INTRODUÇÃO: A Peroxisome Proliferator Activated Receptor- - Coactivator 1 ( PGC-1 e ) é proteína responsável pela conexão entre estímulos ambientais e resposta metabólica celular. Sua presença é importante em tecidos adiposo, hepático e muscular esquelético e, em animais, em tecido adiposo marrom. Interage com receptores nucleares modulando a biogênese mitocondrial e mantendo o equilíbrio termo energético celular com o meio ambiente. A redução da expressão de PGC-1 e da oxidação fosforilativa tem sido associada à resistência à insulina em doenças como Diabetes Mellitus tipo 2 e Síndrome Metabólica. OBJETIVOS: Avaliar o efeito do exercício na expressão da PGC-1 em tecidos alvos da insulina, como o fígado e músculos esquléticos soleus ( SOL ) e plantaris ( PLA ) de ratos machos Wistar e correlacioná-lo com a sensibilidade à insulina. METODOLOGIA: Ratos machos Wistar 190±15 g, n = 24, randomizados em 2 grupos: Ex ( exercício físico ) e Sd ( sedentário ) colocados respectivamente, em roda de atividade ou gaiolas comuns durante cinco semanas. Ao final do período, após jejum de quatro horas, foi colhido sangue para dosagens de glicose ( GLI ), insulina ( INS ) e ácidos graxos livres ( AGL ) e, em seguida, foram submetidos ao Teste de Supressão da Glicose e Insulina Endógenas com infusão durante 180 minutos de solução GLI ( 20mg/kg/min ) + INS ( 5 mU/kg/min ); amostras de sangue foram colhidas aos 140, 150, 160, 170 e 180 minutos. Terminado o teste e ainda sob anestesia, foram retirados os tecidos: fígado ( FG ) e músculos esquléticos ( PLA e SOL ), os quais foram imediatamente congelados e mantidos a -70ºC para posteriores análises. A expressão da PGC-1 foi avaliada pelo Western Blot com anticorpo policlonal anti- PGC-1. Análise estatística por teste t Student não-pareado e nível de significância 5%. RESULTADOS: Os dados se referem à média e erro padrão médio dos valores individuais das amostras. A distância percorrida na última semana ( km/dia ) pelo grupo Ex foi eficaz ( 5,61 ± 0,67 ). Não houve diferença no peso ( g ) dos ratos entre os grupos Ex e Sd ( 355,85 ± 9,51 x 375,68 ± 5,30 ) NS. Os valores de GLI jejum ( mg/dl ) foram semelhantes entre os grupos ( 117,6 ± 3,7 x 122,4 ± 2,6 ) NS. Entretanto, INS e AGL foram menores no grupo Ex: INS ( ng/ml ) ( 0,68 ± 0,12 x 1,45 ± 0,14 ) p < 0,001 e AGL ( mEq/L ) ( 1,12 ± 0,11 x 1,60 ± 0,11 ) p < 0,006. Durante o teste de supressão, os valores de GLI e INS na fase de estabilidade foram semelhantes entre grupos ( expressos em área sob a curva ): AUC GLI ( mg/dl/min ) ( 2,77 ± 0,12 x 2,95 ± 0,07 ) NS; AUC INS ( ng/ml/min ) ( 0,81 ± 0,15 x 0,99 ± 0,09 ) NS. A expressão da PGC-1 foi maior no PLA de ratos do grupo Ex e, em FG e SOL foi semelhante entre os grupos. CONCLUSÃO: O exercício físico durante 5 semanas em roda de atividade voluntária, aumentou a sensibilidade à insulina e a oxidação de ácidos graxos livres no jejum. A melhora da sensibilidade à insulina esteve associada à maior expressão da PGC-1 somente em músculo PLA. Estes dados sugerem que o aumento da sensibilidade à insulina no jejum não se relacionou com o aumento da expressão da PGC-1 em outros tecidos alvos da ação insulínica, como FG e SOL, neste modelo de estudo. / INTRODUCTION: The Peroxisome Proliferator-Activated Receptor- - Coactivator 1 ( PGC-1 e ) is a protein responsible for the connection between environmental stimuli and cell metabolic response. Its presence is important in fat tissue, hepatic and skeletal muscle and in animals on brown fat tissue. Interact with nuclear receptors modulating the mitochondrial biogenesis and maintain thermal energy balance with the environment. Diminished of PGC-1 expression and oxidative phophorylation has been associated to insulin resistance in diseases like Type 2 Diabetes and Metabolic Syndrome. OBJECTIVES: To evaluate the effects of exercise on the PGC-1 expression in target tissues of insulin, such as liver and skeletal muscles soleus (SOL) and plantaris (PLA) of male Wistar rats and correlates with insulin sensitivity. METHODOLOGY: Male Wistar rats 190±15g, n = 24, divided randomly into 2 groups: Ex ( physical exercise ) and Sd ( sedentary ), respectively placed in a voluntary running wheel cage or a standard cage for five weeks. At the end of study, after fasting for 4 hours, blood was collected for measurements of glucose ( GLU ), insulin ( INS ) and free fatty acids ( FFA ) then the animals were submitted to Test of Suppression Endogenous Glucose and Insulin, with infusion during 180 minutes of solution GLU ( 20mg/kg/min ) + INS ( 5mU/kg/min ); blood samples was collected at 140, 150, 160, 170 and 180 minutes. Finished the test and still anesthetized, the tissues were removed: liver ( LIV ), skeletal muscle ( SOL and PLA ) that were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -70ºC until analysis. The PGC-1 expression was evaluated by Western Blotting with polyclonal antibody anti-PGC-1. Statistical analysis by unpaired Students t test with significance level 5%. RESULTS: the data refer to the mean and standard error of individual values. The distance covered per day during last week ( km / day ) by Ex group was efficient ( 5,61 ± 0,67 ). There was no difference in weight ( g ) of rats between Ex and Sd groups ( 355,85 ± 9,51 x 375,68 ± 5,30 ) NS. The values of fasting GLU were similar between groups ( mg/dl ) ( 117,6 ± 3,7 x 122,4 ± 2,6 ) NS. However INS and FFA were lower in group Ex: INS ( ng/ml ) ( 0,68 ± 0,12 x 1,45 ± 0,14 ) p < 0,001 and FFA ( mEq/L ) ( 1,12 ± 0,11 x 1,60 ± 0,11 ) p < 0,006. During the suppression test the values of GLU and INS on stability step were similar between groups ( expressed in area under curve ): AUC GlU ( mg/dl/min ) ( 2,77 ± 0,12 x 2,95 ± 0,07 ) NS; AUC INS ( ng/ml/min ) ( 0,81 ± 0,15 x 0,99 ± 0,09 ) NS. The PGC-1 expression was greater in PLA of rats Ex than Sd group, and there was no difference in LIV and SOL between groups. CONCLUSION: The physical exercise during five weeks in voluntary running wheel increased the insulin sensitivity and fasting free fatty acids oxidation. The improvement of insulin sensitivity was associated with higher PGC-1 expression on PLA muscle only. These data suggest that increasing insulin sensibility on fasting is not associated with increasing of the PGC-1 expression in others targets tissues of insulin action, such as LIV and SOL, in this study model.

INTRODUÇÃO: A Peroxisome Proliferator Activated Receptor- - Coactivator 1 ( PGC-1 e ) é proteína responsável pela conexão entre estímulos ambientais e resposta metabólica celular. Sua presença é importante em tecidos adiposo, hepático e muscular esquelético e, em animais, em tecido adiposo marrom. Interage com receptores nucleares modulando a biogênese mitocondrial e mantendo o equilíbrio termo energético celular com o meio ambiente. A redução da expressão de PGC-1 e da oxidação fosforilativa tem sido associada à resistência à insulina em doenças como Diabetes Mellitus tipo 2 e Síndrome Metabólica. OBJETIVOS: Avaliar o efeito do exercício na expressão da PGC-1 em tecidos alvos da insulina, como o fígado e músculos esquléticos soleus ( SOL ) e plantaris ( PLA ) de ratos machos Wistar e correlacioná-lo com a sensibilidade à insulina. METODOLOGIA: Ratos machos Wistar 190±15 g, n = 24, randomizados em 2 grupos: Ex ( exercício físico ) e Sd ( sedentário ) colocados respectivamente, em roda de atividade ou gaiolas comuns durante cinco semanas. Ao final do período, após jejum de quatro horas, foi colhido sangue para dosagens de glicose ( GLI ), insulina ( INS ) e ácidos graxos livres ( AGL ) e, em seguida, foram submetidos ao Teste de Supressão da Glicose e Insulina Endógenas com infusão durante 180 minutos de solução GLI ( 20mg/kg/min ) + INS ( 5 mU/kg/min ); amostras de sangue foram colhidas aos 140, 150, 160, 170 e 180 minutos. Terminado o teste e ainda sob anestesia, foram retirados os tecidos: fígado ( FG ) e músculos esquléticos ( PLA e SOL ), os quais foram imediatamente congelados e mantidos a -70ºC para posteriores análises. A expressão da PGC-1 foi avaliada pelo Western Blot com anticorpo policlonal anti- PGC-1. Análise estatística por teste t Student não-pareado e nível de significância 5%. RESULTADOS: Os dados se referem à média e erro padrão médio dos valores individuais das amostras. A distância percorrida na última semana ( km/dia ) pelo grupo Ex foi eficaz ( 5,61 ± 0,67 ). Não houve diferença no peso ( g ) dos ratos entre os grupos Ex e Sd ( 355,85 ± 9,51 x 375,68 ± 5,30 ) NS. Os valores de GLI jejum ( mg/dl ) foram semelhantes entre os grupos ( 117,6 ± 3,7 x 122,4 ± 2,6 ) NS. Entretanto, INS e AGL foram menores no grupo Ex: INS ( ng/ml ) ( 0,68 ± 0,12 x 1,45 ± 0,14 ) p < 0,001 e AGL ( mEq/L ) ( 1,12 ± 0,11 x 1,60 ± 0,11 ) p < 0,006. Durante o teste de supressão, os valores de GLI e INS na fase de estabilidade foram semelhantes entre grupos ( expressos em área sob a curva ): AUC GLI ( mg/dl/min ) ( 2,77 ± 0,12 x 2,95 ± 0,07 ) NS; AUC INS ( ng/ml/min ) ( 0,81 ± 0,15 x 0,99 ± 0,09 ) NS. A expressão da PGC-1 foi maior no PLA de ratos do grupo Ex e, em FG e SOL foi semelhante entre os grupos. CONCLUSÃO: O exercício físico durante 5 semanas em roda de atividade voluntária, aumentou a sensibilidade à insulina e a oxidação de ácidos graxos livres no jejum. A melhora da sensibilidade à insulina esteve associada à maior expressão da PGC-1 somente em músculo PLA. Estes dados sugerem que o aumento da sensibilidade à insulina no jejum não se relacionou com o aumento da expressão da PGC-1 em outros tecidos alvos da ação insulínica, como FG e SOL, neste modelo de estudo. / INTRODUCTION: The Peroxisome Proliferator-Activated Receptor- - Coactivator 1 ( PGC-1 e ) is a protein responsible for the connection between environmental stimuli and cell metabolic response. Its presence is important in fat tissue, hepatic and skeletal muscle and in animals on brown fat tissue. Interact with nuclear receptors modulating the mitochondrial biogenesis and maintain thermal energy balance with the environment. Diminished of PGC-1 expression and oxidative phophorylation has been associated to insulin resistance in diseases like Type 2 Diabetes and Metabolic Syndrome. OBJECTIVES: To evaluate the effects of exercise on the PGC-1 expression in target tissues of insulin, such as liver and skeletal muscles soleus (SOL) and plantaris (PLA) of male Wistar rats and correlates with insulin sensitivity. METHODOLOGY: Male Wistar rats 190±15g, n = 24, divided randomly into 2 groups: Ex ( physical exercise ) and Sd ( sedentary ), respectively placed in a voluntary running wheel cage or a standard cage for five weeks. At the end of study, after fasting for 4 hours, blood was collected for measurements of glucose ( GLU ), insulin ( INS ) and free fatty acids ( FFA ) then the animals were submitted to Test of Suppression Endogenous Glucose and Insulin, with infusion during 180 minutes of solution GLU ( 20mg/kg/min ) + INS ( 5mU/kg/min ); blood samples was collected at 140, 150, 160, 170 and 180 minutes. Finished the test and still anesthetized, the tissues were removed: liver ( LIV ), skeletal muscle ( SOL and PLA ) that were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -70ºC until analysis. The PGC-1 expression was evaluated by Western Blotting with polyclonal antibody anti-PGC-1. Statistical analysis by unpaired Students t test with significance level 5%. RESULTS: the data refer to the mean and standard error of individual values. The distance covered per day during last week ( km / day ) by Ex group was efficient ( 5,61 ± 0,67 ). There was no difference in weight ( g ) of rats between Ex and Sd groups ( 355,85 ± 9,51 x 375,68 ± 5,30 ) NS. The values of fasting GLU were similar between groups ( mg/dl ) ( 117,6 ± 3,7 x 122,4 ± 2,6 ) NS. However INS and FFA were lower in group Ex: INS ( ng/ml ) ( 0,68 ± 0,12 x 1,45 ± 0,14 ) p < 0,001 and FFA ( mEq/L ) ( 1,12 ± 0,11 x 1,60 ± 0,11 ) p < 0,006. During the suppression test the values of GLU and INS on stability step were similar between groups ( expressed in area under curve ): AUC GlU ( mg/dl/min ) ( 2,77 ± 0,12 x 2,95 ± 0,07 ) NS; AUC INS ( ng/ml/min ) ( 0,81 ± 0,15 x 0,99 ± 0,09 ) NS. The PGC-1 expression was greater in PLA of rats Ex than Sd group, and there was no difference in LIV and SOL between groups. CONCLUSION: The physical exercise during five weeks in voluntary running wheel increased the insulin sensitivity and fasting free fatty acids oxidation. The improvement of insulin sensitivity was associated with higher PGC-1 expression on PLA muscle only. These data suggest that increasing insulin sensibility on fasting is not associated with increasing of the PGC-1 expression in others targets tissues of insulin action, such as LIV and SOL, in this study model.

Diabetes é uma doença metabólica caracterizada por hiperglicemia associada a prejuízos na captação e utilização de glicose, em que reduções na expressão da proteína GLUT4 (codificada pelo gene SLC2A4), bem como das enzimas Hexokinase-2 e Glycogen synthase (codificadas pelos genes HK2 e GYS1), desempenham papel importante. Recentemente, um novo elemento vem sendo relacionado à etiopatogenia e à fisiopatologia do diabetes, os microRNAs (miRNAs), que são pequenos RNAs envolvidos na regulação da expressão gênica, geralmente afetando a degradação de mRNAs. Entretanto, a participação de miRNAs envolvidos na redução da expressão de mRNAs relacionados a proteínas envolvidas na captação e utilização de glicose, sobretudo em músculo esquelético, permanece desconhecida. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de miRNAs potencialmente reguladores da expressão de Slc2a4/GLUT4, Hk2/HK2 e Gys1/GYS1 em músculo esquelético de ratos diabéticos. Utilizamos ratos Wistar machos que foram tornados diabéticos pela administração de estreptozotocina. Após 13 dias, 3 grupos foram formados: não-diabético (ND) e diabético tratado com placebo (DP) ou insulina (DI). O tratamento foi conduzido por 7 dias, totalizando 21 dias de diabetes. Variáveis metabólicas foram avaliadas e os músculos sóleos foram removidos para avaliar a expressão de mRNAs, miRNAs e proteínas. Uma abrangente análise in silico foi conduzida para determinar miRNAs candidatos a regularem a expressão de Slc2a4, Hk2 e Gys1. Os animais diabéticos apresentaram perda de peso, poliúria, glicosúria, hiperglicemia e aumento de frutosamina plasmática; a insulinoterapia melhorou estas variáveis. O diabetes reduziu a expressão dos mRNAs Slc2a4 (~55%), Hk2 (~47%) e Gys1 (~45%), e das proteínas GLUT4 (~77%), HK2(~52%) e GYS1 (~49%); a insulinoterapia restaurou essas variáveis. A expressão de 20 miRNAs foi avaliada neste estudo; 8 foram modulados pelo diabetes, sendo três supra-regulados, miR-1 (~28%), miR-29b (~118%) e miR-29c (~51%); e cinco infra-regulados, miR-93 (~39%), miR-199a (~30%), miR-345-3p (~23%), miR-532-3p (~26%) e miR-150 (~32%). Exceto pelo miR-1 e miR-150, a insulinoterapia reverteu as demais alterações. Além disso, miR-29b e miR-29c correlacionaram-se negativamente com GLUT4 e HK2, e positivamente com glicemia, glicosúria e frutosamina, sugerindo uma possível relação causal; enquanto que miR-199a e miR-532-3p correlacionaram-se positivamente com GLUT4 e HK2, e também com as variáveis metabólicas, sugerindo uma regulação indireta sobre os mRNAs dessas proteínas. No último caso, demonstrou-se que o miR-199a tem como alvo o NFKB1, um repressor do gene Slc2a4, o qual diminuiu no diabetes, explicando, pelo menos parcialmente, o efeito indireto sobre o GLUT4. Em suma, o diabetes aumenta a expressão de miR-29b e miR-29c, e reduz a expressão de miR-199a e miR-532-3p; o primeiro efeito, potencialmente age diretamente na tradução do mRNA Slc2a4 e Hk2, e o segundo, potencialmente age indiretamente, via NFKB, na transcrição dos genes. Como consequência, as proteínas GLUT4 e HK2 diminuem, o que reduziria a utilização de glicose pelo músculo, contribuindo para a hiperglicemia do diabetes. / Diabetes is a metabolic disease characterized by hyperglycemia associated with impaired glucose metabolism and uptake, in which reductions of GLUT4, hexokinase 2 (HK2) and glycogen synthase 1 (GYS1) proteins, encoded respectively by SLC2A4, HK2 and GYS1 genes, play an important role. Recently, a new element have been related to etiopathogeny and pathophysiology of diabetes, the microRNAs (miRNAs), which are small RNAs involved in the regulation of gene expression, usually by affecting the degradation of mRNAs. However, the participation of miRNAs diabetes-induced reduction of expression of genes related to glucose uptake and metabolism in skeletal muscle remains unknown. Thus, the objective of this study was to investigate the expression of miRNAs potentially regulators of the Slc2a4/GLUT4, Hk2/HK2 and Gys1/GYS1 in skeletal muscle of diabetic rats. Male Wistar rats were rendered diabetic by receiving streptozotocin. After 13 days, 3 groups were formed: non-diabetic (ND), and diabetic treated with placebo (DP) or insulin (DI) (NPH insulin, 6U/day). Treatment was conducted for 7 days, totalizing 21 days of diabetes. At the end of the experimental period, metabolic variables were evaluated and the soleus muscle was removed for evaluation of mRNA, miRNA and protein expression. A broad in silico analysis was performed to determine candidate miRNAs as potential regulators of Slc2a4, Hk2 and Gys1. Diabetic rats shown weight loss, polyuria, glycosuria, hyperglycemia and increased plasma fructosamine; insulin treatment improved these variables. Diabetes reduced Slc2a4 (~55%), Hk2 (~47%) and Gys1 (~45%) mRNAs, as well as GLUT4 (77%), HK2 (52%) and GYS1 (49%) proteins; insulin treatment restored these variables. Twenty miRNAs were assessed in this study. Eight miRNAs were modulated by diabetes in skeletal muscle; three were upregulated: miR-1 (28%), miR-29b (118%) and miR-29c (51%), whereas five were downregulated: miR-93 (39%), miR-150 (32%), miR-199a (30%), miR-345-3p (23%) and miR-532-3p (26%). Except for miR-1 and miR-150, all regulations were reverted by insulin treatment. Besides, miR-29b and miR-29c were negatively correlated with GLUT4 and HK2 proteins, and positively with glucose, glycosuria and plasma fructosamine suggesting a direct causal relationship; while miR-199a and miR-532-3p were positively correlated with GLUT4 and HK2 proteins, and also with the metabolic variables, suggesting an indirect causal relationship. In the last case, it was demonstrated that miR-199a has the Slc2a4 repressor Nfkb1 as target, which was reduced in muscle from diabetic rats, explaining, at least partially, the indirect effect upon GLUT4. In conclusion, diabetes increase the expression of miR-29b and miR-29c, and reduce the expression of miR-199a e miR-532-3p; the first effect, potentially acts directly in the translation of Slc2a4 and Hk2 mRNAs, and the second one, potentially acts indirectly, via NFKB, in the transcription of these genes. As a result, the expression of GLUT4 and HK2 decreases, which would reduce the muscle glucose uptake and metabolization, contributing to the hyperglycemia of the diabetes.

No tecido muscular esquelético, a interface entre o sarcolema e a matriz extracelular é constituída por proteínas especializadas responsáveis pela transmissão de força transversal e longitudinal à miofibra. As adaptações do músculo esquelético às forças fisiológicas e patológicas, como a imobilização segmentar e exercícios de reabilitação, podem contribuir para a percepção celular dos sinais mecânicos e, consequentemente, induzir modificações na flexibilidade e na força muscular. Este estudo investigou as respostas teciduais do músculo sóleo de ratas submetido ao estresse longitudinal induzido pela associação do treinamento do tipo alongamento passivo com a livre movimentação pós-imobilização dos membros posteriores direitos. O membro posterior direito das ratas foi imobilizado por 10 dias em flexão plantar, a fim de manter o músculo sóleo em posição de encurtamento. Após a imobilização, os animais passaram por um período de alongamento passivo manual intermitente. Antes da imobilização e durante o período de alongamento e de livre movimentação, foi realizada análise funcional da marcha dos animais. Noventa e seis ratas Wistar adultas foram divididas em 8 grupos: Imobilizado (I); Imobilizado e alongado por 1 dia (IAL(1)); Imobilizado e alongado por 3 dias (IAL(3)); Imobilizado e alongado por 10 dias (IAL(10)); Imobilizado e livre por 1 dia (IL(1)); Imobilizado e livre por 3 dias (IL(3)); Imobilizado e livre por 10 dias (IL(10)); Controle do Imobilizado (C(Imob)). Após os procedimentos experimentais, o músculo sóleo foi removido e congelado, para o processamento de reação de coloração Hematoxilina-Eosina; imunoistoquímica para fibronectina, colágenos tipos I e III; imunofluorescência de laminina, distrofina e macrófagos; western blot de laminina e distrofina. Análises qualitativa e quantitativa em Microscópio de Luz e sistema de análise de imagens foram realizadas. As variáveis foram avaliadas inter- e intra-grupos pelo Modelo de Regressão Linear com Efeitos Mistos. Após a imobilização, os animais apresentaram perda de peso corporal e alterações no tamanho e formato das fibras. Ainda, a hipocinesia modificou as variáveis funcionais da marcha, reduziu a amplitude de movimento (ADM) de dorsiflexão, aumentou a relação fibras com fibronectina intracelular/número total de fibras (rFFI/NTF), a expressão de distrofina, de laminina e dos colágenos tipos I e III. Após três dias de remobilização, as alterações morfológicas estavam exacerbadas: intensa celularidade, núcleos centralizados, corpos de inclusão, necrose. Estes achados foram mais intensos no IAL(3). Os grupos IAL(3) e IL(3) também apresentaram comprometimento funcional, restrição de ADM, aumento da rFFI/NTF e da expressão do colágeno tipo III. Outros achados observados nestes grupos foram aumento da quantidade de macrófagos no tecido e de distrofina. As anormalidades relativas aos parâmetros da marcha e as alterações morfológicas geradas pela imobilização mostraram melhora no grupo IAL(10). A remobilização associada ao alongamento durante dez dias mostrou significativa efetividade na reversão das anormalidades musculoesqueléticas induzidas pelo desuso, especialmente nas variáveis funcionais. / The interface between sarcolemma and extracellular matrix in skeletal muscle tissue is constituted by specialized proteins that are responsible for the transversal and longitudinal forces transmission to the myofiber. Skeletal muscle adaptations to physiological and pathological forces, such as segmental immobilization and rehabilitation exercises, may contribute to cellular perception of mechanical signals and consequently induce alterations related to flexibility and muscular force. This study investigated the tissue responses of the soleus muscle in female rats caused by longitudinal stress induced by the association of passive stretching training with the free movement after immobilization of the right hind limb. The right hind limbs of female rats were immobilized during 10 days in a plantar flexion in order to keep the soleus muscle in a shortened position. After the immobilization, the animals were submitted to intermittent passive manual stretching. The animals gait was functionally analyzed before immobilization and during the period of stretching or free movement. Ninety-six adult female Wistar rats were divided into 8 groups: Immobilized (I); Immobilized and stretched for 1 day (IS(1)); Immobilized and stretched for 3 days (IS(3)); Immobilized and stretched for 10 days (IS(10)); Immobilized and free for 1 day (IF(1)); Immobilized and free for 3 days (IF(3)); Immobilized and free for 10 days (IF(10)); Immobilized control (C(Immob)). After the experimental period, the soleus muscle was removed, frozen and further processed by Hematoxylin-eosin stain; immunohistochemistry reactions for fibronectin, types I and III collagen; imunofluorescence of laminin, dystrophin and macrophages; western blot of dystrophin and laminin. Qualitative and quantitative results were obtained using a Light Microscope and a system of image analysis. The between- and within-group data were analyzed using Mixed-Effects Linear Models. After the immobilization, the animals presented loss of body weight and alterations in size and shape of the fibers. Furthermore, the hypokinesia changed the functional variables of gait, reduced the dorsiflexion range of motion (ROM), increased the intracellular fibronectin/total number of fibers ratio (FIF/TNFr), the expression of dystrophin, of laminin and of the types I and III collagen. After three days of remobilization, the morphological changes were exacerbated: intense cellularity, nuclear centralization, inclusion bodies and necrosis. These findings showed increased in the IS(3). The groups IS(3) and IF(3) also showed functional impairment, ROM restriction, increased FIF/TNFr and immunoreactivity of the type III collagen. Others findings observed in these groups were increase of the amount of macrophages in the tissue and of dystrophin. The abnormalities related to gait parameters and the morphological changes induced by immobilization were improved in the IS(10) group. The remobilization using stretching for ten days showed significant effectiveness and reverted the skeletal muscle abnormalities induced by disuse, especially concerning the functional variables.

Frente ao treinamento físico, o organismo está sujeito a alterações anatomofisiológicas em vários sistemas, especialmente o sistema músculo-esquelético. Pretendeu-se, descrever alterações no trofismo muscular do sóleo e das propriedades mecânicas das tíbias de ratos submetidos a treinamento físico em esteira rolante (TFER), bem como analisar estas relações com o tempo de treinamento. Utilizou-se de 40 ratos (20 treinados e 20 controles) da linhagem Wistar, treinados 60 min/dia, 5 dias por semana, durante 3, 6, 9 e 12 semanas, totalizando 8 grupos de 5 ratos cada. Os grupos controles foram submetidos aos mesmos procedimentos experimentais, com exceção da aplicação do treinamento físico. Após o sacrifício, o tecido muscular foi retirado unilateralmente, congelado e, posteriormente foram corados pela técnica de Hematoxilina e Eosina, para análise das áreas das fibras musculares. Para análise das propriedades mecânicas, 80 tíbias (direita e esquerda) foram medidas e pesadas e, posteriormente, realizados os ensaios de flexão em três pontos para obtenção das propriedades de carga máxima e rigidez. Após aplicação do teste ANOVA, quando comparados os grupos treinados (T) e não treinados (NT) encontramos que o TFER altera, significantemente (p < 0,05), e de maneira crescente com o tempo de treinamento, as características de hipertrofia muscular e as propriedades mecânicas de flexão das tíbias dos ratos treinados / Facing the physical training, the agency is subject of alterations anatomophysiological in several systems, specially the muscle and bone system. It is intended, to describe alterations of muscle trophy of the soleus and of the mechanical properties of the rat tibia submitted to physical training in rolling mat (PTRM), as well as like analyze these relations with the time of training. It was used 40 rats (20 training and 20 controls) of the lineage Wistar, coached 60 min/day, 5 days/week, during 3, 6, 9 and 12 weeks, totalling up to 8 groups of 5 each rats. The groups controls were submitted to the same experimental procedures, with exception of the application of the physical training. After the sacrifice, the muscle weave was withdrawn unilaterally, frozen and, subsequently were paintting by the technical one of Hematoxilina and Eosina, for analysis of the areas of the muscle fibers. For the analysis of the mechanical properties, 80 tibia (right and left) were measured and weighted and, subsequently, carried out the attempt of inflection in three points bending to obtain of the properties of maximum load and module of Young. After application of the test ANOVA, when compared the groups training (T) and controls (C) we found that the PTRM alters, significantly (p < 0,05), and going up with the time of training, the characteristics of muscle hypertrophy and the mechanical properties of inflection of the tibia of the rats training

A proposta deste trabalho é a padronização do método de eletroporação direta (utilizando eletrodos) em músculo sóleo de ratos wistar. Deste processo físico, pudemos variar a voltagem, o número de pulsos e duração do pulso. O objetivo principal foi à busca de um parâmetro ideal onde deveria haver a menor lesão tecidual com a maior quantidade de expressão do GFP. Métodos de análise (fluorescência e histologia) foram utilizados para a determinação da eficiência de transferência de genes, onde se considerou a razão entre as fibras musculares sadias emissoras fluorescência e o número total de fibras sadias. Como resultado, atingimos a taxa de eficiência de (50,3 ± 20%) em transferência de genes, utilizando a voltagem de 25 V, trem de 8 pulsos com duração de 20ms e freqüência de 1Hz. A possibilidade de interferir na função deste músculo abre a perspectiva de se estudar o papel de certos genes na plasticidade muscular esquelética, especialmente no crescimento muscular longitudinal. / The use of electrical pulses for gene transfer has been successfully used to reach significant levels of gene expression in vitro and in vivo. Therefore electroporation can be considered an important device to get further insight on biological mechanisms and also to treatment. The aim of the present work is to achieve a high level of gene transfer throughout electroporation in the soleus muscle of Wistar rats. The muscle was surgically accessed, injected with Hyaluronidase and subsequently injected with a plasmid expressing GFP (Green Fluorescence Protein). Observation of fluorescence produced in situ and also HE (Hematoxilin-eosin) preparations revealed that the best gene transfer efficiency (50, 3 ± 20%) was achieved with 25 V and 8 pulses (1Hz) lasting 20ms. These results point to a potential use of electroporation as a tool for investigating cellular and molecular aspects of skeletal muscle plasticity, especially those that can be approached only in soleus muscle, such as longitudinal growth.

Frente ao treinamento físico, o organismo está sujeito a alterações anatomofisiológicas em vários sistemas, especialmente o sistema músculo-esquelético. Pretendeu-se, descrever alterações no trofismo muscular do sóleo e das propriedades mecânicas das tíbias de ratos submetidos a treinamento físico em esteira rolante (TFER), bem como analisar estas relações com o tempo de treinamento. Utilizou-se de 40 ratos (20 treinados e 20 controles) da linhagem Wistar, treinados 60 min/dia, 5 dias por semana, durante 3, 6, 9 e 12 semanas, totalizando 8 grupos de 5 ratos cada. Os grupos controles foram submetidos aos mesmos procedimentos experimentais, com exceção da aplicação do treinamento físico. Após o sacrifício, o tecido muscular foi retirado unilateralmente, congelado e, posteriormente foram corados pela técnica de Hematoxilina e Eosina, para análise das áreas das fibras musculares. Para análise das propriedades mecânicas, 80 tíbias (direita e esquerda) foram medidas e pesadas e, posteriormente, realizados os ensaios de flexão em três pontos para obtenção das propriedades de carga máxima e rigidez. Após aplicação do teste ANOVA, quando comparados os grupos treinados (T) e não treinados (NT) encontramos que o TFER altera, significantemente (p < 0,05), e de maneira crescente com o tempo de treinamento, as características de hipertrofia muscular e as propriedades mecânicas de flexão das tíbias dos ratos treinados / Facing the physical training, the agency is subject of alterations anatomophysiological in several systems, specially the muscle and bone system. It is intended, to describe alterations of muscle trophy of the soleus and of the mechanical properties of the rat tibia submitted to physical training in rolling mat (PTRM), as well as like analyze these relations with the time of training. It was used 40 rats (20 training and 20 controls) of the lineage Wistar, coached 60 min/day, 5 days/week, during 3, 6, 9 and 12 weeks, totalling up to 8 groups of 5 each rats. The groups controls were submitted to the same experimental procedures, with exception of the application of the physical training. After the sacrifice, the muscle weave was withdrawn unilaterally, frozen and, subsequently were paintting by the technical one of Hematoxilina and Eosina, for analysis of the areas of the muscle fibers. For the analysis of the mechanical properties, 80 tibia (right and left) were measured and weighted and, subsequently, carried out the attempt of inflection in three points bending to obtain of the properties of maximum load and module of Young. After application of the test ANOVA, when compared the groups training (T) and controls (C) we found that the PTRM alters, significantly (p < 0,05), and going up with the time of training, the characteristics of muscle hypertrophy and the mechanical properties of inflection of the tibia of the rats training

No tecido muscular esquelético, a interface entre o sarcolema e a matriz extracelular é constituída por proteínas especializadas responsáveis pela transmissão de força transversal e longitudinal à miofibra. As adaptações do músculo esquelético às forças fisiológicas e patológicas, como a imobilização segmentar e exercícios de reabilitação, podem contribuir para a percepção celular dos sinais mecânicos e, consequentemente, induzir modificações na flexibilidade e na força muscular. Este estudo investigou as respostas teciduais do músculo sóleo de ratas submetido ao estresse longitudinal induzido pela associação do treinamento do tipo alongamento passivo com a livre movimentação pós-imobilização dos membros posteriores direitos. O membro posterior direito das ratas foi imobilizado por 10 dias em flexão plantar, a fim de manter o músculo sóleo em posição de encurtamento. Após a imobilização, os animais passaram por um período de alongamento passivo manual intermitente. Antes da imobilização e durante o período de alongamento e de livre movimentação, foi realizada análise funcional da marcha dos animais. Noventa e seis ratas Wistar adultas foram divididas em 8 grupos: Imobilizado (I); Imobilizado e alongado por 1 dia (IAL(1)); Imobilizado e alongado por 3 dias (IAL(3)); Imobilizado e alongado por 10 dias (IAL(10)); Imobilizado e livre por 1 dia (IL(1)); Imobilizado e livre por 3 dias (IL(3)); Imobilizado e livre por 10 dias (IL(10)); Controle do Imobilizado (C(Imob)). Após os procedimentos experimentais, o músculo sóleo foi removido e congelado, para o processamento de reação de coloração Hematoxilina-Eosina; imunoistoquímica para fibronectina, colágenos tipos I e III; imunofluorescência de laminina, distrofina e macrófagos; western blot de laminina e distrofina. Análises qualitativa e quantitativa em Microscópio de Luz e sistema de análise de imagens foram realizadas. As variáveis foram avaliadas inter- e intra-grupos pelo Modelo de Regressão Linear com Efeitos Mistos. Após a imobilização, os animais apresentaram perda de peso corporal e alterações no tamanho e formato das fibras. Ainda, a hipocinesia modificou as variáveis funcionais da marcha, reduziu a amplitude de movimento (ADM) de dorsiflexão, aumentou a relação fibras com fibronectina intracelular/número total de fibras (rFFI/NTF), a expressão de distrofina, de laminina e dos colágenos tipos I e III. Após três dias de remobilização, as alterações morfológicas estavam exacerbadas: intensa celularidade, núcleos centralizados, corpos de inclusão, necrose. Estes achados foram mais intensos no IAL(3). Os grupos IAL(3) e IL(3) também apresentaram comprometimento funcional, restrição de ADM, aumento da rFFI/NTF e da expressão do colágeno tipo III. Outros achados observados nestes grupos foram aumento da quantidade de macrófagos no tecido e de distrofina. As anormalidades relativas aos parâmetros da marcha e as alterações morfológicas geradas pela imobilização mostraram melhora no grupo IAL(10). A remobilização associada ao alongamento durante dez dias mostrou significativa efetividade na reversão das anormalidades musculoesqueléticas induzidas pelo desuso, especialmente nas variáveis funcionais. / The interface between sarcolemma and extracellular matrix in skeletal muscle tissue is constituted by specialized proteins that are responsible for the transversal and longitudinal forces transmission to the myofiber. Skeletal muscle adaptations to physiological and pathological forces, such as segmental immobilization and rehabilitation exercises, may contribute to cellular perception of mechanical signals and consequently induce alterations related to flexibility and muscular force. This study investigated the tissue responses of the soleus muscle in female rats caused by longitudinal stress induced by the association of passive stretching training with the free movement after immobilization of the right hind limb. The right hind limbs of female rats were immobilized during 10 days in a plantar flexion in order to keep the soleus muscle in a shortened position. After the immobilization, the animals were submitted to intermittent passive manual stretching. The animals gait was functionally analyzed before immobilization and during the period of stretching or free movement. Ninety-six adult female Wistar rats were divided into 8 groups: Immobilized (I); Immobilized and stretched for 1 day (IS(1)); Immobilized and stretched for 3 days (IS(3)); Immobilized and stretched for 10 days (IS(10)); Immobilized and free for 1 day (IF(1)); Immobilized and free for 3 days (IF(3)); Immobilized and free for 10 days (IF(10)); Immobilized control (C(Immob)). After the experimental period, the soleus muscle was removed, frozen and further processed by Hematoxylin-eosin stain; immunohistochemistry reactions for fibronectin, types I and III collagen; imunofluorescence of laminin, dystrophin and macrophages; western blot of dystrophin and laminin. Qualitative and quantitative results were obtained using a Light Microscope and a system of image analysis. The between- and within-group data were analyzed using Mixed-Effects Linear Models. After the immobilization, the animals presented loss of body weight and alterations in size and shape of the fibers. Furthermore, the hypokinesia changed the functional variables of gait, reduced the dorsiflexion range of motion (ROM), increased the intracellular fibronectin/total number of fibers ratio (FIF/TNFr), the expression of dystrophin, of laminin and of the types I and III collagen. After three days of remobilization, the morphological changes were exacerbated: intense cellularity, nuclear centralization, inclusion bodies and necrosis. These findings showed increased in the IS(3). The groups IS(3) and IF(3) also showed functional impairment, ROM restriction, increased FIF/TNFr and immunoreactivity of the type III collagen. Others findings observed in these groups were increase of the amount of macrophages in the tissue and of dystrophin. The abnormalities related to gait parameters and the morphological changes induced by immobilization were improved in the IS(10) group. The remobilization using stretching for ten days showed significant effectiveness and reverted the skeletal muscle abnormalities induced by disuse, especially concerning the functional variables.

A proposta deste trabalho é a padronização do método de eletroporação direta (utilizando eletrodos) em músculo sóleo de ratos wistar. Deste processo físico, pudemos variar a voltagem, o número de pulsos e duração do pulso. O objetivo principal foi à busca de um parâmetro ideal onde deveria haver a menor lesão tecidual com a maior quantidade de expressão do GFP. Métodos de análise (fluorescência e histologia) foram utilizados para a determinação da eficiência de transferência de genes, onde se considerou a razão entre as fibras musculares sadias emissoras fluorescência e o número total de fibras sadias. Como resultado, atingimos a taxa de eficiência de (50,3 ± 20%) em transferência de genes, utilizando a voltagem de 25 V, trem de 8 pulsos com duração de 20ms e freqüência de 1Hz. A possibilidade de interferir na função deste músculo abre a perspectiva de se estudar o papel de certos genes na plasticidade muscular esquelética, especialmente no crescimento muscular longitudinal. / The use of electrical pulses for gene transfer has been successfully used to reach significant levels of gene expression in vitro and in vivo. Therefore electroporation can be considered an important device to get further insight on biological mechanisms and also to treatment. The aim of the present work is to achieve a high level of gene transfer throughout electroporation in the soleus muscle of Wistar rats. The muscle was surgically accessed, injected with Hyaluronidase and subsequently injected with a plasmid expressing GFP (Green Fluorescence Protein). Observation of fluorescence produced in situ and also HE (Hematoxilin-eosin) preparations revealed that the best gene transfer efficiency (50, 3 ± 20%) was achieved with 25 V and 8 pulses (1Hz) lasting 20ms. These results point to a potential use of electroporation as a tool for investigating cellular and molecular aspects of skeletal muscle plasticity, especially those that can be approached only in soleus muscle, such as longitudinal growth.

O presente estudo analisou as mudanças e adaptações geradas pelos protocolos de alongamento e exercício excêntrico nos músculos sóleo e plantar, após 10 dias de imobilização do membro posterior de ratas em desenvolvimento pós-natal. Para isso, 45 ratas da raça Wistar, com 21 dias de idade, foram divididas em 10 grupos: grupo imobilizado (GI); grupo imobilizado e treinado excentricamente por 10 dias (GITE(10)) ou 21 dias (GITE(21)); grupo imobilizado e alongado por 10 dias (GIAL(10)) ou 21 dias (GIAL(21)); grupo anestesiado (GA); grupo controle de 21 dias de idade (GC(zero)); grupo controle do imobilizado de 31 dias de idade (GC(Imob)); grupo controle de 10 dias com 41 dias de idade (GC(10)); grupo controle de 21 dias com 52 dias de idade (GC(21)). A imobilização foi aplicada por 10 dias no membro posterior direito dos animais, a fim de manter a posição de encurtamento dos músculos sóleo e plantar. Posteriormente, as ratas do GITE(10) e GITE(21) passaram pelo período de treino excêntrico em esteira declinada, por 40 minutos. Enquanto os animais do GIAL(10) e GIAL(21) foram submetidos ao alongamento mantido por 40 minutos, através da fixação da dorsiflexão máxima permitida pelo tornozelo. Após os protocolos, os fragmentos dos músculos sóleo e plantar foram retirados e submetidos às reações histoquímica, imunoistoquímica e bioquímica. Análise qualitativa e quantitativa (isoformas de MHC, proporção de fibras, diâmetro menor e relação capilar/fibra) foram realizadas. Para análise estatística foi usado o Modelo Linear de Efeitos Mistos com nível de significância de 5% e Intervalo de Confiança de 95%. A partir da análise temporal do desenvolvimento muscular dos animais, foram observadas características de imaturidade dos músculos sóleo e plantar (fibras arredondadas, núcleos volumosos, reatividade do tecido), principalmente em animais com 21 e 31 dias de idade. Aumento progressivo do diâmetro das fibras e da relação capilar/fibra, em ambos os músculos, foram observados. O predomínio de FT1 e maior expressão da MHCI já estavam evidentes no músculo sóleo, mesmo de animais com 21 dias de idade. O músculo plantar apresentou predomínio de FT2D na análise da mATPase, e a avaliação das isoformas indicou predomínio da MHCIId e MHCIIb. O procedimento de imobilização desencadeou alta reatividade do tecido, redução do diâmetro de todos os tipos de fibras, mudança na proporção das fibras (redução de FT1 no sóleo e aumento de FT2D no plantar) e na expressão das isoformas de MHC, e queda do número de capilares transversais. A aplicação do alongamento e exercício excêntrico provocou adaptações importantes como o aumento do diâmetro das fibras, modificação da proporção das fibras e aumento da relação capilar/fibra, em ambos os músculos. Da análise morfológica, o músculo sóleo apresentou maior reatividade, quando comparado ao músculo plantar, com grande quantidade de núcleos centralizados e halo basofílico. O treino excêntrico foi capaz de intensificar as respostas hipertrófica e angiogênica, principalmente no período de 21 dias de reabilitação. Portanto, o desenvolvimento muscular normal foi acompanhado por adaptações importantes que correspondem ao avançar da idade juntamente com o aumento da demanda funcional nessa fase. O dispositivo de imobilização foi eficaz para promover o desuso e encurtamento dos músculos avaliados. Diferenças nítidas entre a resposta adaptativa dos músculos sóleo e plantar são observadas em ambos os protocolos de reabilitação no animal bebê. / This study analyzed changes and adaptations in the soleus and plantar muscles induced by stretching and eccentric exercise protocols applied after 10 days immobilization of the hindlimb in developing female rats. Fortyfive Wistar female rats, 21 days old, were divided into 10 groups: Immobilized (IG); Immobilized and trained eccentrically for 10 days (IEG(10)) or 21 days (IEG(21)); Immobilized and stretched for 10 days (ISG(10)) or 21 days (ISG(21)); Anesthetized (AG); Control, 21 days old (CG(zero)); Control of immobilized group, 31 days old (CG(Immob)); Control group of 10 days, 41 days old (CG(10)) or 21 days, 52 days old (CG(21)). The animals had the right hindlimb immobilized for 10 days keeping the soleus and plantar mucles in a shortened position. Rats in the IEG(10) and IEG(21) groups were further submitted to eccentric training in a declining threadmill for 40 minutes, while the ones in groups ISG(10) and ISG(21) were stretched for 40 minutes by fixing the maximum ankle dorsiflexion. Fragments of the soleus and plantar muscles were removed and analyzed by histochemical, immunohistochemical and biochemical assays, after sacrifice of the animals. Qualitative and quantitative analysis were made of Myosin Heavy-Chain (MHC) isoforms, fiber proportion, minimum diameter and capillary/fiber ratio. Data was statistically analyzed by the method of Mixed Effects Linear Models with a significance level of 5% and confidence interval of 95%. Temporal analysis of muscle development suggested immaturity of soleus and plantar muscles (rounded fibers, voluminous nuclei and tissue reactivity) specially in animals aged from 21-31 days. Progressive increase of fiber diameter and the capillary/ fiber ratio was also observed. Predominance of FT1 fibers and higher MHCI expression were already evident in the soleus muscle even in 21 days old animals. Analysis of mATPase showed that FT2D fibers were predominant in the plantar muscle as were the isoforms MHCIId and MHCIIb. Immobilization produced high tissue reactivity, diameter reduction in all fiber types, changes in fiber proportion (reduction of FT1 in the soleus and increase of FT2D numbers in the plantar muscles) and MHC isoform expressions and decreased number of transversal capillars. Both, stretching and eccentric exercises induced important adaptations like increased fiber diameter, modified fiber proportions and increased capillary/ fiber ratios in the soleus and plantar muscles. Morphological analysis indicated that the soleus was more reactive as compared to the plantar muscle, showing large quantities of centralized nuclei and a basophilic halo. Eccentric training induced greater hypertrophic and angiogenic responses, specially during the 21 days rehabilitation. Thus, normal muscular development in this phase was accompanied by major adaptations, which correspond to advancing age and increased functional demand. The immobilization apparatus was efficient in preventing use and promoting shortening of the muscles evaluated. Sharp differences between adaptive responses of soleus and plantar muscles were observed in both rehabilitation protocols applied to baby animals.