Les lymphocytes T régulateurs (Treg) jouent un rôle primordial dans l'établissement de la tolérance au soi et le contrôle des réactions inflammatoires. Dans les modèles expérimentaux, ainsi qu'en pathologie humaine, un défaut de cette population de Treg favorise le développement d'affections auto-immunes, soulignant ainsi le potentiel thérapeutique de ces Treg. Afin de mieux exploiter ce potentiel, il est donc indispensable de caractériser les mécanismes moléculaires qui influencent le développement et les fonctions suppressives de ces cellules. Mon projet de thèse a donc consisté à caractériser à grande échelle le protéome des Treg via une approche protéomique de quantification sans marquage et de le comparer à celui des lymphocytes T conventionnels (Tconv) afin de définir une signature spécifique des Treg. L'analyse protéomique globale de ces deux sous-populations a été réalisée par nanoLC-MS/MS sur un spectromètre de masse de type orbitrap à séquençage rapide. L'optimisation du fractionnement peptidique via des colonnes chromatographiques de 50 cm en amont de l'analyse a permis d'augmenter la profondeur d'analyse du protéome jusqu'à plus de 3000 protéines par échantillon, et plus de 4000 protéines ont pu être identifiées à partir de l'analyse de 7 réplicats biologiques. En plus des protéines déjà décrites dans la littérature, de nombreuses protéines ont été mises en évidence comme étant surexprimées ou sous-exprimées dans les Treg par rapport aux Tconv, dont la fonction n'a jamais été étudiée dans les Treg. Parmi ces protéines, nous avons identifié la protéine Themis1 comme particulièrement sous-exprimée dans les Treg. En utilisant un modèle de souris transgénique surexprimant Themis1, nous avons pu étudier le rôle de cette protéine dans le contrôle des fonctions suppressives des Treg à l'aide de tests de suppression in vitro et dans un modèle in vivo de colite. Nos résultats montrent que la surexpression de Themis1 dans les Treg augmente leurs fonctions suppressives, suggérant que Themis1 régule positivement la fonction des Treg. Themis1 est une protéine impliquée dans le contrôle de la signalisation du récepteur T (TCR), ainsi elle pourrait être spécifiquement sous-exprimée dans ces cellules de façon à " freiner " la signalisation du récepteur T (TCR), afin d'éviter une fonction excessive des Treg qui pourrait avoir des effets délétères comme par exemple le développement de cancers. / Regulatory T cells (Treg) play a key role in establishing self-tolerance and controling inflammatory responses. In experimental models and in human diseases, a defect of this population promotes the development of autoimmune diseases, highlighting the therapeutic potential of Treg. To better exploit this potential, it is essential to characterize the molecular mechanisms that influence the development and the suppressive functions of these cells. My thesis project was therefore to perform a large-scale mass spectrometry study of the Treg proteome, and compare it to the proteome of conventionnal T cells (Tconv) using label-free quantitative methods, in order to identify new Treg markers and functionally important proteins. The comprehensive proteomic analysis of Treg and Tconv subpopulations was performed by single-run nanoLC-MS/MS on a fast-sequencing Orbitrap mass spectrometer. The optimization of peptide fractionation on 50 cm chromatographic columns increased the depth of the proteomic analysis to over 3000 proteins per sample, and in total more than 4000 proteins could be identified from the analysis of 7 biological replicates. Besides "historical" proteins that characterize Treg, many proteins have been identified as being over-expressed or under-expressed in Treg compared to Tconv, whose function has never been studied in Treg. Among them, we identified the Themis1 protein as particularly under-expressed in Treg. Using a transgenic mouse model overexpressing Themis1, we studied the role of this protein in the control of the suppressive functions of Treg, both in vitro through co-culture tests and in vivo in a mouse model of inflammatory bowel disease. Our results show that the overexpression of Themis1 in Treg increases their suppressive functions, suggesting that Themis1 positively regulates the function of Treg. Themis1 is a protein implicated in the control of T cell receptor (TCR) signaling. Thus Themis1 could be specifically under-expressed in these cells to tune down TCR signaling in order to moderate their suppressive action, and permit the development of efficient immune responses against pathogens and tumors.

En plus de leurs propriétés structurales comme constituants majeurs des membranes biologiques des cellules, les lipides jouent de nombreux rôles dans la signalisation cellulaire, le stockage d’énergie et le transport de protéines. Leurs importances biologiques ont mené à une augmentation accrue des méthodes analytiques pour la caractérisation d’espèces moléculaires uniques. De récents progrès en spectrométrie de masse ont amené à la caractérisation et à la quantification des espèces moléculaires des lipides dans des extraits lipidiques bruts (Han and Gross, 2005; Murphy et al., 2001). Par exemple, les espèces moléculaires de phospholipides peuvent être identifiées spécifiquement par leur tête polaire, la nature de leurs chaînes d’acide gras et leur positionnement au niveau du squelette glycérol. / In addition to their structural properties as main constituents of biological membranes, lipids play a multitude of roles such as in cell signalling, energy storage, and protein transport. Their biological importance has led to an increasing focus on analytical methods for the characterisation of their individual molecular species. Improvements in mass spectrometric technology has provided a great advantage for the characterisation and quantification of molecular lipid species in total lipid extracts (Han and Gross, 2005; Murphy et al., 2001). For instance, phospholipid molecular species can be identified on the basis of a characteristic fragment of the lipid class, the nature of the acyl chains and their positions on the glycerol backbone.A method allowing the quantitative profiling of the yeast lipidome was developed in a recent study using automated shotgun infusion strategy (Ejsing et al., 2009). We applied this method to characterise several lysophospholipid acyltransferase yeast mutants produced using reverse-genetics. These enzymes are involved in essential biological processes like de novo synthesis or remodelling of the phospholipid membrane component (Testet et al., 2005; Le Guedard et al., 2009). The comparative analysis of phospholipid molecular species from the wild-type strain and the corresponding deletion mutants has allowed us to identify lipid compositional changes, and has given us significant indications about the in vivo function of the encoded lysophospholipid acyltransferases.

La découverte de nouveaux médicaments par le criblage biomoléculaire est au centre de la recherche pharmaceutique actuelle. La spectrométrie de masse, en tant que technique d’analyse fiable, reproductible, sensible, spécifique, compatible avec de nombreux types d’échantillons et permettant un débit d’analyse conséquent, trouve ainsi sa place dans les stratégies de recherche et développement de nouveaux médicaments. Le but de ce travail était de mettre en place et de valider une stratégie originale, impliquant la désorption/ionisation laser assistée par matrice couplée à la spectrométrie de masse (MALDI-MS) comme technique de détection, en vue du criblage de la liaison de composés à des cibles moléculaires applicable directement à des extraits de plantes. Le protocole que nous avons développé s’articule en trois étapes successives qui sont l’incubation des molécules à tester avec la cible moléculaire choisie (la tubuline ou la DHFR), l’élimination des composés non liés et enfin l’analyse par MALDI-TOFMS des composés liés. Notre démarche a fait l’objet d’une démarche de validation et les résultats pouvant être obtenus ont été discutés. Le débit pouvant être évalué à 60 échantillons en 1h50 à 3h30 soit de 18 à 32 échantillons à l’heure. Enfin, une démarche innovante nous a permis de prouver que notre approche pouvait être utile également en criblage secondaire. L’application de notre approche à des extraits bruts de plantes (Colchique d’Automne, Pervenche de Madagascar et Thé vert) à permis de mettre en évidence 20 molécules actives se liant à l’une ou l’autre des cibles moléculaires utilisées et d’évaluer l’affinité relative de l’une d’entre elles / Discovering new drugs by biomolecular screening is a central task of pharmaceutical research. Mass spectrometry, as a reliable, reproducible, sensitive and specific technique, compatible with a wide range of samples and offering an excellent throughput, shows its potential in different strategies of research and development. The aim of this work was to develop and validate a new strategy, involving matrix assisted laser desorption/ionization coupled to time of flight mass spectrometry (MALDI-TOFMS) to screen the ability of different compounds, including plant extracts, to bind to two biological targets (tubulin and DHFR). The protocol is therefore divided into three main steps : an incubation of the compounds to be tested with target, an elimination of all unbound compounds and the MALDI-TOFMS detection of target-bound compounds. Our protocol was validated and the results that can be obtained were discussed. The throughput offered by this technique was evaluated as 60 samples in 1h50 to 3h30, or 18 to 32 samples per hour. Finally, we developed a new approach to perform a secondary screening of active compounds. The protocol was applied to screen crude plants extracts (colchicum autumnale, catharanthus roseus and green tea) and allowed to find 20 tubulin-binding or DHFR-binding molecules, and the relative affinity of one of these was also evaluated

Dans le cadre de la mission de surveillance radiologique de l’environnement de l’Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), le Laboratoire de Mesure de la Radioactivité dans l’Environnement (LMRE) réalise la mesure de la concentration en activité dans différentes matrices environnementales. Il s’agit de matrices biologiques (mousses aquatiques, algues, lait, légumes …), de sols, d’eaux ou encore de filtres de prélèvement d’aérosols.Les radionucléides artificiels recherchés sont en très faible proportion par rapport à certains radionucléides naturels : le potassium 40 dans les matrices biologiques ou encore les descendants particulaires du radon dans les filtres d’aérosols. L’important fond Compton induit par ces radionucléides naturels dans le spectre gamma complique la détermination des radionucléides présents au niveau trace.Un moyen de s’affranchir de ce fond Compton est de faire une mesure par spectrométrie $gamma$ en coïncidence en utilisant au moins deux détecteurs. La méthode a été développée sur un système existant, le système anti-Compton constitué d’un détecteur germanium entouré d’un scintillateur NaI(Tl), avec le développement d’un algorithme d’analyse et de l’étalonnage par simulation Monte Carlo si nécessaire. De plus, un nouveau système de mesure en coïncidence a été conçu par simulation Monte Carlo puis mis en service pour pallier les limites du système anti-Compton. Ce nouveau système de mesure, nommé Léda, est composé de deux détecteurs germanium face à face, entourés d’un scintillateur NaI(Tl) ; il possède plusieurs voies de mesure, chacune présentant une amélioration en termes de limite de détection pour tous les radionucléides mesurés. / The French Institute of Radiation Protection and Nuclear Safety (IRSN) is in charge of the radiological surveillance of the environment. In this framework the Laboratory of Environment Radioactivity Measurement (LMRE) measures the radioactivity concentrations in various environmental samples: biological matrices (aquatic moss, seaweed, milk, vegetables …), soils, waters or aerosol filters.Artificial radionuclides searched are in low proportion compared to natural radionuclides: potassium 40 in biological matrices or radon particular daughters in aerosol filters. The significant Compton continuum induced in the gamma spectrum makes difficult the identification and the quantification of radionuclides present at trace level.The use of two detectors enables to make coincident spectrometry in order to decrease this Compton background. This technique was developed with an existing system of the laboratory, the anti-Compton system, composed of a germanium detector surrounded by a NaI(Tl) scintillator. A data analysis algorithm was developed and also a Monte Carlo calibration if radionuclides measured are not available in standard source. Moreover a new coincident measurement system was designed by Monte Carlo simulation, called Leda consisting of two germanium detectors face to face surrounded by a NaI(Tl) scintillator. This new system overcomes the limits of the anti-Compton system. Different measurement channels improve the detection limits for all radionuclides measured in our laboratory.

La métabolomique non ciblée est une approche visant à caractériser le contenu métabolique d’un échantillon biologique. Cela permet d’évaluer les changements phénotypiques ayant lieux en son sein. Au cours de cette thèse, une cohorte de patients souffrant d’encéphalopathie hépatique (EH) a été étudiée en métabolomique, en association avec de la lipidomique et de la glycomique. L’EH est une maladie dont les mécanismes sont encore mal compris mais avec un impact important médicale et sociétal. Ces travaux ont montré que l’EH est associée à une altération du métabolisme énergétique observable dans le sang et dans le liquide céphalorachidien. A la suite de cette étude et face aux limites mises en exergue, la suite de ces travaux a visé à développer de nouvelles approches analytiques en métabolomique. Nous ainsi avons montré que l’utilisation de nouveaux instruments de type Orbitrap-Fusion, permettant d’atteindre de très hautes résolutions, donne accès à la structure isotopique fine des métabolites ce qui facilite leur l’identification. L’étude de la fragmentation MS² des ions a permis de mieux comprendre des mécanismes mis en jeu, améliorant l'interprétation des spectres. Enfin, nous avons montré que les améliorations apportées aux instruments, notamment en termes de vitesse d’acquisition, permettaient d’envisager la mise en place de nouveaux modes d’acquisition basés sur l’acquisition multi-événements de spectres MS et MS². Ces améliorations proposées devraient rapidement être utilisables et applicables à l'étude métabolomique de nouvelles cohortes médicales. / Untargeted metabolomics aims at studying the whole metabolite content of biological media. This allows to assess phenotypic changes in these samples. In the frame of this work, a cohort of patients suffering from hepatic encephalopathy (HE) was studied using metabolomics, in association with lipidomics and glycomics. HE is a disease still poorly understood, but with high medical and social impact. This work, performed on cerebrospinal fluid and blood samples, demonstrates that HE is associated to an alteration of energy metabolism. Then, considering the limitations of metabolomics raised in our first study, we aim at developing new analytical chemistry methods for metabolomics. We demonstrate that the use of new instrument such as Orbitrap Fusion, which can reach very high resolution, gives acces to isotopic fine structure of metabolites, thus facilitating their identification. Furthermore, the study of ion fragmentation from MS² spectra enabled to better understand the involved mechanisms and should help for interpreting MS² spectra obtained from unknown metabolites. Finally, we showed that improvements achieved with the Orbitrap Fusion instrument in terms of data acquisition speed enables the implementation of new acquisition modes based on multi events MS and MS² acquisition, such as data dependent or data idependant acquisitions. All these improvements in the field of metabolomics should rapidly be applicable to medical cohort analyses.

L'hepcidine est un petit peptide jouant un rôle clef dans le métabolisme ferrique. Dans la première partie de cette thèse, une méthode de quantification de l'hepcidine sérique et urinaire est développée par spectrométrie de masse en tandem avec évaluation des critères de fiabilité analytique et maitrise des paramètres pré-analytiques. La deuxième partie est centrée sur l'identification d'un agent stabilisateur pour la mesure de l’hepcidine urinaire et l'évaluation de l’efficience diagnostique de l’hepcidinurie sur collecte de 24h pour l’identification d’une carence martiale. Dans la troisième partie, l’intérêt de la détermination de l’hepcidine sérique basale ou de sa cinétique quatre heures après un test d’absorption en fer oral est évalué dans le cadre du diagnostic différentiel des anémies du sujet âgé. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce mémoire décrit plusieurs travaux concernant le traitement de données et l’analyse de spectres de masse à haut débit. La spectrométrie de masse est une méthode connue de mesure chimique. Appliquée à des échantillons biologiques, la spectrométrie de masse devient alors une technique de mesure métabolomique, c’est-à-dire mesurant l’ensemble des métabolites de l’échantillon, soit les petites molécules composant le fluide biologique et qui interagissent avec le métabolisme. Le projet présenté ici est effectué en partenariat avec Héma-Québec afin de concevoir de nouveaux tests de contrôle de qualité à partir de spectrométrie de masse. L’application de la technologie de la source LDTD à la spectrométrie de masse permet d’acquérir des spectres à haut-débit. Cela représente un bénéfice au coût de l’acquisition des spectres ainsi qu’à la rapidité du processus. On peut ainsi obtenir de grandes quantités de spectres afin de construire des ensembles de données. On peut ensuite appliquer le domaine informatique de l’apprentissage automatique à ces données. On peut utiliser ce domaine afin de classifier les spectres d’échantillons de produits sanguins et fournir des garanties statistiques sur cette classification. L’utilisation d’algorithmes parcimonieux et interprétables peut aussi mener à la découverte de biomarqueurs. Les travaux présentés ici concernent la conception de deux méthodes de traitement des spectres de masse. La première méthode est la correction par masses de verrouillage virtuelles, utilisée pour corriger les biais de mesure uniformes. La seconde est une méthode d’alignement, qui est un outil de correction d’erreurs de lecture. De plus, une nouvelle méthode à noyau, soit une méthode mathématique de comparaison entre des exemples, fut mise au point spécifiquement pour le travail avec des spectres de masse. Finalement, des résultats de classification sur spectres de masse acquis par LDTD et par spectrométrie de masse avec chromatographie liquide sont présentés. / This memoir describes work concerning the treatment and analysis of high-throughput mass spectrometry. Mass spectrometry is a tried and tested method of chemical measurement in a sample. Applied to biological samples, mass spectrometry becomes a metabolomic measurement technique, meaning that it measures the metabolites contained in a sample, which are small molecules present in the biological fluid that interact with the individual’s metabolism. The project that is presented here is a partnership with Hema-Québec in order to conceive new quality control tests from mass spectrometry measurements. The application of the LDTD ionisation source in mass spectrometry makes the acquisition of spectra in high-throughput possible. This represents a large benefit in terms of experimental costs and in time. Large datasets of mass spectra can then be obtained in a short period of time. The computer science domain of machine learning can then be applied to this data. Statistical machine learning can then be used to classify the spectra of blood product samples and provide statistical guarantees on this classification. The use of sparse and interpretable machine learning algorithms can also lead to the discovery of biomarkers. The work presented in this memoir concerns the design of two methods of treatment of mass spectra. The first of these methods is the correction by virtual lock masses, used to correct any uniform shift in the masses in a spectra. The second is a new method of peak alignment used to correct slight measuring errors. In addition, a new kernel method, a method to mathematically compare examples, was designed specifically for application on mass spectra data. Finally, results of classification on mass spectra acquired with an LDTD ionisation source and by liquid chromatography mass spectrometry will be presented.

La mesure nucléaire non destructive doit apporter des réponses aux grands enjeux de l'industrie nucléaire que sont la sûreté des installations nucléaires et la santé, l'impact environnemental, la performance, la fiabilité et la maîtrise des coûts. Elle a pour but de caractériser, sans le dégrader, un objet, contaminé par un ou des radionucléides. Qu'elle soit active ou passive, elle est déployée pour la quantification des radionucléides présents dans les effluents, les déchets liquides et solides, l'évaluation des masses de matières en rétention. Elle est aussi déployée de manière qualitative et/ou quantitative pour le suivi de procédé. Dans ce cas, elle revêt un caractère de contrôle de qualité de production mais la plupart du temps elle constitue un caractère de surveillance du respect du référentiel autorisé de fonctionnement de l'unité de production nucléaire. Les résultats issus de ces mesures alimentent directement le suivi matière et les inventaires radiologiques des produits nucléaires. La notion d'inventaire radiologique est notamment liée aux exutoires pour ce qui concerne les déchets tandis que la notion d'inventaire matière est liée au suivi des matières nucléaire des unités de criticité. L'objectif est donc de donner une valeur quantitative et/ou qualitative avec les incertitudes associées, détaillées et chiffrées, sur les radionucléides composant la contamination de l'objet. L'objet contaminé peut être de différentes formes géométriques, de taille et de composition physico-chimique. Pour être opérationnelle, la mesure nucléaire doit intégrer les appareils, les actions de mesure, l'établissement et l'utilisation des méthodologies associés. Je retrace, dans ce mémoire d' HDR, les principaux travaux de recherche et développement que j'ai mené ou auxquels j'ai participé pour répondre à ces objectifs. Ces travaux portent sur la métrologie des rayonnements nucléaires et sont appliqués sur trois principaux types de mesures que sont la spectrométrie gamma, la spectrométrie alpha et le comptage neutronique passif ou actif.

Cette thèse présente l'étude de l'interaction d'ions multichargés de basse énergie (quelques 10 keV) avec des systèmes complexes d'intérêt biologique (acides aminés et base azotée). Dans ce cadre, l'objectif de travail se situe dans la compréhension et la mise en évidence d'effets de l'environnement moléculaire. Afin d'étudier ce phénomène, les spectres en temps de vol des produits cationiques issus de la collision ont été comparés dans le cas de molécules isolées ou au sein d'agrégats purs ou mixtes. Il est apparu que l'environnement moléculaire permettait d'une part de protéger la molécule en autorisant la répartition de l'énergie et de la charge après la collision (se traduisant par une diminution de la fragmentation globale, la fermeture de certaines voies, ...). D'autre part, l'environnement semble susceptible de fragiliser certaines liaisons intramoléculaires comme l'illustre l'apparition de nouvelles voies de fragmentions dans les agrégats d'adénine. Enfin, l'agrégat constitue également un premier environnement chimique avec lequel la molécule va pouvoir interagir. Les spectres obtenus avec des agrégats hydratés d'adénine signent par exemple le transfert d'un proton depuis les molécules d'eau vers la base azotée. Plus surprenant encore, les ions multichargés semblent induire la formation de liaisons peptidiques au sein d'agrégats de beta-alanine. Ce dernier résultat a été étudié plus en détails en fonction de la taille des agrégats ou de l'ion projectile utilisé. Un certains nombre de critères (flexibilité et géométrie de la molécule, testées en utilisant d'autres acides aminés) ont été avancés pour prédire la formation de liaisons peptidiques.

La dosimétrie neutronique en réacteur se base sur l'analyse de l'activité de dosimètres irradiés, dont certains isotopes-cibles sont l'objet de réactions d'activation ou de fission sous l'effet des neutrons. Les différentes cibles sont sensibles aux neutrons d’énergie particulière. La caractérisation des spectres neutroniques est bien établie dans les domaines thermique, epithermique (Eneutron <1 keV) et rapide (Eneutron >1 MeV), mais il y a une absence de détecteur dans le domaine énergétique entre 1 keV et 1 MeV. Le travail de thèse a abouti sur un choix final: la capture (n, &#947;) sur les isotopes 92Zr et 94Zr, présents dans le zirconium naturel, pour former les isotopes 93Zr (stable) et 95Zr (radioactif). L'expérience ZIMA a été réalisée sur le réacteur OSIRIS pour démontrer la faisabilité de la méthode de détection proposée. Les analyses post-irradiation sont la spectrométrie &#947; et la spectrométrie de masse par accélérateur. Pour analyser les résultats expérimentaux, ZIMA a été simulée avec le code neutronique TRIPOLI-4 basé sur la méthode de Monte Carlo. Les rapports Calcul/Expérience présentés dans la thèse permettent de conclure que la détection neutronique (1 keV – 1 MeV) par capture de 94Zr et 92Zr donne des résultats probants. Les mesures obtenues sont exploitables. / Reactor dosimetry goal is to reconstruct neutron spectrum in a particular reactor location. Today we can reconstruct with precision thermal (<eV) and fast (>MeV) parts of neutron spectrum by using dosimeters with an adequate sensitivity. Nowadays there is no dosimeter for the intermediate energy region 1 keV - 1 MeV. Thus, the PhD goal is to select the 1 keV - 1 MeV sensible target-isotope and nuclear reaction and verify our solution by experimental irradiation. PhD final choice is for neutron capture reaction (n, &#947;) on 92Zr and 94Zr. Neutron irradiation produces 2 isotopes: 93Zr and 95Zr, stable and radioactive. Irradiation experiment was performed in OSIRIS reactor. Post-irradiation analyses of irradiated Zr samples are &#947; spectrometry and Accelerator Mass Spectrometry. In order to simulate irradiation experiment we performed calculation with neutron transport code TRIPOLI-4, based on Monte Carlo method. The goal of ZIMA (Zirconium Irradiation for Mass and Activity analysis) experiment was to prove the feasibility of 1 keV - 1 MeV neutron detection by (n,&#947;) capture on 92Zr and 94Zr under boron nitride filter. C/E ratios presented in this PhD allow us to conclude that activation of 94Zr and 92Zr gives us acceptable results.