Tendo em vista a importância da bubalinocultura como fonte de proteína para o Brasil e também do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose para a evolução das cadeias produtoras de bovinos e bubalinos e, devido à escassez de estudos sobre o sorodiagnóstico da brucelose na espécie bubalina, procedimento no qual se apóia o processo de certificação de rebanhos livres e monitorados, o presente estudo objetivou comparar o desempenho de diferentes testes para o sorodiagnóstico da brucelose nessa espécie. Soros de 696 fêmeas bubalinas adultas foram submetidos aos testes qualitativos BPA, AATE, AAT e quantitativos: SRP, SLT, ELISAI, ELISAC, PF e ME e FC. Foi empregada, gold standard, a combinação de dois testes, FC e ME, considerando dois critérios: a) animais positivos para os reagentes na FC (título &ge; 20UI) e no ME (critério para fêmea vacinada) e como negativos os animais não reagentes na FC (título < 20UI) e no ME; b) animais positivos os reagentes na FC (título &ge; =20UI) e no ME (critério para fêmea não vacinada) e negativos os não reagentes na FC (título < 20UI) e no ME. Esta consideração foi necessária em função dos animais não apresentarem histórico de vacinação confiável o que interfere na determinação do ponto de corte a ser utilizado no teste ME de animais vacinados e não vacinados. Desta forma, numa primeira análise todos os animais foram avaliados no ME como vacinados e em outra como não vacinados. Com base nesses resultados, foi construída a curva ROC para todos os testes quantitativos (SRP, SLT, ELISAC, ELISAI e PF). Com os resultados dessa análise estabeleceu-se pontos de corte que otimizam os valores de sensibilidade e especificidade relativas para cada teste. Esses valores foram utilizados para o cálculo do índice de concordância Kappa para cada teste, incluindo os qualitativos. Concluiu-se que: a) os resultados dos estudos com os testes de ELISAC e PF em bovinos podem ser inferidos para bubalinos com razoável segurança; b) devem ser estabelecidos pontos de corte específicos para búfalos para o SLT, o SRP e o ELISAI; c) as melhores combinações de sensibilidade e especificidade relativas foram alcançadas pelo ELISAC, o PF, o BPA e o AAT; d) os melhores resultados de Kappa foram verificados para o ELISAC (kappa), PF, BPA, AATE e AAT; e) o BPA, AAT e AATE são os melhores testes para o sorodiagnóstico de triagem em bubalinos e o ELISAC e o PF são os mais promissores testes confirmatórios nessa espécie, já que ganhos adicionais de especificidade podem ser alcançados pelo aumento do ponto de corte. / Considering the importance of the buffalo as a protein source in Brazil and the National Program of Brucelosis and Tuberculosis Control and Eradication for the evolution of the bovine and bubaline sector, and also due to the few number of studies on serological diagnosis of brucelosis in this specie, procedure that supports the process of certification of brucelosis free herds, the present study aimed to compare different serological tests for brucelosis diagnosis on buffaloes. Serum samples from 696 adult bubaline females had been analyzed to BPA, AATE, AAT (qualitatives), SRP, SLT, ELISAI, ELISAC, PF and ME and FC (quantitatives). The combination of two tests, FC and ME was used as reference, considering two criteria: a) positive animals: reactors for the FC (titer &ge; 20UI) and ME (vaccinated females), negative animals: no reactors for the FC (titer < 20UI) and ME (vaccinated females); b) positive animals: reactors for the FC (titer &ge; 20UI) and ME (not vaccinated females), negative animals: no reactors for the FC (titer < 20UI) and ME (not vaccinated females). It was necessary because was not possible to garantee the true vaccination status of the animals. The first step was performing the ROC analysis for all the quantitative tests (SRP, SLT, ELISAC, ELISAI and PF), and so the relative sensitivity and specificity and the Kappa were calculated for each test. Conclusions: a) the cut offs of ELISAC and PF tests proposed for bovines can be used for bubalines with reasonable security; b) specific cut offs for buffaloes to be used in SLT, SRP and ELISAI must be established; c) the best relative sensitivity and specificity had been reached by the ELISAC, PF, BPA and AAT; d) the best results of the Kappa had been reached by ELISAC (kappa), PF, BPA, AATE and AAT; e) BPA, AAT and AATE are the best screening diagnosis test for bubalines and ELISAC and PF are the most promising confirmatory tests for this species.

Tendo em vista a importância da bubalinocultura como fonte de proteína para o Brasil e também do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose para a evolução das cadeias produtoras de bovinos e bubalinos e, devido à escassez de estudos sobre o sorodiagnóstico da brucelose na espécie bubalina, procedimento no qual se apóia o processo de certificação de rebanhos livres e monitorados, o presente estudo objetivou comparar o desempenho de diferentes testes para o sorodiagnóstico da brucelose nessa espécie. Soros de 696 fêmeas bubalinas adultas foram submetidos aos testes qualitativos BPA, AATE, AAT e quantitativos: SRP, SLT, ELISAI, ELISAC, PF e ME e FC. Foi empregada, gold standard, a combinação de dois testes, FC e ME, considerando dois critérios: a) animais positivos para os reagentes na FC (título &ge; 20UI) e no ME (critério para fêmea vacinada) e como negativos os animais não reagentes na FC (título < 20UI) e no ME; b) animais positivos os reagentes na FC (título &ge; =20UI) e no ME (critério para fêmea não vacinada) e negativos os não reagentes na FC (título < 20UI) e no ME. Esta consideração foi necessária em função dos animais não apresentarem histórico de vacinação confiável o que interfere na determinação do ponto de corte a ser utilizado no teste ME de animais vacinados e não vacinados. Desta forma, numa primeira análise todos os animais foram avaliados no ME como vacinados e em outra como não vacinados. Com base nesses resultados, foi construída a curva ROC para todos os testes quantitativos (SRP, SLT, ELISAC, ELISAI e PF). Com os resultados dessa análise estabeleceu-se pontos de corte que otimizam os valores de sensibilidade e especificidade relativas para cada teste. Esses valores foram utilizados para o cálculo do índice de concordância Kappa para cada teste, incluindo os qualitativos. Concluiu-se que: a) os resultados dos estudos com os testes de ELISAC e PF em bovinos podem ser inferidos para bubalinos com razoável segurança; b) devem ser estabelecidos pontos de corte específicos para búfalos para o SLT, o SRP e o ELISAI; c) as melhores combinações de sensibilidade e especificidade relativas foram alcançadas pelo ELISAC, o PF, o BPA e o AAT; d) os melhores resultados de Kappa foram verificados para o ELISAC (kappa), PF, BPA, AATE e AAT; e) o BPA, AAT e AATE são os melhores testes para o sorodiagnóstico de triagem em bubalinos e o ELISAC e o PF são os mais promissores testes confirmatórios nessa espécie, já que ganhos adicionais de especificidade podem ser alcançados pelo aumento do ponto de corte. / Considering the importance of the buffalo as a protein source in Brazil and the National Program of Brucelosis and Tuberculosis Control and Eradication for the evolution of the bovine and bubaline sector, and also due to the few number of studies on serological diagnosis of brucelosis in this specie, procedure that supports the process of certification of brucelosis free herds, the present study aimed to compare different serological tests for brucelosis diagnosis on buffaloes. Serum samples from 696 adult bubaline females had been analyzed to BPA, AATE, AAT (qualitatives), SRP, SLT, ELISAI, ELISAC, PF and ME and FC (quantitatives). The combination of two tests, FC and ME was used as reference, considering two criteria: a) positive animals: reactors for the FC (titer &ge; 20UI) and ME (vaccinated females), negative animals: no reactors for the FC (titer < 20UI) and ME (vaccinated females); b) positive animals: reactors for the FC (titer &ge; 20UI) and ME (not vaccinated females), negative animals: no reactors for the FC (titer < 20UI) and ME (not vaccinated females). It was necessary because was not possible to garantee the true vaccination status of the animals. The first step was performing the ROC analysis for all the quantitative tests (SRP, SLT, ELISAC, ELISAI and PF), and so the relative sensitivity and specificity and the Kappa were calculated for each test. Conclusions: a) the cut offs of ELISAC and PF tests proposed for bovines can be used for bubalines with reasonable security; b) specific cut offs for buffaloes to be used in SLT, SRP and ELISAI must be established; c) the best relative sensitivity and specificity had been reached by the ELISAC, PF, BPA and AAT; d) the best results of the Kappa had been reached by ELISAC (kappa), PF, BPA, AATE and AAT; e) BPA, AAT and AATE are the best screening diagnosis test for bubalines and ELISAC and PF are the most promising confirmatory tests for this species.

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Após o sequenciamento do genoma de algumas espécies de Leishmania spp., estudos moleculares de suas formas celulares (amastigotas e promastigotas) trouxeram informações importantes sobre sua biologia e potencial aplicação no aperfeiçoamento ou desenvolvimento de técnicas diagnósticas e terapêuticas. Nesse contexto, este projeto visou avaliar o gene LinJ.36.419 de Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) e seu produto quanto a potencial aplicação no dsenvolvimento de novas abordagens diagnósticas. Ensaios de PCR quantitativa mostraram que a expressão deste gene é maior em formas amastigotas, estágio responsável pela manifestação da doença, podendo corresponder a um potencial marcador diagnóstico. Um fragmento de 255 aminoácidos da proteína Lc36 foi caracterizado quanto ao seu potencial antigênico utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Os resultados mostraram especificidade de 74% e sensibilidade de 78% (99% de confiança), com acurácia de 76%, em uma população escolhida randomicamente. Análises adicionais mostraram reação cruzada pouco significativa para soro de cães infectados com Leptospira interrogans e Toxoplasma gondii, e revelaram reação cruzada contra soro de cães infectados por Babesia canis e Ehrlichia canis, todos organismos infecciosos comuns em cães. Análises de bioinformática mostraram que a proteína Lc36 possui um domínio denominado DNA polimerase sigma (COG5260) comum a vários organismos, associado a atividades de replicação, recombinação e reparo de ácidos nucléicos, o qual pode ser responsável pelas reações cruzadas observadas. Dessa forma, outro fragmento (297 aminoácidos) da proteína Lc36, sem a região de domínio conservado, foi expresso para nova caracterização do potencial antigênico com o objetivo de melhorar a especificidade do teste em estudo para aplicação em diagnóstico sorológico de leishmaniose visceral canina. Adicionalmente, bons resultados foram obtidos com ensaios para avaliar a potencial aplicação do gene Lc36 em diagnóstico molecular de leishmaniose visceral por meio do par de oligonucleotídeos RT36 específicos para L.infantum. Os ensaios mostraram que a reação foi capaz de detectar cerca de 5 células do parasita, revelando elevada sensibilidade do teste. Dessa forma, ambos os testes avaliados neste trabalho se mostraram promissores e serão explorados em projetos futuros. / Leishmaniasis are diseases caused by Leishmania genus protozoan and endanger 350 million people worldwide. After genomic sequencing of Leishmania spp., molecular studies of their cycle forms (amastigotes and promastigotes) brought important information, which can contribute to the development of new diagnostic approaches and treatments. In this study we evaluated the potencial application of the Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) gene Lc.36.4190 and its encoded protein for development of new diagnostic approaches. Quantitative PCR assays showed that the gene is more expressed in intracellular amastigotes, the stage related to the clinical manifestation of these diseases, thus presenting potential to be a diagnostical target. We evaluated antigenic features of a 255 aminoacids fragment of the Lc36 protein using immunoenzimatic assay (ELISA). The results showed specificity of 74% and sensibility of 78% (99% of confidence) and accuracy of 76%, in a randomically chosen population. Additional analysis showed low cross-reaction against Leptospira interrogans and Toxoplasma gondii, and showed cross-reaction against Babesia canis and Ehrlichia canis, all infective organisms common in dogs. Bioinformatics analysis showed that the protein Lc36 contains one DNA polymerase sigma domain (COG5260) found on several organisms, being related to nucleic acid replication, recombination and repair, and might be related to the crossreactions observed. Thus, another fragment (297 aminoacids) of the Lc36 protein, without the conserved domain region, was expressed for a new antigenic characterization to improve the specificity of the canine visceral leishmaniasis serological test. Moreover, good results were obtained on experiments performed to evaluate the potential application of the Lc36 gene on molecular diagnostics using a L. infantum specific pair of primers, RT36. The assays detected approximately 5 parasites, which displays a good sensibility result. Therefore, both serological and molecular tests evaluated in this study are promising and will be explored in future studies.