L’identification de biomarqueurs demeure un véritable défi pour les sciences analytiques et un enjeu majeur pour la recherche clinique. Les glycosaminoglycanes (GAGs) ont été identifiés comme biomarqueurs potentiels de mucopolysaccharidoses (MPS), maladies génétiques rares et très souvent mortelles. Ces pathologies sont dues à une déficience en une des enzymes impliquées dans le catabolisme des GAGs. Le défaut enzymatique conduit à une accumulation de GAGs partiellement dégradés, et entraîne une neurodégénérescence pour les formes sévères de la pathologie. Les GAGs sont des polysaccharides polyanioniques complexes impliqués dans de nombreux processus physiologiques chez les mammifères. Leur étude demeure difficile en raison de leur hétérogénéité structurale, de leur faible biodisponibilité et du manque d'outils dédiés à leur analyse. Notre objectif a été de détecter et de quantifier ces composés à partir de fluides biologiques tels que l’urine et le liquide céphalo-rachidien, puis d’en élucider la structure par spectrométrie de masse. L’étude s’est focalisée sur la caractérisation d’oligosaccharides de type héparane sulfate (HS), biomarqueurs spécifiques de MPS à composante neurologique (MPS de type I, IIIB et IIIC) et responsables des atteintes du système nerveux central. Une stratégie expérimentale permettant l’extraction d’oligosaccharides de HS issus de fluides biologiques a été développée. Ainsi, la structure d’oligosaccharides sulfatés de HS urinaires, candidats biomarqueurs de MPS IIIB et IIIC, a pu être identifiée. Ces composés pourraient s’avérer utiles pour le diagnostic et le suivi de patients, notamment lors d’essais thérapeutiques. Des expériences in vitro d’exposition de différents types cellulaires du cerveau ont été menées afin d’établir la relation entre la structure des oligosaccharides accumulés et leurs effets neuropathologiques. Elles ont permis de mettre en évidence des processus cellulaires qui pourraient impliqués dans la neurodégénérescence et constituer de nouvelles cibles thérapeutiques. / The identification of biomarkers remains one of the main challenges for analytical sciences and a major stake for clinical research. Glycosaminoglycans (GAGs) have been identified as potential biomarkers of mucopolysaccharidoses (MPS) belonging to rare genetic diseases with often a deadly issue. These pathologies are due to a deficiency in one of the enzymes responsible for GAGs catabolism. This enzymatic defect results in the accumulation of partially catabolized GAGs in organism and leads to neurodegeneration for the most severe forms of the disease. GAGs are complex polyanionic polysaccharides involved in numerous physiological processes in mammals. Their study remains a challenging task because of their high structural heterogeneity and their low biodisponibility, besides the lack of dedicated analytical tools. Our aim was to detect and quantify these compounds in biologic fluids such as urine and cerebrospinal fluid, and to elucidate their structures by mass spectrometry. This study focused on heparan sulfate (HS) oligosaccharides, as potential biomarkers of MPS featured by neurological manifestations (MPS I, IIIB and IIIC), and possibly responsible of lesions in the central nervous system. An experimental strategy allowing the extraction of HS oligosaccharides from biological fluids was implemented, thereby the structures of urinary heparan sulfate oligosaccharides were deciphered, leading to possible biomarkers candidates of MPS IIIB and IIIC. These compounds could be useful for diagnostic and patient follow-up that are currently lacking for the monitoring of therapeutic assays. In vitro exposition of different cerebral cell types to HS oligosaccharides was carried out to establish the relation between the structure of oligosaccharides and neuropathological effects. These studies highlighted several cellular processes that could be involved in neurodegeneration and constitute new therapeutic targets.

NOTCH1 est un récepteur transmembranaire qui, suite à la liaison de son ligand, subit une série de clivages protéolytiques libérant un fragment intracellulaire actif NIC1. Une fois libéré, NIC1 transloque au noyau où il s’associe à des cofacteurs transcriptionnels tels CSL et MAML1 afin d’initier la transcription de gènes cibles dont HES1. La voie Notch joue un rôle dans différents processus cellulaires, dont la prolifération, la mort cellulaire et la différenciation cellulaire. En conséquence, une mauvaise régulation ou une perte d’activité de cette voie de signalisation mène à des maladies humaines telles que des pathologies du développement et le cancer. De ce fait, la voie Notch est grandement régulée à divers niveaux. Entre autres, NIC1 subit des modifications post-traductionnelles qui régulent sa stabilité et par conséquent influence la durée du signal NOTCH1. L’activité transcriptionnelle de NIC1 est également régulée via le recrutement coordonné de cofacteurs transcriptionnels. Malgré tout, très peu de choses sont connues quant aux modifications post-traductionnelles pouvant moduler spécifiquement l’activité du complexe transcriptionnel formé par NIC1. De plus, les études jusqu’à présent n’ont pas permis d’identifier tous les partenaires d’interaction se retrouvant dans le complexe transcriptionnel NIC1/CSL/MAML1 et pouvant moduler son activité. Ainsi, l’objectif de cette étude était d’établir un système permettant l’identification de nouveaux partenaires transcriptionnels de NIC1. Nous avons exprimé une forme tronquée et constitutivement clivée de Notch1 et, suivant des analyses par spectrométrie de masse, nos résultats suggèrent l’interaction possible de NIC1 avec des membres du complexe médiateur et d’autres protéines impliquées dans la régulation génique. Nous avons également exprimé un NIC1-GFP et nos travaux ont permis de montrer qu’il était principalement localisé au noyau, où il s’associe à l’ARN polymérase II, et qu’il est dégradé par le protéasome. Suivant des analyses par spectrométrie de masse, nos résultats suggèrent l’interaction possible de NIC1 avec plusieurs régulateurs transcriptionnels et des protéines impliqués dans l’ubiquitination/Sumoylation. Bref, les analyses protéomiques sont un bon système d’exploitation pour l’identification de nouveaux partenaires d’interaction de NIC1. Ainsi, notre étude permettra une meilleure compréhension de la signalisation Notch d’apparence simple, mais plutôt complexe.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines MCM (minichromosome maintenance) forment un complexe hétérohexamérique composé des protéines MCM2 à MCM7 qui possède une activité hélicase nécessaire lors de la réplication de l’ADN. Ce complexe est la cible des protéines ATM et ATR, kinases responsables de l’initiation de la réponse cellulaires aux dommages à l’ADN, pour permettre l’arrêt de la réplication lors de la détection de cassure double brin. De plus, les MCM permettent le remodelage de la chromatine par leur activité hélicase mais aussi par leur association avec une chaperone d’histone la protéine ASF1. Toutefois, la majorité des complexes MCM ne co-localisent pas avec les origines de réplication. De plus, la quantité des protéines MCM dans la cellule est nettement supérieure à la quantité requise lors de la réplication. Ces deux faits laissent présager que ce complexe hélicase pourrait jouer un second rôle. Des études effectuées au laboratoire ont démontré une augmentation de la fixation à la chromatine des protéines MCM suite au traitement avec l’étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II qui cause des cassures double brin. L’étude des interactions de la protéine MCM2 par spectrométrie de masse ainsi que par immunobuvardage ont démontré une augmentation de l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 suite aux dommages. Ceci suggère que les protéines MCM pourraient être impliquées dans les mécanismes de réparation de l’ADN. La nature de l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 a été déterminée in vitro par des immunobuvardages de type Far western et des Dot blot avec des mutants de la protéine MCM2. Des cellules U2OS-Flp-in ont été utilisées pour générer des lignées stables exprimants les protéines MCM2 à MCM7 avec une étiquette GFP ou fusionnées avec une biotine-ligase (BirA). Les cellules ont été cultivées dans du milieu SILAC et des immunoprécipitations ont été effectuées sur des cellules contrôles (R0K0), des cellules qui expriment MCM-GFP ou BirA (R6K4) non-traitées et des cellules qui expriment MCM-GFP ou BirA traitées à l’étoposide (R10K8). Les immunoprécipitations ont été analysés au spectromètre de masse pour déterminer la modulation des interactions avant et après dommages à l’ADN. Les études d’interactions in vitro ont permis d’identifier que l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 se situe entre les acides aminés 81-162 sur la protéine MCM2. L’approche de spectrométrie de masse a permis d’identifier plusieurs protéines liant le complexe MCM qui sont impliquées non seulement dans la réplication de l’ADN mais aussi dans le remodelage de la chromatine. De plus, certains de ces nouveaux partenaires augmentent leur interaction avec le complexe suite à l’induction de dommages. Ces résultats suggèrent que les protéines MCM jouent un rôle dans la réorganisation de la chromatine dans les mécanismes de réparation de l’ADN.

Le cancer est la cause principale de décès chez les canadiens. Cette maladie est souvent caractérisée par des surexpressions, des sous-expressions et des mutations chez certaines protéines clés. NudCD1 est un gène ayant été identifié lors de la dernière décennie comme possédant une forte expression chez des patients atteints de leucémie myéloïde chronique. La protéine issue de ce gène n'est normalement exprimée qu'au niveau des tissus sains testiculaires et cardiaques, elle est cependant surexprimée dans différents cancers. La forte expression de NudCD1 est associée avec des phénotypes tumoraux, possiblement agissant sur l'activation d'IGF1R qui permettrait les phosphorylations subséquentes des voies de signalisation passant par AKT et ERK1/2. Le gène de NudCD1 est constitué de 12 exons pouvant être épissés alternativement de manière à produire 3 différentes isoformes. Ces isoformes possèdent une région C-terminale commune de 492 acides aminés et ont une région N-terminale spécifique. Les isoformes 2 et 3 ne sont présentement que peu caractérisées et leur rôle potentiel ou présence dans le cancer est inconnu. Cette étude nous suggère que les différentes isoformes de NudCD1 possèdent des fonctions différentes dans le cancer. L'expression de ces différentes isoformes a été mesurée au niveau des transcrits d'ARNm ainsi qu'au niveau des protéines dans différentes lignées cellulaires cancéreuses et non-cancéreuses, principalement de types colorectales. NudCD1-1 est exprimée fortement au niveau transcriptionnel et protéique, l'isoforme 2 n'est pas exprimée dans les lignées cellulaires étudiées alors que la troisième isoforme est présente faiblement au niveau d'ARNm chez la majorité des lignées étudiées. La stabilité protéique des isoformes a également été mesurée et démontre que NudCD1-2 et NudCD1-3 sont dégradées rapidement par le protéasome. L'observation microscopique des isoformes par immunofluorescence a démontré que les isoformes n'ont pas la même localisation cellulaire, la première étant principalement nucléaire, la deuxième majoritairement cytoplasmique et la troisième est pancellulaire, Des expériences de spectrométrie de masse en tandem couplées à la méthode de quantification SILAC ont démontré l'interaction entre la protéine NudCD1-1 et DHX15. Ces mêmes expériences ont montré que NudCD1-2 pourrait interagir au niveau du cytosol avec HSP90 dans la réponse aux chocs thermiques et le mouvement nucléaire alors que NudCD1-3 pourrait également agir avec ces protéines en plus de jouer un rôle dans la transcription. L'interaction NudCD1-1 et DHX15 suggère que la protéine pourrait agir au niveau du spliceosome ainsi que la transcription afin de médier l'activation d'IGF1R pour mener au phénotype tumoral. Ces résultats suggèrent que les différentes isoformes ont des fonctions différentes dans la cellule, mais ne sont pas toutes impliquées dans le cancer, en plus d'approfondir les connaissances sur l'action de NudCD1-1 dans le cancer.

La métabolomique est l'étude des petites molécules produites par un système biologique. L'objectif principal des études en métabolomique non ciblées est la recherche d'une signature moléculaire, à base de biomarqueurs, permettant de distinguer deux phénotypes(ex. : malade et sain). Elle trouve des applications dans le domaine de la santé, de la nutrition, de l'agroalimentation et même de l'environnement. La spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide est une des techniques les plus utilisées puisqu'elle offre sensibilité et spécificité lors de l'étude du métabolome. Par contre, le long temps d'analyse limite la taille et la portée des études métabolomiques. De nouvelles approches de métabolomique non ciblée à haut débit par spectrométrie de masse où un échantillon peut être analysé en quelques secondes peuvent cependant éliminer cette barrière. Ce changement de paradigme entraîne une complexification des différentes étapes de l'analyse de données (prétraitement, recherche de biomarqueurs et identification des métabolites). Dans le cadre de cette thèse, nous proposons différents outils basés sur l'apprentissage automatique visant à résoudre les problèmes d'analyse de données causés par une accélération de la vitesse d'acquisition et une augmentation du nombre d'échantillons. Premièrement, nous proposons une série d'algorithmes de correction et d'alignement de spectres de masse visant à les rendre comparables afin de permettre les analyses statistiques et l'apprentissage automatique. Deuxièmement, nous présentons MetaboDashboard, un outil visant à simplifier et à démocratiser l'utilisation de l'apprentissage automatique pour la recherche de biomarqueurs en métabolomique non ciblée. Un exemple de son utilisation dans le contexte d'une infection virale des voies respiratoires est présenté. Finalement, un réseau de neurones appelé DeepCCS permettant la prédiction de la section efficace dans l'objectif de supporter l'identification des métabolites est exposé. Nous démontrons, tout au long de cette thèse, l'utilité et la puissance de l'apprentissage automatique appliqué à la métabolomique non ciblée. Les outils computationnels présentés dans cette thèse sont le point de départ du développement d'une méthode de métabolomique non ciblée à haut débit. Nous espérons qu'ultimement, les contributions de cette thèse permettront la détection de biomarqueurs associés à différents phénotypes dans des populations entières avec un maximum de précision et à une vitesse encore jamais vue. / Metabolomics is defined as the study of small molecules produced by a biological system. The main objective of metabolomic studies is the search of a molecular signature, constituted of biomarkers, that allow to distinguish two phenotypes (ex: sick and healthy). It can be applied to diverse fields such as health, nutrition, food and environment. Mass spectrometry coupled to liquid chromatography is the most common technique used in metabolomics since it offers sensibility and specificity. Unfortunately, the long running time of these analysis limits the size and impact of metabolomic studies. New approaches in high-throughput untargeted metabolomics, where a sample can be analyzed in seconds, try to overcome this limitation. This new paradigm increases the complexity of the different data analysis steps that follows that acquisition (data pre-treatment, biomarker discovery and metabolite identification). In this thesis, we propose different tools based on machine learning that aim at solving the new data analysis issues that arise from the increased number of samples and throughput. First, we present new algorithms to correct and align mass spectra to make them comparable in order to enable statistical analysis and machine learning. Second, we present MetaboDashboard, a tool that aims at simplifying and democratizing the use of machine learning approach for biomarker discovery in the context of untargeted metabolomics. An example of its usage in the context of viral respiratory tract infection is then presented. Finally, a neural network tool called DeepCCS, that allow the prediction of collisional cross section for metabolite identification is reported. Throughout this thesis, we demonstrate the use and impact of machine learning applied to different problems in untargeted metabolomics. The computational tools presented in this thesis are the first steps towards the development of new methods in high-throughput untargeted metabolomics. We hope that ultimately, the scientific contributions presented in this thesis will enable biomarker discovery for different phenotypes at the scale of whole population with a level of precision and speed never seen before.

La liaison de l'insuline à son récepteur de surface entraîne une autophosphorylation rapide de la sous-unité β du récepteur de l'insuline (RI), l'initiation de cascades de signalisation et l'internalisation rapide de complexes actifs dans l'appareil endosomal. L'autophosphorylation s'effectue sur trois tyrosines situées dans la boucle d'activation (Yl 146, Y1150, Y1151), deux tyrosines situées dans le domaine C-terminal (Y1316, Y1322) et d'une autre dans le domaine juxta-membranaire (Y960). Ces sites de phosphorylation ont été précédemment identifiés par des essais d'autophosphorylation effectués in vitro sur des fractions membranaires solubilisées. Dans le but d'identifier les sites tyrosines phosphorylés du RI internalisé in vivo, nous avons préparé des fractions Golgi/Endosomes (G/E) à partir de foie de rat suivant l'injection d'une dose d'insuline. Le RI a été immunoprécipité et analysé par spectrométrie de masse. Plusieurs sites de phosphorylation ont été identifiés et seules les formes mono phosphorylé Y1146 et Y1150 de la boucle d'activation ont été observées. Nous avons également identifié de façon non ambiguë plusieurs protéines associés au RI internalisé dont notamment Grb7 (growth factor receptor-bound protein 7), Grbl4 et ATIC (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase/IMP cyclohydrolase). Nous avons confirmé, par des immunoprécipitations croisées dans les fractions G/E, l'association entre le RI et ATIC, une protéine impliquée dans les deux dernières étapes de la voie de biosynthèse de novo des purines. Les résultats obtenus suggèrent la présence d'un nouveau mécanisme par lequel ATIC, une protéine relativement abondante dans le cytosol et ayant pour substrat naturel AICAR, un insulino-mimétique, pourrait être un régulateur important de la réponse insulinique in vivo.

L’électrochimie (EC) couplée à la spectrométrie de masse (MS) tend à devenir une technique de choix lors de l’étude et la prédiction des métabolites de différents types de substances. La possibilité de reproduire artificiellement par de l’instrumentation les étapes d’oxydation du métabolisme de médicaments est une des avenues intéressantes pour l’étude du devenir des contaminants émergents présents dans l’environnement. Le projet suivant vise à augmenter les connaissances sur les produits de transformation des composés émergents susceptibles d’être retrouvés dans l’environnement et sur les transformations électrochimiques de médicaments modèles. Une approche électrochimique avec potentiel contrôlé pour l’étude des produits de transformation de différents médicaments suivis d’une analyse par UPLC-QTOF-MS est présentée.

La synthèse peptidique non ribosomiale est réalisée par de grands complexes multienzymatiques, appelés synthétases, qui permettent la synthèse de peptide par une voie indépendante de l’intervention des ribosomes. Les peptides produits par cette voie de synthèse (NRPs) sont largement étudiés et divers outils d’analyse bioinformatique qui permettent la prédiction de la structure d’une synthétase ainsi que de la composition de son produit, sont disponibles. Ce type de synthèse peptidique a été décrit chez plusieurs microorganismes. Notre choix de modèle d’étude s’est porté sur les Pseudomonas fluorescents producteurs de deux types de NRPs, les lipopeptides cycliques (CLPs) et des sidérophores dont le plus représenté est la pyoverdine. L’étude de ces NRPs a été entreprise par des études expérimentales et bioinformatiques. Ces travaux ont permis de montrer le potentiel de synthèse non ribosomiale par une étude bioinformatique des 20 génomes de Pseudomonas disponibles. L’étude des synthétases de pyoverdine et l’extraction des signatures des domaines d’adénylation (A) ont permis d’améliorer la prédiction issue des outils d’analyse disponibles. Des expériences de feeding suivies par spectrométrie de masse MALDI-TOF ont permis de mettre en évidence des domaines A permissifs au sein des synthétases de pyoverdines. / The non-ribosomal peptide synthesis is performed by large multienzymatic complexes, called synthetases, which allow the synthesis of a peptide by a way independent of the intervention of the ribosomes. The peptides produced by this synthetic way (NRPS) are widely studied and various bioinformatics analysis tools that allow the prediction of the structure of the synthetase and the composition of his product, are available. This kind of peptide synthesis has been described in several microorganisms. Our choice focus on the fluorescent pseudomonads producing two types of NRPS, the cyclic lipopeptides (CLPS) and siderophores, the most represented is the pyoverdin. The study of these NRPS was performed by experimental and bioinformatics analysis. This work has demonstrated the potential of non-ribosomal synthesis by a bioinformatics study of the 20 avalaible genomes of Pseudomonas. Study of pyoverdine synthetases and extracting signatures of adenylation domains (A) have allowed to improving the prediction of the avalaible tools. Feeding experiments followed by MALDI-TOF helped to highlight permissive A domains in pyoverdins synthetases.

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