihydropyridine derivatives were evaluated on the guinea-pig papillary muscles and aorta vascular samples. Synthesis of 1,4-dihydropyridine derivatives were performed in Latvian Organic Synthesis institute. During this study were performed the evaluation of 1,4-dihydropyridines and benzimidazole derivatives on contraction force and action potential in guinea pig papillary muscles. Effects of 1,4-dihydropyridines and benzimidazole derivatives on contraction and relaxation of the segments of the great sa¬phenous vein (v. saphena magna) and internal thoracic artery (a. tho¬racica interna) in humans, the extra-cellular concentration of Ca2+ and the effect of the studied compounds and were evaluated. Also assessment of preventive effect of the calcium channel blockers and benzimidazole derivative on contraction... [to full text]

L’hypertension artérielle est le facteur de risque le plus important dans les maladies cardiovasculaires (MCV) et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). L’hypertension artérielle essentielle est une maladie complexe, multifactorielle et polygénique. Même si on a identifié de nombreux facteurs de risque de l’hypertension artérielle, on ne comprend pas encore clairement les mécanismes qui la régissent. Les kinases hépatocytes produisant l’érythropoïétine (Eph) constituent la plus grande famille des récepteurs tyrosine kinase qui se lient à des ligands de surface cellulaire appelés éphrines sur les cellules avoisinantes. On sait que les interactions de Eph et des éphrines sont essentielles aussi bien dans les processus de développement que dans le fonctionnement des organes et des tissus adultes. Cependant on n’a pas encore étudié la relation entre Eph/éphrines et l’hypertension artérielle. Nous avons créé des modèles de souris knockout (K.O.) Ephb6-/-, Efnb1-/- et Efnb3-/- pour cette étude. Dans le modèle EphB6-/-, nous avons observé que les souris K.O. Ephb6 castrées, mais pas les femelles, ainsi que les souris mâles non castrées présentaient une tension artérielle élevée (TA) par rapport à leurs homologues de type sauvage (TS). Ceci suggère que Ephb6 doit agir de concert avec l’hormone sexuelle mâle pour réguler la TA. Les petites artères des mâles castrés Ephb6-/- présentaient une augmentation de la contractilité, une activation de RhoA et une phosphorylation constitutive de la chaîne légère de la myosine (CLM) lorsque comparées à celles de leurs homologues TS. Ces deux derniers résultats indiquent que la phosphorylation de CLM et de RhoA passe par la voie de signalisation de Ephb6 dans les cellules du muscle lisse de la paroi vasculaire (CMLV). Nous avons démontré que la réticulation de Efnbs mais non celle de Ephb6 aboutit à une réduction de la contractilité des CMLV. Ceci montre que l’effet de Ephb6 passe par la signalisation inversée à travers Efnb. Dans le modèle Efnb1-/- conditionnel spécifique au muscle lisse, nous n’avons observé aucune différence entre Efnb1-/- et les souris de TS concernant la mesure de la TA dans des conditions normales. Cependant, la TA des souris K.O. Efnb1 lors d’un stress d’immobilisation est supérieure à celle des souris de TS. Dans les petites artères des souris K.O. Efnb1, le rétrécissement et la phosphorylation de CLM étaient élevés. In vitro, la contractilité et l’activation RhoA de la CMLV des souris TS étaient augmentées quand leur Efnb1 était réticulé. Ces résultats corroborent ceux des souris KO Ephb6 et prouvent que l’effet de Ephb6 dans le contrôle de la TA se produit au moins par l’intermédiaire d’un de ses ligands Efnb1 dans les CMLV. Dans le modèle Efnb3-/-, on a observé une augmentation de la TA et du rétrécissement des vaisseaux chez les femelles Efnb3-/-, mais non chez les mâles; l’échographie a aussi révélé une résistance accrue au débit sanguin des souris K.O. femelles. Cependant la mutation de Efnb3 ne modifie pas la phosphorylation de la CLM ou l’activation de RhoA in vivo. Dans l’expérience in vitro, les CMLV des souris femelles Efnb3-/- ont présenté une augmentation de la contractilité mais pas celle des souris mâles Efnb3-/-. La réticulation des CMLV chez les mâles ou les femelles de TS avec solide anti-Efnb3 Ab peut réduire leur contractilité. Notre étude est la première à évaluer le rôle de Eph/éphrines dans la régulation de la TA. Elle montre que les signalisations Eph/éphrines sont impliquées dans le contrôle de la TA. La signalisation inverse est principalement responsable du phénotype élevé de la TA. Bien que les Efnb1, Efnb3 appartiennent à la même famille, leur fonction et leur efficacité dans la régulation de la TA pourraient être différentes. La découverte de Eph/Efnb nous permet d’explorer plus avant les mécanismes qui gouvernent la TA. / Hypertension is the most important risk factor for the cardiovascular diseases (CVD) and strokes. The essential hypertension is a complex, multifactorial and polygenic disease. Although many hypertension risk factors have been identified, the comprehensive understanding of mechanisms remains elusive. Erythropoietin-producing hepatocyte kinases (Ephs) are the largest family of receptor tyrosine kinases, which bind to cell surface ligands called ephrins on neighboring cells. Eph and ephrin interactions are known to be essential in developmental processes, as well as in functions of adult organs and tissues. However the relationship between Ephs/ephrins and hypertension has not been studied. Ephb6-/-, Efnb1-/- and Efnb3-/-knockout mice models were established for this study. In the EphB6-/- model, we observed that the castrated Ephb6 KO mice but not female or uncastrated male mice presented heightened blood pressure (BP) compared to the wild type (WT) counterparts. This suggests that Ephb6 needs to act in concert with sex hormone to regulate blood pressure. Small arteries from castrated Ephb6-/- males showed increased contractility, RhoA activation and constitutive myosin light chain (MLC) phosphorylation compared to their WT counterparts. The latter two findings indicate that RhoA and MLC phosphorylation are in the signaling pathway of Ephb6 in vascular smooth muscle cell (VSMC). We demonstrated that, crosslinking of Efnbs but not Ephb6 resulted in reduced VSMC contractility. This indicates that the effect of Ephb6 is via reverse signaling through Efnbs. In smooth muscle-specific conditional Efnb1-/- model, no difference was observed between Efnb1-/- and WT mice in BP measurement under a normal condition. However, the BP of Efnb1 KO mice during immobilization stress were higher than that of WT mice. In the small arteries from Efnb1 KO mice, the constriction and MLC phosphorylation were elevated. In vitro, the contractility and RhoA activation of WT VSMC were augmented when their Efnb1 was crosslinked. These results corroborate the findings from Ephb6 KO mice, and prove that the effect of Ephb6 in BP control is at least via one of its ligand Efnb1 in VSMC. In the Efnb3-/- model the heightened BP and increased vessel constriction were observed in Efnb3-/-females but not males; the echography also revealed the increased blood flow resistance of female KO mice. However the mutation of Efnb3 doesn’t alter the MLC phosphorylation or RhoA activation in vivo. In in vitro experiment, VSMCs from Efnb3-/- female mice showed increased contractility but did not Efnb3-/- male mice. Crosslinking of VSMCs from WT males or females with solid anti-Efnb3 Ab can reduce their contractility. Our study is the first to assess the role of Eph/ephrins in BP regulation. Eph/ephrins signalings are involved in the regulation of BP. The reverse signaling is mainly responsible for the elevated BP phenotype. Although the Efnb1, Efnb3 belongs to the same family, their function and effectiveness in the regulation of BP might be different. The discovery of Eph/Efnbs allows us to further explore the mechanism in BP.

No description available.

No description available.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2007. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains xxiii, 251 p. : ill. Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2004. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 166-179). Also issued on the Internet.

Ο έλεγχος της έκφρασης των πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν τον Λείο Μυικό Φαινότυπο (ΛΜΦ) είναι εξαιρετικής σημασίας για την κατανόηση, σε μοριακό επίπεδο, διεργασιών που σχετίζονται με πολλές φυσιο-παθολογικές καταστάσεις στον άνθρωπο. Μεταξύ των ασθενειών όπου ο ΛΜΦ είναι καθοριστικής σημασίας για την ανάπτυξη και εξέλιξή τους, είναι η αθηροσκλήρωση, η υπέρταση, η επαναστένωση των αρτηριών μετά από αγγειοπλαστική, η ίνωση οργάνων όπως οι πνεύμονες, το ήπαρ και οι νεφροί, και η ανάπτυξη μεταστάσεων από συμπαγείς όγκους. Επομένως, κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που οδηγούν σε τροποποίηση του ΛΜΦ είναι βασικής σημασίας για την αναγνώριση στρατηγικών περιορισμού της εξέλιξης των νόσων αυτών και της εκδήλωσης των κλινικών συνεπειών τους. Αρχικό στόχο αποτέλεσε η ανάπτυξη και καθιέρωση ενός in vitro προτύπου συστήματος για την διαφοροποίηση μη διαφοροποιημένων κυττάρων προς φαινότυπο που προσομοιάζει με αυτό των Λείων Μυικών Κυττάρων (ΛΜΚ), ώστε να χρησιμεύσει στη μελέτη του μοριακού καθορισμού και ελέγχου του φαινότυπου των κυττάρων αυτών. Πρώτα-πρώτα, χαρακτηρίσαμε βασικά, σημαντικά «μοριακά εργαλεία» για την διαπίστωση και μοριακή διερεύνηση του ΛΜ-φαινοτύπου. Χρησιμοποιώντας τα, αναπτύξαμε και χαρακτηρίσαμε πρωτογενώς ένα πρότυπο σύστημα διαφοροποίησης σε ΛΜΚ, βασιζόμενο σε Μεσεγχυματικά Βλαστικά Κύτταρα (ΜΒΚ) προερχόμενα από γέλη Wharton ομφάλιου λώρου. Στα κύτταρα αυτά, η έκφραση γονιδίων και πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν τον ΛΜΦ εξαρτάται από την επαρκή έκφραση της πρωτεΐνης Serum Response Factor (SRF), από την ύπαρξη αλληλουχιών Serum Response Element (SRE) στον υποκινητή των εξεταζόμενων ΛΜΚ-ειδικών γονιδίων, και επάγεται από εξωγενή έκφραση της Μυοκαρδίνης. Επομένως, όπως έχει περιγραφεί και για άλλα πρότυπα συστήματα, η διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών σε κύτταρα που προσομοιάζουν ΛΜΚ στηρίζεται στην συνέργεια δύο μεταγραφικών παραγόντων, του SRF και της Μυοκαρδίνης. Το πρότυπο αυτό θα είναι χρήσιμο για να διερευνήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης φυσιολογικών και φαρμακολογικών παραγόντων στον έλεγχο του ΛΜΦ. Επί πλέον, το πρότυπο σύστημα αυτό δύναται να αποβεί χρήσιμο για την κατανόηση εν γένει διεργασιών που οδηγούν στην βασική κυτταρική αλλαγή γνωστή ως Επιθηλιακή-Μεσεγχυματική Μετάβαση (ΕΜΤ) και κατ’ επέκταση για την κατανόηση μηχανισμών παθογένειας πλείστων νόσων που χαρακτηρίζονται από ΕΜΤ. Παράλληλα, έγινε προσπάθεια διερεύνησης αν η κυτταρική σειρά A7r5 αγγειακών ΛΜΚ αποτελεί βιώσιμο φαρμακολογικό σύστημα για την διερεύνηση των μηχανισμών μέσω των οποίων η έκφραση του ΛΜΦ ελέγχεται σε μοριακό επίπεδο από τους αδρενεργικούς υποδοχείς, μία οικογένεια υποδοχέων που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση του αγγειακού τοιχώματος και στην αρτηριακή παθοφυσιολογία. Δείξαμε ότι ο κυτταρικός πληθυσμός A7r5 δεν απαντά σε α1-αδρενεργική διέγερση διότι στερείται α1-αδρενεργικών υποδοχέων. Διέγερση αποκτάται με εισαγωγή μέσω πλασμιδίου α1-αδρενεργικών υποδοχέων, άρα το ενδογενές σηματοδοτικό σύστημα είναι παρόν και λειτουργικό. Επιπρόσθετα, ανακαλύψαμε ότι τα κύτταρα A7r5 εκφράζουν ενδογενώς λειτουργικούς β-αδρενεργικούς υποδοχείς. Θέτουμε έτσι τα θεμέλια για μία σε βάθος διερεύνηση του τυχόν ρόλου των β-αδρενεργικών υποδοχέων στον έλεγχο του φαινοτύπου των αγγειακών ΛΜΚ, ο οποίος είναι καθοριστικός για την γένεση και πορεία των καρδιαγγειακών νοσημάτων εν γένει. Συμπερασματικά λοιπόν α) τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα προερχόμενα από τη γέλη Wharton ανθρώπινου ομφάλιου λώρου αποτελούν κατάλληλο πρότυπο σύστημα διερεύνησης της ρύθμισης των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση προς ΛΜΚ από μόρια φαρμακολογικής σημασίας, και β) τα κύτταρα A7r5 αποτελούν καλό πρότυπο σύστημα για την διερεύνηση του τυχόν ρόλου των β-αδρενεργικών υποδοχέων στον έλεγχο του φαινοτύπου των ΛΜΚ των αγγείων. / The control of the genes that specify the Smooth Muscle Cell Phenotype is of great importance for our understanding, at a molecular level, of the processes central in a number of human pathologies. Among the diseases whose onset and progress is influenced by alterations in Smooth Muscle-Like (SM-L) phenotype are atherosclerosis, organ fibrosis (lung, liver and kidney), and metastasis associated with solid tumors. For these reasons, the understanding of the cell and molecular mechanisms that lead to changes in the SM phenotype expression are of central importance in our efforts to identify new approaches in limiting the progress of these diseases and the manifestation of the associated clinical symptoms. The first Aim of this work was the development and initial characterization of an in vitro model of differentiation towards a Smooth-Muscle-Like phenotype, to serve for the study of its molecular control. Initially, we characterized basic important molecular tools useful in determining the SM-L phenotype. With their aid, we developed and characterized a model system based on Wharton’s Jelly-derived Mesenchymal stem Cells (MSCs). In these cells, the expression of genes and proteins characteristic of the SM Phenotype depends on the protein levels of Serum Response Factor (SRF) and on the existence of SRF-binding elements on the promoters of the SM-specific genes; it is also potently induced by the exogenous expression of the transcription factor Myocardin. Therefore, this population of MSCs behaves as other characterized model systems, in that their differentiation to a SM-L phenotype is supported by the synergistic action of SRF and Myocardin. This novel model system based on Wharton’s Jelly MSCs will be useful to study the role of specific physiological and pharmacological agents in the control of the SM phenotype. In addition, such a system can offer insights in the basic cellular process of Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) and by extent, in the pathological mechanisms of diseases characterized by EMT. In parallel, we investigated whether the differentiated SMC line A7r5 is a viable pharmacological model system to investigate the control of the SMC phenotype by adrenergic receptors, a family of receptors that plays a crucial role in the homeostasis of the vessel wall. We showed that A7r5 cells do not express functional α1-adrenergic receptors; however, the intracellular signaling system linked to α-adrenergic receptors is present and functional. In contrast, A7r5 cells endogenously express functional β-adrenergic receptors, and A7r5 cells are therefore an attractive model to study the role of these receptors in the control of the SMC-phenotype. In conclusion, a) Mesenchymal Stem Cells from Wharton’s Jelly surrounding the human umbilical cord are a suitable in vitro model for the study of the molecular mechanisms that modulating Smooth Muscle Cell differentiation, and b) A7r5 cells are a good in vitro model system to investigate the role of the β-adrenergic receptor in controlling the phenotype of Vascular Smooth Muscle cells.