Mitochondria are membrane bound organelles important for energy production in respiring cells through the process of oxidative phosphorylation. They have their own multi-copied mitochondrial DNA (mtDNA) genome separate from that in the nucleus that is needed for mitochondria to function properly and can exist in both wild type and mutant forms in the same cell. The integrity of the mtDNA is therefore of vital importance for the survival of the organism and as such understanding the mechanisms of mtDNA maintenance is relevant to human health and disease. This study employs a Southern blotting and non-radioactive probe method to examine various aspects of mtDNA maintenance. Restriction endonuclease mapping utilizing mtDNA-specific and nuclear DNA-specific digoxigenin (DIG)-labeled probes was performed to show that the synthesized probes are indeed specific for their target sequences. The DIG-labeled probes were used to quantitate mtDNA content from different DNA isolation methods. Whole-cell DNA extraction was found to yield higher levels of mtDNA compared to a commercially available spin-column kit. Next, Southern blots were used to analyze mtDNA copy number as well as mtDNA depletion in the hepatocarcinoma-derived cell line HepaRG following exposure to the nucleoside reverse transcriptase inhibitor 2’,3’-dideoxycytidine (ddC), a known mitochondrial toxicant. In comparison to proliferative HepaRG differentiated HepaRG contained about 2-fold more mtDNA. Relative to untreated control cells, proliferating HepaRG exposed to ddC had greater than a 96% reduction in mtDNA and had decreased cellular viability. Differentiated HepaRG cell viability was not affected after 13 days of ddC treatment; however, significant mtDNA depletion was observed. We estimate that differentiated HepaRG mtDNA depletion occurs quickly at about 20 molecules per hour.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-23T13:42:02Z No. of bitstreams: 1 Robson Jose do Nascimento.pdf: 504518 bytes, checksum: c6daea872bbe37b1f317f4658b6ff1ab (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T13:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robson Jose do Nascimento.pdf: 504518 bytes, checksum: c6daea872bbe37b1f317f4658b6ff1ab (MD5) Previous issue date: 2006-02-21 / Garlic is a monocotyledon belonging to the family Aliaceae, originating in Central Asia. In Brazil, it was introduced by the Portuguese, at the time of discovery, being widely used in cooking until the present day. Botanically, it is an agrarian herbaceous, with approximately 50 cm of height, propagated by bulbilho, which allows the maintenance of the agronomic characteristics. This method of propagation allows an efficient dissemination of pathogens, mainly viruses, which are one of the main groups of pathogens of this culture, which can cause a reduction of productive potential between 20 and 80%. Garlic is a natural host of viral species belonging to the genera Potyvirus, Carlavirus and Allexivirus. The latter was recently established as a member of the Flexiviridae family and groups Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV), Garlic virus A (GarV-A), Garlic virus B (GarV-B), Garlic virus C Garlic virus D (GarV-D), Garlic virus E (GarV-E), Garlic virus X (GarV-X) and Shallot virus X (ShV-X). In Brazil, imported garlic has been used for planting, which constitutes a risk of introduction of exotic viral species in the country. Currently, the detection of allexivirus in bulbs can be performed by serological and / or molecular tests, and planting is necessary to obtain foliar tissue with high concentration of viral particles, which requires, on average, 30 days. Serological tests are efficient, however, because of the difficulty in producing high quality antisera, are currently less indicated than molecular methods. Aiming to reduce the time for analysis of detection of allexivirus in garlic, a methodological adjustment for nucleic acid extraction was sought directly from the leaf primordia of bulbilhos. Samples of garlic, from Rio Grande do Sul and imported from Argentina were analyzed using foliar primordia obtained by dissecting the bulbiles to extract total RNA using the Trizol reagent. Amplifications of the target genomic fragment were performed via RT-PCR. A band at the time corresponding to 500 bp was observed on agarose gel in the two samples studied. PCR products were transferred to membranes for Southern blot testing, for which a cold probe capable of detecting Allexivirus species was used, from which testing the presence of allexivirus was confirmed. Another allexivirus detection analysis was carried out on samples of garlic consumption imported from Argentina, China and Spain, following the same methodology, being verified a band corresponding to 500 bp in samples from Argentina and China. Southern Blot test, in which a specific cold probe was used to detect GarV-C, confirmed viral infection by the aforementioned species. According to the results obtained, it was found that the extraction of total RNA directly from leaf primordia, combined with the use of molecular techniques, presents itself as a fast and efficient method for detection of allexivirus. It was also verified that most of the analyzed samples are infected with allexivirus, evidencing a sanitary pattern that contraindicates the use of this type of material as seed, with the risk of introduction of exotic viral species. / O alho é uma monocotiledônea pertencente à família Aliaceae, originário da Ásia Central. No Brasil, foi introduzido pelos portugueses, na época do descobrimento, sendo amplamente utilizado na culinária até os dias atuais. Botanicamente, trata-se de uma herbácea agâmica, com aproximadamente 50 cm de altura, propagada via bulbilho, o que permite a manutenção das características agronômicas. Este método de propagação possibilita uma eficiente disseminação de patógenos, principalmente vírus, que são um dos principais grupos de patógenos desta cultura, podendo causar uma redução do potencial produtivo entre 20 e 80%. O alho é hospedeiro natural de espécies virais pertencentes aos gêneros Potyvirus, Carlavirus e Allexivirus. Este último foi recentemente estabelecido como membro da família Flexiviridae e agrupa as espécies Garlic mite-borne filamentousvirus (GarMbFV), Garlic virus A (GarV-A), Garlic virus B (GarV-B), Garlic virus C (GarV-C), Garlic virus D (GarV-D), Garlic virus E (GarV-E), Garlic virus X (GarV-X) e Shallot virus X (ShV-X). No Brasil, o alho consumo importado tem sido empregado para o plantio, o que se constitui um risco de introdução de espécies virais exóticas no país. Atualmente, a detecção de allexivírus em bulbos pode ser realizada por testes sorológicos e/ou moleculares, sendo necessário plantio para obtenção de tecido foliar com alta concentração de partículas virais, o que requer, em média, 30 dias. Os testes sorológicos são eficientes, no entanto, em razão da dificuldade para produção de anti-soros de alta qualidade, atualmente são menos indicados que os métodos moleculares. Objetivando reduzir o tempo para análise de detecção de allexivírus em alho, buscou-se um ajustemetodológico para extração de ácido nucléico diretamente dos primórdios foliares de bulbilhos. Amostras de alho consumo, oriundos do Rio Grande do Sul e importado daArgentina foram analisadas, empregando-se primórdios foliares obtidos por dissecação dos bulbilhos para extração de RNA total com uso do reagente Trizol. As amplificações do fragmento genômico alvo foram realizadas via RT-PCR. Uma banda na altura correspondente a 500 pb foi observada, em gel de agarose, nas duas amostras estudadas. Os produtos de PCR foram transferidos para membranas para teste de Southern Blot, para o qual empregou-se uma sonda fria capaz de detectar espécies de Allexivirus, de cujo teste foi confirmado a presença de allexivírus. Outra análise de detecção de allexivírus foi realizada em amostras de alho consumo importado da Argentina, China e Espanha, seguindo a mesma metodologia, sendo verificada, uma banda na altura correspondente a 500 pb em amostras oriundas da Argentina e da China. Teste de Southern Blot, no qual empregou-se uma sonda fria específica para detectar GarV-C, confirmou infecção viral pela espécie citada. De acordo com os resultados obtidos constatou-se que a extração de RNA total diretamente de primórdios foliares, aliada ao uso de técnicas moleculares apresenta-se como um método rápido e eficiente para detecção de allexivírus. Constatou-se também, que a maior parte das amostras analisadas encontra-se infectada por allexivírus, evidenciando um padrão sanitário que contra-indica o uso deste tipo de material como semente, com o risco de introdução de espécies virais exóticas.

Resumo: A caracterização da estrutura genética de populações clonais de patógenos bacterianos tem sido feita, entre outros métodos, por "Southern blot" empregando-se como sondas seqüências de inserção ou genes avr. O presente trabalho objetivou o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores e sondas de DNA baseadas em genes de patogenicidade para estudo da diversidade genética de isolados de Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii e Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis. Observou-se a presença dos genes avrXacE1, avrXacE2 e lrp em todos isolados das subsp. citri e aurantifolii e a ausência do gene avrXacE2 no isolado da subsp. citrumelonis. Os perfis de restrição gerados por PCR-RFLP não revelaram polimorfismo nos genes amplificados e o uso de genes avr como sondas para "Southern blot" mostrou-se efetiva na diferenciação das espécies de Xanthomonas patogênicas a citros e na identificação de relativo polimorfismo entre isolados da mesma espécie. A diversidade haplotípica foi maior com o gene avrXacE1. Com exceção à sonda correspondente ao gene lrp, o número de haplótipos identificados (17) variou de acordo com a endonuclease utilizada em "Southern blot". Os isolados da subsp. citri apresentaram um maior número de cópias dos genes avr em comparação com isolados das subsp. aurantifolii e citrumelonis. O estado de São Paulo, que adota uma campanha de erradicação do cancro cítrico, apresentou a menor diversidade haplotípica, provavelmente em decorrência do curto período em que o patógeno interage com o hospedeiro. / Abstract: The genetic structure of clonal populations of bacterial pathogens has been characterized, among other methods, by Southern blot using insertion sequences or avr genes as probes. The present work aimed the development of DNA primers and probes based on pathogenicity genes to study the genetic diversity of Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, and Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis strains. The presence of avrXacE1, avrXacE2 and leucine rich protein (lrp) genes was observed in all citri and aurantifolii strains, as well as the absence of the avrXacE2 gene in citrumelonis isolate. The restriction profiles generated by PCR-RFLP did not show polymorphism in the amplified genes and the use of avr genes as Southern blot probes showed to be effective to differentiate Xanthomonas species pathogenic to citrus and to identify a relative polymorphism between strains belonging to the same species. The haplotype diversity was higher with the avrXacE1 gene. Excepting the probe corresponding to lrp gene, the number of haplotypes identified (17) varied according to the endonuclease used on Southern blot. The strains of the citri species presented a higher number of copies of the avr genes compared to aurantifolii and citrumelonis. The state of São Paulo, that adopts a campaign of eradication of the citrus canker, presented the smaller haplotype diversity, probably as result of the short period where the pathogen interacts with the host. / Orientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: João Martins Pizauro Junior / Banca:Julio Cezar Franco de Oliveira / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:56:16Z : No. of bitstreams: 1 jaciani_fj_me_jabo.pdf: 302453 bytes, checksum: 1fb27cbd11729232d8b900ef7c2e8c3c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A caracterização da estrutura genética de populações clonais de patógenos bacterianos tem sido feita, entre outros métodos, por “Southern blot” empregando-se como sondas seqüências de inserção ou genes avr. O presente trabalho objetivou o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores e sondas de DNA baseadas em genes de patogenicidade para estudo da diversidade genética de isolados de Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii e Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis. Observou-se a presença dos genes avrXacE1, avrXacE2 e lrp em todos isolados das subsp. citri e aurantifolii e a ausência do gene avrXacE2 no isolado da subsp. citrumelonis. Os perfis de restrição gerados por PCR-RFLP não revelaram polimorfismo nos genes amplificados e o uso de genes avr como sondas para “Southern blot” mostrou-se efetiva na diferenciação das espécies de Xanthomonas patogênicas a citros e na identificação de relativo polimorfismo entre isolados da mesma espécie. A diversidade haplotípica foi maior com o gene avrXacE1. Com exceção à sonda correspondente ao gene lrp, o número de haplótipos identificados (17) variou de acordo com a endonuclease utilizada em “Southern blot”. Os isolados da subsp. citri apresentaram um maior número de cópias dos genes avr em comparação com isolados das subsp. aurantifolii e citrumelonis. O estado de São Paulo, que adota uma campanha de erradicação do cancro cítrico, apresentou a menor diversidade haplotípica, provavelmente em decorrência do curto período em que o patógeno interage com o hospedeiro. / The genetic structure of clonal populations of bacterial pathogens has been characterized, among other methods, by Southern blot using insertion sequences or avr genes as probes. The present work aimed the development of DNA primers and probes based on pathogenicity genes to study the genetic diversity of Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, and Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis strains. The presence of avrXacE1, avrXacE2 and leucine rich protein (lrp) genes was observed in all citri and aurantifolii strains, as well as the absence of the avrXacE2 gene in citrumelonis isolate. The restriction profiles generated by PCR-RFLP did not show polymorphism in the amplified genes and the use of avr genes as Southern blot probes showed to be effective to differentiate Xanthomonas species pathogenic to citrus and to identify a relative polymorphism between strains belonging to the same species. The haplotype diversity was higher with the avrXacE1 gene. Excepting the probe corresponding to lrp gene, the number of haplotypes identified (17) varied according to the endonuclease used on Southern blot. The strains of the citri species presented a higher number of copies of the avr genes compared to aurantifolii and citrumelonis. The state of São Paulo, that adopts a campaign of eradication of the citrus canker, presented the smaller haplotype diversity, probably as result of the short period where the pathogen interacts with the host.

Two plaque-pure phage lambda clones designated as λhtX-l and λhtX-2 that hybridized to unfractionated bovine liver tRNA were isolated from a human X chromosome-specific library. The λDNAs were characterized by restriction mapping and Southern blot hybridization techniques. The human DNA segment in λhtX-l contains five or more presumptive tRNA genes and at least one Alu family member. The 19-kilobase human DNA insert in λhtX-2 contains two or more presumptive tRNA genes and at least three Alu family members. Another human genomic clone designated λhVKV7 hybridized to mammalian valine tRNA IAC. The clone was characterized by physical mapping and Southern blot hybridization techniques. The 18.5-kilobase human DNA fragment in λhVKV7 contains a cluster of three tRNA genes and at least nine Alu family members.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-04Bitstream added on 2014-06-13T20:54:09Z : No. of bitstreams: 1 leite_jp_me_jabo.pdf: 625899 bytes, checksum: b1da1d374d5f4023e4648183bd7780c4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / No cenário atual de mudanças climáticas, com o aumento da população mundial e crescente demanda por alimentos, as ferramentas biotecnológicas veem sendo utilizadas na obtenção de plantas mais tolerantes a estresse ambientais como a seca, que provoca perdas financeiras e de produção significativas aos produtores. Os fatores de transcrição, são genes potenciais na estratégia de reduzir os prejuízos decorrentes de períodos de déficit hídrico, pois atuam controlando a expressão de genes estresse-induzidos e têm sido estudados na planta modelo Arabidopsis thaliana e em culturas de interesse agronômico. O fator de transcrição AtAREB1ΔQT, consiste na forma constitutivamente ativa de AREB1, (ABA Responsive Element Binding – elemento de ligação de resposta ao ABA) que está envolvido, na via de sinalização ABA (ácido abcísico) dependente de resposta ao estresse hídrico em plantas. O objetivo do presente trabalho foi introduzir em soja, via biobalística, a construção gênica pBI35SΩ:AtAREB1ΔQT e caracterizar molecularmente os eventos quanto ao número de cópias inseridas, e análise da expressão gênica do transgene. Para a caracterização molecular, foram utilizadas as metodologias de Southern blot e RT-qPCR. Um total de 12 linhagens independentes foram obtidas na geração T0, com uma eficiência de transformação de 0,59%. Somente três eventos (2651, 2639 e 2654) segregaram e passaram o gene para a geração T1. O número de cópias do transgene quantificado via qPCR, foi diferente, para cada linhagem geneticamente modificada (GM) analisada, variando de poucas cópias (1 a 2) a várias (17 cópias). Estes dados foram corroborados pelos resultados obtidos via Southern blot. O nível de expressão gênica relativa do transgene foi variável entre os eventos e a análise da segregação em plantas... / In the actual scenario of climatic changes, with world population increase and growing food demand, biotechnological tools are being used to develop plants more tolerant to environmental stresses such as drought, which causes to producers, significant financial losses and yield production. The transcription factors are potential genes to be strategically used to reduce damage due to water deficit conditions, because they acts controlling the expression of numerous stress-induced genes and has been studied in the model plant Arabidopsis thaliana as well as in agronomic crops. The transcription factor, AtAREB1ΔQT, consists in the constitutively active form of AREB1, (ABA Responsive Element Binding) that is involved, ABA signaling pathway (abscisic acid) dependent response pathway to drought in plants. The objective of this study was to insert the construction pBI35SΩ: AtAREB1ΔQT in soybean, via biolistics, and molecularly characterization of the events on the number of inserted copies, and analyze the relative expression level of transgene. Twelve independent lines were identified in T0 generation, with a transformation efficiency of 0.59%. Only three events (2651, 2639 and 2654) segregated and transmitted the gene for T1 generation. The number of copies quantified using qPCR was different for each modified genetically (GM) line, ranging from a few copies (1 to 2 copies) to many copies (17 copies). These data were corroborated by Southern blot results. The relative expression level of transgene was variable between events and segregation analysis in T2 generation showed that he transgene did not follow the Mendelian laws. Aiming to obtain more information on the effect of the transgene in response to water stress... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Janete Apparecida Desidério / Coorientador: Renata Fuganti Pagliarini / Banca: Francismar Corrêa Marcelino / Banca: Sonia Marli Zingaretti / Resumo: No cenário atual de mudanças climáticas, com o aumento da população mundial e crescente demanda por alimentos, as ferramentas biotecnológicas veem sendo utilizadas na obtenção de plantas mais tolerantes a estresse ambientais como a seca, que provoca perdas financeiras e de produção significativas aos produtores. Os fatores de transcrição, são genes potenciais na estratégia de reduzir os prejuízos decorrentes de períodos de déficit hídrico, pois atuam controlando a expressão de genes estresse-induzidos e têm sido estudados na planta modelo Arabidopsis thaliana e em culturas de interesse agronômico. O fator de transcrição AtAREB1ΔQT, consiste na forma constitutivamente ativa de AREB1, (ABA Responsive Element Binding - elemento de ligação de resposta ao ABA) que está envolvido, na via de sinalização ABA (ácido abcísico) dependente de resposta ao estresse hídrico em plantas. O objetivo do presente trabalho foi introduzir em soja, via biobalística, a construção gênica pBI35SΩ:AtAREB1ΔQT e caracterizar molecularmente os eventos quanto ao número de cópias inseridas, e análise da expressão gênica do transgene. Para a caracterização molecular, foram utilizadas as metodologias de Southern blot e RT-qPCR. Um total de 12 linhagens independentes foram obtidas na geração T0, com uma eficiência de transformação de 0,59%. Somente três eventos (2651, 2639 e 2654) segregaram e passaram o gene para a geração T1. O número de cópias do transgene quantificado via qPCR, foi diferente, para cada linhagem geneticamente modificada (GM) analisada, variando de poucas cópias (1 a 2) a várias (17 cópias). Estes dados foram corroborados pelos resultados obtidos via Southern blot. O nível de expressão gênica relativa do transgene foi variável entre os eventos e a análise da segregação em plantas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the actual scenario of climatic changes, with world population increase and growing food demand, biotechnological tools are being used to develop plants more tolerant to environmental stresses such as drought, which causes to producers, significant financial losses and yield production. The transcription factors are potential genes to be strategically used to reduce damage due to water deficit conditions, because they acts controlling the expression of numerous stress-induced genes and has been studied in the model plant Arabidopsis thaliana as well as in agronomic crops. The transcription factor, AtAREB1ΔQT, consists in the constitutively active form of AREB1, (ABA Responsive Element Binding) that is involved, ABA signaling pathway (abscisic acid) dependent response pathway to drought in plants. The objective of this study was to insert the construction pBI35SΩ: AtAREB1ΔQT in soybean, via biolistics, and molecularly characterization of the events on the number of inserted copies, and analyze the relative expression level of transgene. Twelve independent lines were identified in T0 generation, with a transformation efficiency of 0.59%. Only three events (2651, 2639 and 2654) segregated and transmitted the gene for T1 generation. The number of copies quantified using qPCR was different for each modified genetically (GM) line, ranging from a few copies (1 to 2 copies) to many copies (17 copies). These data were corroborated by Southern blot results. The relative expression level of transgene was variable between events and segregation analysis in T2 generation showed that he transgene did not follow the Mendelian laws. Aiming to obtain more information on the effect of the transgene in response to water stress... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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