Ein Großteil der Lebensmittel wird in der heutigen Zeit vor allem aufgrund ihrer langen Haltbarkeit in Konservendosen verpackt. Zur Qualitätserhaltung des Lebensmittels werden Weißblechdosen im Innenbereich in der Regel mit einer Lackierung versehen. Lackrohstoffe sind dabei u. a. Phenol- und Epoxidharze, die als Basis- oder Vernetzerkomponente eingesetzt werden. Bei der Herstellung und Lagerung dieser Lebensmittel kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass es zur Migration von Bestandteilen aus der Kunststoffinnenbeschichtung in das Füllgut kommt. Toxikologisch und somit auch analytisch sind dabei vor allem die migrierenden Verbindungen unter 1000 Da von Interesse, da Substanzen mit einer Molmasse von über 1000 Da nur zu weniger als 1 % im Gastrointestinaltrakt absorbiert werden. Analytik von phenolischen Verbindungen Bei Untersuchungen zur Migration phenolischer Verbindungen unter Verwendung verschiedener Modellcoatings und Simulanzlösemittel wurden Konzentrationen an migrierenden phenolischen Substanzen in Summe bis 160 µg/dm² bestimmt, womit dieser Gehalt deutlich unter dem gesetzlichen Grenzwert für die Gesamtmigration von 10 mg/dm² liegt. Die Quantifizierung erfolgte dabei über SEC-FLD-Kalibriergeraden der für diese Coatings verwendeten Phenolharze. Tendenziell steigt dabei die Menge an übergehenden Verbindungen mit abnehmender Polarität der verwendeten Simulanzien. Ebenso abhängig vom Lösungsmittel ist die Molekulargewichts¬verteilung der im Migrat enthaltenen Phenole. So zeigte sich eine deutliche Verschiebung der phenolischen Verbindungen zu höheren Molekulargewichten mit abnehmender Polarität der Simulanzlösemittel. Mit wenigen Ausnahmen besitzen jedoch alle migrierenden Substanzen eine Molmasse von unter 1000 Da. Das beobachtete Migrationsverhalten kann u. a. auf die unterschiedliche Reaktivität der phenolischen Basismonomere der Harze zurückgeführt werden, wodurch die Fähigkeit variiert, unter den Einbrennbedingungen ein ausgeprägtes Netzwerk zu bilden. Zur näheren Charakterisierung der Phenolharze wurden einzelne Hauptverbindungen der RP-HPLC-FLD-Chromatogramme identifiziert. Über Derivatisierungsreaktionen mit Picolinsäure, Essigsäureanhydrid sowie Dansylchlorid konnten Informationen zur Anzahl an alkoholischen und phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül erhalten werden. Mit dem Wissen um die eingesetzten Phenolmonomere und einer eventuellen Veretherung konnten Strukturvorschläge erstellt werden. Die Quantifizierung der migrierenden phenolischen Verbindungen in Migraten kommerzieller Coatings in Summe wurde über eine universell anwendbare Kalibrierung angestrebt. Dazu wurden 17 verschiedene Phenolharze bezüglich der Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden, des mittleren Molekulargewichtes, der Hydroxylzahl und dem Verhältnis OH-Gruppen/Molekül charakterisiert. Wie erwartet steigt mit wenigen Ausnahmen die Anzahl der OH-Gruppen im Molekül tendenziell mit dem mittleren Molekulargewicht. Es zeigte sich zudem, dass die verschiedenen Phenolharze in ihren fluorophoren Eigenschaften stark variieren. Die Steigung der SEC-FLD-Kalibriergeraden konnte zudem in keine Korrelation mit einem anderen ermittelten Parameter gebracht werden. Die Anwendung einer universellen Kalibriergerade zur Quantifizierung war deshalb nicht möglich. Die Größenordnungen der Migratkonzentrationen konnten daher nur über die zwei im Anstieg am stärksten variierenden SEC-FLD-Kalibriergeraden abgeschätzt werden. Bei der Analyse kommerzieller Epoxy-Phenol-Coatings war im Gegensatz zu Polyester-Phenol-Coatings die isolierte Detektion der phenolischen Verbindungen im Migrat mittels Fluoreszenz nicht möglich, da sowohl Epoxide als auch Phenole fluorophorer Eigenschaft besitzen. Es wurde daher eine Methode zur Abtrennung der Phenole von anderen im Migrat enthaltenen Subtanzen auf Basis eines Anionenaustauschermaterials entwickelt. Dabei wurde die Eigenschaft der Phenole genutzt, im basischen Milieu Phenolate zu bilden. Diese, aber auch Säuren adsorbieren am Austauschermaterial, während Epoxide oder Polyester nicht retardiert werden. Für zwei kommerzielle Epoxy-Phenol-Coatings konnte somit der Anteil an phenolischen Verbindungen im Migrat zu 7 und 28 % bestimmt werden. Mittels RP-HPLC/ESI-MS war es möglich, einige der phenolischen Verbindungen in diesen Migraten zu identifizieren. Dabei handelt es sich um nichtepoxidierte BPA-Derivate der Epoxidkomponente des Coatings, die aufgrund des BPA-Grundkörpers eine phenolische Hydroxylgruppe besitzen. Phenolische Vernetzungsprodukte beider Basisharze konnten dagegen nicht identifiziert werden. Die Menge an migrierenden phenolischen Verbindungen der beiden Epoxy-Phenol-Coatings konnte über die Kalibration eines niedermolekularen Epoxidharzes zu 0,1 mg/dm² bzw. 0,27 mg/dm² abgeschätzt werden. Während für einzelne phenolische Verbindungen gesetzliche Grenzwerte für die Migration bestehen, gibt es für Oligomere, mit Ausnahme von BPA keine spezifischen Migrationslimits. Ebenso sind in der Literatur kaum toxikologische Untersuchungen zu Phenololigomeren zu finden. Um einen ersten Einblick in die toxikologische Relevanz migrierender phenolischer Verbindungen zu erhalten, wurden mehrere kommerzielle als auch selbst synthetisierte phenolische Standardsubstanzen und verschiedene Molekulargewichtsfraktionen eines Phenolharzes, im Fischembryotest an Eiern des Zebrabärblings (Brachydanio rerio) nach DIN 38415-T647 und/oder Neutralrottest an Hep-G2 und HT-29 Zellen untersucht. Die stärksten Effekte im Fischembryotest bewirkte das Trimer BPM, hier reichte bereits eine Konzentration von etwa 2 mg/l aus, um 50 % der Fischembryonen letal zu schädigen. Im Gegensatz dazu waren beim Dimer 5-Hydroxymethyl-2,4´-dihydroxydiphenylmethan (M 230) mit einem EC50-Wert von 170 mg/l die geringste toxikologische Wirkung zu beobachten. Für alle anderen Subtanzen konnten EC50-Werte im Bereich 20 - 100 mg/l bestimmt werden. Tendenziell zeichnete sich dabei eine Zunahme der EC50-Werte mit steigender Lipophilie, ausgedrückt über den KOW-Wert ab, was auf den Aufbau der Fischeier zurückzuführen ist. So müssen die zu untersuchenden Xenobiotika mehrere lipophile Membranen durchdringen, um am eigentlichen Wirkungsort Einfluss auf die Embryonalentwicklung nehmen zu können. Im Zelltest konnten tendenziell ähnliche Ergebnisse ermittelt werden wie im Fischembryotest, wobei in der Regel die Hep-G2 Zellen empfindlicher reagieren als die HT-29 Zellen. Während für Phenol im untersuchten Konzentrationsbereich keine toxischen Effekte beobachtet werden konnten, liegen die EC50-Werte für das Trimer BPM, analog zum Fischembryotest deutlich unter 10 mg/l. Für die anderen Verbindungen wurden EC50-Werte zwischen 16 und 100 mg/l bestimmt. Analog zu den Untersuchungen der Einzelsubstanzen zeigte sich auch bei den 5 untersuchten Molekulargewichtsfraktionen zwischen 0 und 1000 Da, dass das toxikologische Potential im niedermolekularen Bereich (0 - 200 Da) gegenüber den Fraktionen 200 400 und 400 600 Da vergleichsweise gering ist. Bereits 25,1 mg/l bzw. 17,3 mg/l der Fraktionen 200 400 Da und 400 600 Da waren in den Tests ausreichend, um alle Embryonen letal zu schädigen. Im Molekulargewichtsbereich über 600 Da konnten dagegen lediglich subletale oder gar keine Missbildungen beobachtet werden. Analytik von Epoxiden In der amtlichen Überwachung beschränkt sich die Analytik von Epoxidverbindungen bisher auf die Bestimmung rechtlich geregelter Einzelsubstanzen. Eine Summenmethode zur Erfassung aller in einem Migrat enthaltenen Substanzen mit reaktionsfähigen Oxirangruppen, wodurch das gesamte Reaktionspotential erfasst werden kann, liegt dagegen nicht vor. Zur selektiven Erfassung aller oxirangruppenhaltigen Verbindungen wurde daher mittels statistischer Versuchsplanung eine Derivatisierung mittels Cysteamin entwickelt. Die Reaktion mit Cysteamin erfolgt dabei nach Abtrennung der Substanzen > 1000 Da mittels Größenausschlusschromatographie. Im Anschluss werden die Derivate durch Zugabe eines Kationenaustauschers aus der Lösung entfernt. Durch den Vergleich der RP-HPLC-FLD Chromatogramme vor und nach der Aufarbeitung können Substanzen mit intakten Oxirangruppen somit einfach erkannt werden. Eine quantitative Abschätzung der enthaltenen Epoxidverbindungen ist bei Lacken auf Basis von BPA-Harzen über die BPA-Chromophorkonzentration möglich. Bei der Untersuchung von 5 kommerziellen Coatings wurden in den einzelnen Migraten recht unterschiedliche Gehalte an Substanzen mit intakten Epoxidgruppen ermittelt. Ebenso ist die Anzahl der oxriangruppenhaltigen Verbindungen, auf die sich dieser Gehalt verteilt sehr unterschiedlich, was möglicherweise an unterschiedlichen Einbrennzeiten, -temperaturen aber auch der Menge an Lack pro m² und an der Art und Menge des Reaktionspartners liegt. Für die Konzentration der epoxidischen Verbindungen in den Coatingmigraten wurden Werte zwischen 18,5 und 835 µg/dm² bestimmt. Dies entspricht einem Anteil der reaktionsfähigen Substanzen an der Fraktion unter 1000 Da berechnet über die Flächen im Chromatogramm zwischen 2,6 und 76,3 %. Neben dem Einsatz als Basismaterial für Konservendoseninnenbeschichtungen werden Epoxidharzsysteme auch in Zubereitungen wie Grundierungen, Füllmassen, Lacken oder Klebstoffen für die Bauchemie vielfach in verschiedenen Mischungen (aromatische, aliphatische oder cycloaliphatische Glycidylether bzw. Siloxanglycidylether) eingesetzt. Durch den Kontakt dieser Materialien mit der Haut kann es zu Kontaktekzemen kommen, deren Ursache durch Epikutantests (Patchtests) mit den potentiell auslösenden Substanzen ermittelt werden kann. Der Umfang der in den Standardtestsystemen enthalten Testsubstanzen entspricht dabei jedoch nicht dem Spektrum der in der Industrie verwendeten Materialien. Über die genaue Zusammensetzung der in den Patchtest´s eingesetzten Materialien ist zudem wenig bekannt. Durch die Analyse einer Vielzahl von Patchtestsubstanzen und industriellen Epoxidkomponenten mittels RP-HPLC/UVD bzw. -ELSD Chromatographie und die Identifizierung der enthaltenen Verbindungen über RP-HPLC/ESI-MSD, konnte ein genaueres Bild über den Charakter dieser Materialen gewonnen werden. Bei den BPA- und BPF-Harzen wurden überwiegend Monomere, die entsprechenden Di- und Trimere aber auch dessen hydrolysierte Verbindungen identifiziert. Im Gegensatz dazu liegen bei den analysierten aliphatischen Produkten z. T. die reinen Glycidylether gar nicht oder nur in geringen prozentualen Anteilen vor. Vielmehr wird durch die sauer geführte Reaktion bei den aliphatischen Verbindungen die Bildung von 1,3 Chlorhydrinen als Nebenreaktion zur 1,2 Chlorhydrinbildung gefördert, wodurch eine beträchtliche Menge an Substanzen, die nicht verseifbares Chlor enthalten, in den Materialien vorhanden ist. Um die enthaltenen Verbindungen von aliphatischen und cycloaliphatischen Epoxidzubereitungen quantifizieren zu können, wurde eine Derivatisierung mit einem selbst synthetisierten Fluorophor (5-(Dimethylamino)-N-(2-mercaptoethyl)-1-naphthalen-sulfonamid) entwickelt. Dadurch konnten auch Verbindungen erfasst werden, die aufgrund ihrer Flüchtigkeit mittels ELSD nicht detektierbar waren. Bei der Analyse von Handelsprodukten zeigte sich, dass die einzelnen Komponenten in ihrer Zusammensetzung gut mit den untersuchten aromatischen und aliphatischen Rohmaterialien vergleichbar sind. Bei entsprechend eingesetzten Patchtestsubstanzen spiegeln diese somit die Produkte gut wieder, mit denen die Patienten in Kontakt kommen.

Le présent projet vise à documenter la nécessité d’augmenter notre connaissance de la présence des contaminants organiques tels que les médicaments dans l’environnement et d’évaluer leur devenir environnemental. On a étudié la présence de composés pharmaceutiques dans différents échantillons d'eau. On a focalisé nos efforts spécialement sur les échantillons d'eau de l'usine d'épuration de la Ville de Montréal et ses effluents, les eaux de surface avoisinantes et l’eau du robinet dans la région de Montréal. Pour ce faire, on a tout d’abord développé deux méthodes analytiques automatisées basées sur la chromatographie liquide avec extraction en phase solide (SPE) couplée à la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). On a également étudié les performances des trois techniques d'ionisation à pression atmosphérique (API), pour ensuite les utiliser dans la méthode analytique développée. On a démontré que l'ionisation par électronébulisation (ESI) est une méthode d'ionisation plus efficace pour l'analyse des contaminants pharmaceutiques dans des échantillons de matrices très complexes comme les eaux usées. Une première méthode analytique SPE couplée à la LC-MS/MS a été développée et validée pour l'étude des échantillons complexes provenant de l'usine d'épuration de la Ville de Montréal et des eaux de surface près de l'usine. Cinq médicaments de prescription ont été étudiés: le bézafibrate (un régulateur de lipides), le cyclophosphamide et le méthotrexate (deux agents anticancéreux), l'orlistat (un agent anti-obésité) et l’énalapril (utilisé dans le traitement de l'hypertension). La plupart de ces drogues sont excrétées par le corps humain et rejetées dans les eaux usées domestiques en faisant par la suite leur chemin vers les usines municipales de traitement des eaux usées. On a pu démontrer qu'il y a un faible taux d’élimination à l'usine d'épuration pour le bézafibrate et l'énalapril. Ces deux composés ont aussi été détectés dans les eaux de surface sur un site à proximité immédiate de la décharge de l’effluent de la station d'épuration. i En observant la nécessité de l'amélioration des limites de détection de la première méthode analytique, une deuxième méthode a été développée. Pour la deuxième méthode, un total de 14 contaminants organiques, incluant trois agents anti-infectieux (clarithromycin, sulfaméthoxazole et triméthoprime), un anticonvulsant (carbamazépine) et son produit de dégradation (10,11-dihydrocarbamazépine), l'agent antihypertensif (enalapril), deux antinéoplastiques utilisés en chimiothérapie (cyclophosphamide et méthotrexate), des herbicides (atrazine, cyanazine, et simazine) et deux produits de transformation de l’atrazine (deséthylatrazine et déisopropylatrazine) ainsi qu’un agent antiseptique (triclocarban). Ces produits ont été quantifiés dans les eaux de surface ainsi que dans l’eau du robinet. L'amélioration des limites de détection pour cette méthode a été possible grâce à la charge d'un volume d'échantillon supérieur à celui utilisé dans la première méthode (10 mL vs 1 mL). D'autres techniques de confirmation, telles que les spectres des ions produits utilisant une pente d’énergie de collision inverse dans un spectromètre de masse à triple quadripôle et la mesure des masses exactes par spectrométrie de masse à temps d’envol, ont été explorées. L'utilisation d'un analyseur de masse à temps d’envol a permis la confirmation de 6 des 14 analytes. Finalement, étant donné leur haute toxicité et pour évaluer leur persistance et leur transformation au niveau du traitement des eaux potables, la cinétique d'oxydation du cyclophosphamide et de méthotrexate avec l'ozone moléculaire et des radicaux OH a été étudiée. Les constantes de dégradation avec l'ozone moléculaire ont été calculées et la qualité de l'eau après traitement a pu être évaluée. Le rendement du processus d'ozonation a été amélioré pour la cyclophosphamide dans les eaux naturelles, en raison de la combinaison de réactions directes et indirectes. Cette étude a montré que l'ozone est très efficace pour oxyder le méthotrexate mais que le cyclophosphamide serait trop lent à s’oxyder pour un traitement efficace aux conditions usuelles de traitement de l’eau potable. / This project aims to document the need to increase our knowledge of organic contaminants such as pharmaceuticals in the environment and to assess their environmental fate. We studied the presence of pharmaceutical compounds in different water samples. We studied their presence in wastewater samples from the treatment plant of the City of Montreal, effluents, surface and tap water. To do this we developed two analytical methods based on solid phase extraction (SPE) coupled to liquid chromatography -tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). . The performance of three atmospheric pressure ionization (API) techniques was also studied for their subsequent use in the developed method. It was demonstrated that electrospray ionization (ESI) is a more effective ionization method for the analysis of pharmaceutical contaminants in samples as complex as wastewaters. A first analytical LC-MS/MS method, was developed and validated for the investigation of samples from the wastewater treatment plant and surface waters near the plant of Montreal. Five prescription drugs were studied: bezafibrate (lipid regulator), cyclophosphamide, and methotrexate (two anticancer agents), orlistat (an anti-obesity agent) and enalapril used in the treatment of hypertension. Most of these drugs are excreted by the human body in high percentages and released into domestic wastewaters, making their way to the municipal wastewater treatment plants. It was demonstrated that there is a low rate of elimination at the wastewater treatment plant for bezafibrate and enalapril. These two compounds were also detected in surface waters on a site close to the discharge of the treatment plant effluents. For this first analytical method we observed the necessity of improvement of the detection limits of the method. A second method was then developed to improve the detection limits and to study a total of 14 organic contaminants, including three antiinfective agents (clarithromycin, sulfamethoxazole and trimethoprim), an anticonvulsant (carbamazepine) and its degradation product 10,11-dihydrocarbamazepine, the iii antihypertensive agent (enalapril), two antineoplastic (methotrexate and cyclophosphamide), herbicides (atrazine, cyanazine, and simazine) and two transformation products of atrazine (desethylatrazine and déisopropylatrazine) and an antiseptic agent (triclocarban). These products were quantified in surface water and tap water. The improvement of the detection limits of this method was possible due to the loading of a greater sample volume than that used in the first method (10 mL vs 1 mL). Other confirmation techniques, such as the data-dependent reverse energy ramp scan on a triple quadrupole and accurate mass measurements on a time-of-flight mass spectrometer were explored. Using time-of-flight mass spectrometer determinations allowed the confirmation of six of the 14 analytes. Finally, due to their toxic properties, the oxidation kinetics of cyclophosphamide and methotrexate with molecular ozone and OH radicals was studied in bench scale. The degradation constants with molecular ozone were calculated and the water quality after treatment was assessed. The overall process performance was improved for cyclophosphamide in natural waters, due to the combination of direct and indirect reactions. The study showed that ozone is very effective for the oxidation of methotrexate, but cyclophosphamide is too slowly oxidized for an effective drinking water treatment under usual conditions.

Neuf maladies neurodégénératives sont le produit de l’expression de gènes mutés, dans lesquels le codon CAG est répété au-delà d’un seuil pathologique. Ceci produit des protéines mutantes dans lesquelles sont insérés des segments de polyglutamines (polyGln), qui perdent leur activité et acquièrent une nouvelle fonction, ce qui est toxique pour le neurone. Ces altérations sont attribuables aux propriétés particulières de la polyGln. En effet, ces dernières possèdent la capacité de s’assembler pour former des corps d’inclusion intracellulaires. Cette propension à l’agrégation de la polyGln rend difficile l’étude de ces pathologies. C’est ainsi que l’utilisation de peptides peut s’avérer une approche avantageuse. Toutefois, la synthèse de polyGln est associée à de nombreuses délétions et nécessite l’ajout de groupements chargés afin de permettre leur purification. Cependant, ce prérequis donne lieu à des interactions électrostatiques qui biaisent la structure et la cinétique d’agrégation de ces peptides, en plus d’interférer avec l’évaluation d’éventuels agents thérapeutiques. L’objectif du projet est de développer un système permettant l’étude de la polyGln en s’affranchissant des effets de charges. Pour ce faire, deux approches ont été explorées, la première utilise la polyGln non chargée et la seconde utilise une structure polyGln-morpholine ayant des charges labiles en fonction du pH. Ces peptides ont été produits en utilisant une approche linéaire de synthèse peptidique sur support solide avec protection maximale des chaînes latérales. La purification a été effectuée par chromatographie de haute performance en phase inverse en milieu acide. Ces stratégies ont permis de produire des peptides de polyGln de grande pureté avec des rendements acceptables. Une procédure de solubilisation des peptides alliant sonication et lyophilisation a été développée afin d’étudier chacun de ces peptides à l’aide de diverses techniques physicochimiques, telles que la diffusion de la lumière, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, Raman et UV-visible, le dichroïsme circulaire et la microscopie optique polarisée. La polyGln non chargée solubilisée dans le trifluoroéthanol-eau a montré que la taille des particules et la vitesse d’agrégation sont proportionnelles à la fraction volumique en eau. De plus, la structure secondaire en solution est à prédominance alpha et semble être peu sensible à la fraction d’eau jusqu’à un certain seuil (25%) après lequel la structure aléatoire prédomine. L’analyse des agrégats à l’état solide montre des structures hélicoïdales > aléatoires et ont les caractéristiques des fibrilles amyloïdes. Le peptide de polyGln-morpholines a un pKa de 7,3 en milieu aqueux. Il demeure en solution lorsque le pH < pKa et à faible force ionique, alors qu’il s’autoassemble lorsque ces conditions ne sont pas respectées. Ceci suggère que la répulsion électrostatique est responsable de la stabilisation du peptide en solution. La dimension fractale nous indique que le peptide forme des agrégats compacts dont les constituants ont une taille de 2,5 nm, compatibles avec une conformation aléatoire compacte, en coude bêta ou hélicoïdale. Ceci est en accord avec l’étude structurale des peptides en solution qui a montré des espèces aléatoires > bêta > alpha. De plus, en RMN, l’élargissement des signaux du 1Hγ en cours d’agrégation suggère une interaction via les chaînes latérales. Les analyses en phase solide ont plutôt montré une prédominance de structures bêta et alpha. L’inhibition de l’agrégation à pH 8 varie selon rouge de Congo > tréhalose, alors que le peptide liant la polyGln 1 et la thioflavine T ne semble pas avoir d’effet. Ces approches ont donc permis pour la première fois de s’affranchir des effets de charges auparavant inhérents à l’étude de la polyGln en solution et par conséquent d’obtenir des informations inédites quant à la solubilité, la structure et la cinétique d’agrégation. Enfin, le dispositif à charges labiles permet d’évaluer l’efficacité d’éventuels agents thérapeutiques à pH quasi physiologique. / Nine neurodegenerative diseases come from mutated genes expression in which the CAG codon is repeated above a pathological threshold. This is producing mutant proteins, in which are inserted polyglutamine (polyGln) segments, which lose their activity and acquire a new function that is toxic for the neuron. These alterations are related to the peculiar properties of the polyGln. Indeed, these polypeptides have the capacity of autoassemble to form intracellular inclusion bodies. This aggregation tendency of polyGln makes difficult the study of these pathologies. Thus, the use of peptides could constitute an advantageous approach. However, the synthesis of polyGln is associated with numerous deletions and necessitates the addition of charged moieties to achieve purification. Unfortunately, this requirement creates electrostatic interactions that modify the structure and aggregation kinetics of these peptides, in addition to interfering with the evaluation of potential therapeutical agents. The aim of this project is to develop a system to study polyGln without the charge effects. To do so, two approaches were explored, the first used uncharged polyGln and the second used a polyGln-morpholine structure bearing pH-dependent labile charges. These peptides were produced by solid-support synthesis using a linear and maximal protection approach. Purification was performed by reverse phase high-performance liquid chromatography. These strategies allowed the production of peptides of high purity in good yields. A solubilization procedure combining sonication and lyophilization was developed to study each of these peptides by physicochemical techniques such as light scattering, magnetic resonance, Raman and UV-visible spectroscopies, circular dichroism and polarized optical microscopy. The uncharged polyGln solubilized in trifluoroethanol-water showed that particle size and aggregation kinetics are proportional to volumetric water fraction. Furthermore, the secondary structure in solution is alpha-predominant and seems rather insensitive to water fraction up to a threshold (25%) above which random coil structure predominates. The analysis of solid-state aggregates showed that helicoidal structures are more abundant than random structures and have the characteristics of amyloid fibrils. The polyGln-morpholines peptide has a pKa of 7.3 in aqueous media. It is soluble when pH < pKa and at low ionic strength, but it autoassociates when these conditions are not respected. This suggests that electrostatic repulsion is responsible for the stabilization of the peptide in solution. The fractal dimension indicates that the peptide forms compact aggregates whose constituents are 2.5 nm in size, in agreement with compact random coil, beta-hairpin or helicoidal structures. This is in agreement with the results of solution peptide structure studies showing that random coil > beta > alpha. Furthermore, the broadening of 1Hγ NMR signals while the peptide is aggregating suggests an interaction between side-chains. Solid-phase studies showed predominant beta and alpha structures. The aggregation inhibition at pH 8.0 was higher for Congo red than for trehalose, while polyglutamine binding peptide 1 and thioflavine T did not seem to be effective. These approaches permitted for the first time to overcome the charge effects that were previously inherent to polyGln solution studies and to obtain new information about solubility, structure and aggregation kinetics. Finally, the labile charge groups allow the evaluation of the efficiency of potential therapeutic agents at near physiological pH.

Une nouvelle méthode d'extraction en phase solide (SPE) couplée à une technique d'analyse ultrarapide a été développée pour la détermination simultanée de neuf contaminants émergents (l'atrazine, le déséthylatrazine, le 17(béta)-estradiol, l'éthynylestradiol, la noréthindrone, la caféine, la carbamazépine, le diclofénac et le sulfaméthoxazole) provenant de différentes classes thérapeutiques et présents dans les eaux usées. La pré-concentration et la purification des échantillons a été réalisée avec une cartouche SPE en mode mixte (Strata ABW) ayant à la fois des propriétés échangeuses de cations et d'anions suivie d'une analyse par une désorption thermique par diode laser/ionisation chimique à pression atmosphérique couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LDTD-APCI-MS/MS). La LDTD est une nouvelle méthode d'introduction d'échantillon qui réduit le temps total d'analyse à moins de 15 secondes par rapport à plusieurs minutes avec la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem traditionnelle (LC-MS/MS). Plusieurs paramètres SPE ont été évalués dans le but d'optimiser l'efficacité de récupération lors de l'extraction des analytes provenant des eaux usées, tels que la nature de la phase stationnaire, le débit de chargement, le pH d'extraction, le volume et la composition de la solution de lavage et le volume de l'échantillon initial. Cette nouvelle méthode a été appliquée avec succès à de vrais échantillons d'eaux usées provenant d'un réservoir de décantation primaire. Le recouvrement des composés ciblés provenant des eaux usées a été de 78 à 106%, la limite de détection a été de 30 à 122 ng L-1, alors que la limite de quantification a été de 88 à 370 ng L-1. Les courbes d'étalonnage dans les matrices d'eaux usées ont montré une bonne linéarité (R2 > 0,991) pour les analytes cibles ainsi qu’une précision avec un coefficient de variance inférieure à 15%. / A new solid phase extraction (SPE) method coupled to a high throughput sample analysis technique was developed for the simultaneous determination of nine selected emerging contaminants (atrazine, desethylatrazine, 17(beta)-estradiol, ethynylestradiol, northindrone, caffeine, carbamazepine, diclofenac and sulfamethoxazole) comprising drugs from different therapeutic classes present in wastewater. Sample pre-concentration and clean-up was performed with a mixed-mode SPE cartridge (Strata ABW) having both cation and anion exchange properties followed by analysis by laser diode thermal desorption/atmospheric pressure chemical ionization coupled to tandem mass spectrometry (LDTD-APCI-MS/MS). The LDTD is a new high-throughput sample introduction method, which reduces total analysis time to less than 15 seconds compared to minutes with traditional liquid-chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Several SPE parameters were evaluated in order to optimize recovery efficiencies when extracting analytes from wastewater, such as the nature of stationary phase, the loading flow rate, the extraction pH, the various volume and composition of the washing solution and the initial sample volume. The method was successfully applied to real wastewater samples from a primary sedimentation tank. Recoveries of target compounds from wastewater ranged from 78 to 106 %, the limit of detection ranged from 30 to 122 ng L-1 while the limit of quantification ranged from 88 to 370 ng L-1. Calibration curves in wastewater matrix showed good linearity (R2 > 0.991), for all target analytes, and precision (intraday and interday) showed a coefficient of variance below 15%.

Augant pasaulinei pramonei aplinkos tarša nepaliaujamai didėja, tad augalai augantys užterštoje aplinkoje, savo sudėtyje taip pat turi nemažai įvairių junginių, kurie gali įtakoti juos vartojančių žmonių sveikatą. Eterinių aliejų išgautų iš augalų tyrimas yra vienas iš būdų nustatant augalo kokybę, užtikrinant, kad taršalai nepateks tolesniam perdirbimui. Eteriniams aliejams išgauti yra daug būdų, kaip kad distiliacija vandens garais, šviežių aromatinių dalių išspaudimas, ekstrakcija tirpikliais, tačiau tokie išgavos būdai būdingesni išgaunant didelius kiekius, tad reikia ir daug žaliavos. Tyrimams naudojami greitesni, bei mažiau žaliavos reikalaujantys metodai, kaip, kad ekstrakcija superkritiniais skysčiais, kietafazė mikroekstrakcija bei ekstrakcija iš bandinio viršerdvės. Šio darbo tikslas - eterinių aliejų, išgautų superkritinių skysčių ekstrakcijos, kietafazės mikroekstrakcijos bei tiesioginės viršerdvės ekstrakcijos būdais, sudėties nustatymas dujų chromatografijos – masių spektroskopijos metodu. Panaudojant gautus duomenis nustatyti kuris ekstrakcijos būdas pasižymi didžiausiu efektyvumu. Duomenų tikslumo užtikrinimui bandiniai pakartotinai leisti po 3 kartus, identifikuoti junginiai tikrinti skaičiuojant kovačo retencijos indeksus ir juos lyginant su jau žinomais indeksais internetinėje bibliotekoje. Darbo metu remiantis gautais duomenimis nustatyta efektyviausias eterinių aliejų ekstrakcijos metodas, junginiai, esantys bandiniuose bei būdingųjų junginių kiekis. / As the word industry develops, the amount of wastes, that are being released in to our environment is always increasing, as a result vegetables that are growing in such a environment are also contaminated with compounds that can affect the health of people that are using them. Many methods can be used to obtain essential oils, such as distillation using water vapour, extruding from fresh fragrant, extraction using solvents, but these kind of methods are used for getting large amounts of essential oils, so staple is used. For chemical analysis faster and less staple demanding methods are used, such as, super critical fluid extraction, solid phase micro extraction or direct head space extraction. The goal of this work is to determine the composition of essential oils and to estimate witch, super critical fluid extraction, solid phase micro extraction or direct head space extraction is the best for obtaining essential oils from spice herbs. In order to secure the precision of data each sample was analyzed three times, for correct compound identification kovach retention indexes were calculated and compared with the known ones on the internet library. Using the obtained data the most effective method foe essential oils obtaining was determined, also compound composition in samples and the amount of specific compounds were analyzed.

The immune system often recognises tumour cells and infectious agents from the unique peptides found on their surfaces therefore, synthetic peptides of similar structure can be used as vaccines to stimulate the immune system. Despite the problems associated with proteolysis and delivery to the immune system, peptide-based vaccines have enormous potential due to their ease of synthesis and purification. The aim of this research was to synthesise ligands for mannose receptors (MRs) that are found on human Antigen Presenting Cells (APCs), for use in synthetic vaccines. Carbohydrate bearing antigens are recognised by MRs which play an important role in binding antigens, migration of dendritic cells (DCs) and interaction of DCs with lymphocytes. Hence, incorporation of a sugar residue into a peptide chain can be used to enhance antigen presentation. This thesis describes the synthesis of fluorescein labelled O-mannosylated peptides using either manual or microwave assisted solid phase glycopeptide synthesis (SPGS) on pre-loaded WANG resin. The mannosylated peptides thus prepared can be tested for their ability to bind mannose receptors on human APCs in vitro. In order to prepare compounds that could be analysed in biological screens, a fluorescent label (5(6)-carboxyfluorescein) was introduced into the glycopeptides via the Nα- or the Nε-amino group of the lysine residue. It was found that preparation of the glycopeptide was more facile when the peptide chain was built onto the Nε of Lys (label into Nα) rather than onto the Nα of Lys (label into Nε). In order to overcome problems experienced when introducing more than one glycosylated building block into the peptide chain, a polyethylene glycol (PEG) linker was employed as a sugar carrier. It was found that mono- and dimannosylated building blocks attached to PEG carrier were incorporated more easily into the peptide chain compared to mono- and dimannosylated serine units. Importantly, microwave technology (CEM Liberty microwave peptide synthesiser) was used for SPGS which resulted in improved purity and yields of the glycopeptides thus prepared with a significant reduction in reaction times. The first fifteen glycopeptides prepared in the present study were tested for binding to mannose receptors. Several compounds have shown improved binding to monocytes (bear MRs) in comparison to lymphocytes (do not bear MRs), in the presence of calcium ions. Calcium dependent binding is specific for C type lectin receptor family that MRs belong to. Five remaining glycopeptides are currently undergoing biological evaluation.

The immune system often recognises tumour cells and infectious agents from the unique peptides found on their surfaces therefore, synthetic peptides of similar structure can be used as vaccines to stimulate the immune system. Despite the problems associated with proteolysis and delivery to the immune system, peptide-based vaccines have enormous potential due to their ease of synthesis and purification. The aim of this research was to synthesise ligands for mannose receptors (MRs) that are found on human Antigen Presenting Cells (APCs), for use in synthetic vaccines. Carbohydrate bearing antigens are recognised by MRs which play an important role in binding antigens, migration of dendritic cells (DCs) and interaction of DCs with lymphocytes. Hence, incorporation of a sugar residue into a peptide chain can be used to enhance antigen presentation. This thesis describes the synthesis of fluorescein labelled O-mannosylated peptides using either manual or microwave assisted solid phase glycopeptide synthesis (SPGS) on pre-loaded WANG resin. The mannosylated peptides thus prepared can be tested for their ability to bind mannose receptors on human APCs in vitro. In order to prepare compounds that could be analysed in biological screens, a fluorescent label (5(6)-carboxyfluorescein) was introduced into the glycopeptides via the Nα- or the Nε-amino group of the lysine residue. It was found that preparation of the glycopeptide was more facile when the peptide chain was built onto the Nε of Lys (label into Nα) rather than onto the Nα of Lys (label into Nε). In order to overcome problems experienced when introducing more than one glycosylated building block into the peptide chain, a polyethylene glycol (PEG) linker was employed as a sugar carrier. It was found that mono- and dimannosylated building blocks attached to PEG carrier were incorporated more easily into the peptide chain compared to mono- and dimannosylated serine units. Importantly, microwave technology (CEM Liberty microwave peptide synthesiser) was used for SPGS which resulted in improved purity and yields of the glycopeptides thus prepared with a significant reduction in reaction times. The first fifteen glycopeptides prepared in the present study were tested for binding to mannose receptors. Several compounds have shown improved binding to monocytes (bear MRs) in comparison to lymphocytes (do not bear MRs), in the presence of calcium ions. Calcium dependent binding is specific for C type lectin receptor family that MRs belong to. Five remaining glycopeptides are currently undergoing biological evaluation.

The immune system often recognises tumour cells and infectious agents from the unique peptides found on their surfaces therefore, synthetic peptides of similar structure can be used as vaccines to stimulate the immune system. Despite the problems associated with proteolysis and delivery to the immune system, peptide-based vaccines have enormous potential due to their ease of synthesis and purification. The aim of this research was to synthesise ligands for mannose receptors (MRs) that are found on human Antigen Presenting Cells (APCs), for use in synthetic vaccines. Carbohydrate bearing antigens are recognised by MRs which play an important role in binding antigens, migration of dendritic cells (DCs) and interaction of DCs with lymphocytes. Hence, incorporation of a sugar residue into a peptide chain can be used to enhance antigen presentation. This thesis describes the synthesis of fluorescein labelled O-mannosylated peptides using either manual or microwave assisted solid phase glycopeptide synthesis (SPGS) on pre-loaded WANG resin. The mannosylated peptides thus prepared can be tested for their ability to bind mannose receptors on human APCs in vitro. In order to prepare compounds that could be analysed in biological screens, a fluorescent label (5(6)-carboxyfluorescein) was introduced into the glycopeptides via the Nα- or the Nε-amino group of the lysine residue. It was found that preparation of the glycopeptide was more facile when the peptide chain was built onto the Nε of Lys (label into Nα) rather than onto the Nα of Lys (label into Nε). In order to overcome problems experienced when introducing more than one glycosylated building block into the peptide chain, a polyethylene glycol (PEG) linker was employed as a sugar carrier. It was found that mono- and dimannosylated building blocks attached to PEG carrier were incorporated more easily into the peptide chain compared to mono- and dimannosylated serine units. Importantly, microwave technology (CEM Liberty microwave peptide synthesiser) was used for SPGS which resulted in improved purity and yields of the glycopeptides thus prepared with a significant reduction in reaction times. The first fifteen glycopeptides prepared in the present study were tested for binding to mannose receptors. Several compounds have shown improved binding to monocytes (bear MRs) in comparison to lymphocytes (do not bear MRs), in the presence of calcium ions. Calcium dependent binding is specific for C type lectin receptor family that MRs belong to. Five remaining glycopeptides are currently undergoing biological evaluation.

The immune system often recognises tumour cells and infectious agents from the unique peptides found on their surfaces therefore, synthetic peptides of similar structure can be used as vaccines to stimulate the immune system. Despite the problems associated with proteolysis and delivery to the immune system, peptide-based vaccines have enormous potential due to their ease of synthesis and purification. The aim of this research was to synthesise ligands for mannose receptors (MRs) that are found on human Antigen Presenting Cells (APCs), for use in synthetic vaccines. Carbohydrate bearing antigens are recognised by MRs which play an important role in binding antigens, migration of dendritic cells (DCs) and interaction of DCs with lymphocytes. Hence, incorporation of a sugar residue into a peptide chain can be used to enhance antigen presentation. This thesis describes the synthesis of fluorescein labelled O-mannosylated peptides using either manual or microwave assisted solid phase glycopeptide synthesis (SPGS) on pre-loaded WANG resin. The mannosylated peptides thus prepared can be tested for their ability to bind mannose receptors on human APCs in vitro. In order to prepare compounds that could be analysed in biological screens, a fluorescent label (5(6)-carboxyfluorescein) was introduced into the glycopeptides via the Nα- or the Nε-amino group of the lysine residue. It was found that preparation of the glycopeptide was more facile when the peptide chain was built onto the Nε of Lys (label into Nα) rather than onto the Nα of Lys (label into Nε). In order to overcome problems experienced when introducing more than one glycosylated building block into the peptide chain, a polyethylene glycol (PEG) linker was employed as a sugar carrier. It was found that mono- and dimannosylated building blocks attached to PEG carrier were incorporated more easily into the peptide chain compared to mono- and dimannosylated serine units. Importantly, microwave technology (CEM Liberty microwave peptide synthesiser) was used for SPGS which resulted in improved purity and yields of the glycopeptides thus prepared with a significant reduction in reaction times. The first fifteen glycopeptides prepared in the present study were tested for binding to mannose receptors. Several compounds have shown improved binding to monocytes (bear MRs) in comparison to lymphocytes (do not bear MRs), in the presence of calcium ions. Calcium dependent binding is specific for C type lectin receptor family that MRs belong to. Five remaining glycopeptides are currently undergoing biological evaluation.

Ce manuscrit est consacré à l'étude des transformations polymorphiques induites au cours du procédé de compression directe, et à son incidence sur les propriétés mécaniques des comprimés. L'objectif principal de ce travail est d'apporter des éléments de compréhension sur la transition polymorphique de la caféine (principe actif modèle) Forme I en Forme II survenant lors du procédé de compression directe, et de déterminer si celle-ci a un impact sur la contrainte à la rupture du comprimé. L'utilisation du simulateur de compression Styl'One Classique (Médel'Pharm) et d'une machine de fatigue (Instron®) pour la fabrication des comprimés, a permis d'étudier deux paramètres de procédé (pression et vitesse de fabrication) et deux paramètres de formulation (dilution du principe actif et nature du diluant) représentatifs de conditions industrielles. Les transitions de phase de la caféine ont été évaluées par analyse calorimétrique différentielle (ACD). De plus, des études cinétiques ont été conduites durant plusieurs mois afin d'observer l'influence de ces différents paramètres sur la transition polymorphique de la caféine anhydre Forme I en Forme II dans les comprimés au cours de leur stockage. Enfin, l'analyse du mécanisme de transition de ce principe actif a été réalisée au moyen d'une loi exponentielle étirée, issue du modèle de Johnson-Mehl-AvramiLa contrainte à la rupture des comprimés (caractéristique globale) a été mesurée par un test de rupture diamétrale, la dureté de surface des comprimés (caractéristique locale) par nano-indentation. Un premier modèle de prédiction de la contrainte à la rupture selon la teneur en caféine a été développé. Les principales caractéristiques du cycle de compression calculées à partir des données enregistrée par le simulateur de compression ont permis d'analyser le comportement des formules lors de la compression puis d'établir un second modèle de prédiction de la contrainte à la rupture.Les résultats de transition polymorphique et de propriétés physiques de comprimés seront alors confrontés / Direct compression process is widely used in the pharmaceutical industry for tablet manufacturing. This work is dedicated to the study of the polymorphic transformation induced by a direct compression process, and its impact on tablet mechanical properties. The main objective is to improve the understanding of the phase transition of caffeine Form I into Form II occurring during the direct compression process, and whether it has an impact on the tablet tensile strength. In this way, several studies have been conducted on the impact of operating conditions on the polymorphic transformation of a model active pharmaceutical ingredient (API) and on few physical properties of the tablets.The use of a compression simulator Styl’One Classique (Médel’Pharm) and a fatigue equipment (Instron®) for the manufacture of tablets, allowed studying two process parameters (compression load and compression speed) and two formulation parameters (dilution of the API and nature of the diluent). Caffeine phase transitions have been evaluated by differential scanning calorimetry (DSC). Moreover, during several months after tableting, kinetic studies were conducted in order to observe the influence of these parameters on the polymorphic transition of the anhydrous caffeine Form I into Form II in tablets during storage. Finally, the analysis of the transition mechanism of this API was performed thanks to a stretched exponential law, derived from the Johnson-Melh-Avrami model.The tensile strength of tablets (global property) was measured by a diametral compression test and their surface hardness (local property) by nanoindentation. A first predictive model for tablet tensile strength according to the caffeine content was developed. The compression cycle characteristics calculated from the data recording with the compression simulator allowed analyzing the behavior of different blends during the compression process. A second model for predicting the tensile strength was then established.Finally, results obtained for the polymorphic transition and physical properties of tablets will then be confronting