Plusieurs tests médicaux, comme celui du dépistage du cancer du sein, se basent sur l’observation de section tissulaire sous un microscope. Ces tests se basent sur l’interprétation d’un spécialiste et les résultats peuvent varier d’un expert à un autre dû la subjectivité des observations. L’utilisation d’une technique analytique offrant une quantification et une identification de cibles moléculaires dans une section tissulaire permettrait aux experts de produire des diagnostics plus objectifs et diminuerait possiblement le nombre de faux diagnostics. Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur le développement d’une technique SPRi-MALDI-IMS permettant l’imagerie en deux dimensions de protéines contenues dans une section tissulaire. La MALDI-IMS est la technique de choix pour l’imagerie de biomolécules dans les sections tissulaires. Par contre, elle ne parvient pas à elle seule à quantifier de façon absolue le matériel adsorbé à la surface. Donc, le couplage de la MALDI-IMS avec la SPRi permet la quantification absolue de protéines en deux dimensions et crée une technique répondant aux besoins des experts médicaux. Pour ce faire, nous avons étudié, l’effet de la chimie de surface sur la nature et la quantité de matériel adsorbé à la surface du capteur. De plus, la cinétique de transfert des protéines du tissu vers le capteur a dû être optimisée afin de produire des empreintes correspondant au tissu d’origine, afin d’atteindre la gamme dynamique des instruments SPRi et MALDI-IMS. La technique résultante de ces optimisations permet d’obtenir les premières images quantitatives et qualitatives de protéines en deux dimensions d’une seule section tissulaire. / Several medical tests, such as breast cancer screening, are based on the observation of tissue section under a microscope. These tests rely on the interpretation of a specialist and the results can vary due to subjectivity of these analyses. Using an analytical technique able to quantify and identify molecular targets in a tissue section would enable experts to produce more objective diagnostic and possibly reduce the number of misdiagnosis. The work presented in this thesis focuses on the development of a SPRi-MALDI-IMS technique for imaging proteins in a tissue section. MALDI-IMS is the contemporary technique of choice for biomolecule imaging in tissue sections. However, absolute quantification of material absorbed to the surface cannot be performed using MALDI-IMS. The absolute quantification of proteins in two dimensions was successfully achieved by coupling of the MALDI-IMS with SPRi. Accordingly, we investigated by studying the nature of the surface chemistry and the amount of material adsorbed on the sensor’s surface. In addition, the kinetics of the protein transfer had to be optimized to produce imprints corresponding to the transferred tissue and to reach the dynamic ranges of both SPRi and MALDI-IMS instruments. The resulting technique led to quantitative and qualitative images of proteins in two dimensions of a single tissue section. It is envisioned that SPRi-MALDI-IMS can eventually meet the needs of medical experts for pathological screening.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'oxaliplatine est un médicament anticancéreux utilisé dans la chimiohyperthermie intrapéritonéale (CHIP), pour le traitement des carcinoses péritonéales (CP). En dépit de l'efficacité de la CHIP, l'infiltration de l'oxaliplatine dans les tumeurs traitées est très peu connue. L'étude de la pénétration du médicament dans des tumeurs prélevées à partir de patients atteints de CP et traités CHIP, a fait l'objet de la première partie du projet de recherche. Par ailleurs, les mécanismes de transport du médicament jusqu'à l'ADN cellulaire n'ont pas été bien déterminés. Néanmoins, des hypothèses suggèrent que certains métabolites soufrés de l'oxaliplatine pourraient constituer des "formes réservoirs", capables de transporter le médicament jusqu'à l'ADN. La deuxième partie du projet a consisté à étudier de manière plus approfondie la réactivité d'un des métabolites soufrés de l'oxaliplatine. Nous avons développé une méthode d'imagerie par spectrométrie de masse MALDI/TOF, qui permet de déterminer la distribution de l'oxaliplatine et ses métabolites, dans les tumeurs humaines traitées CHIP. Nos résultats révèlent une pénétration du médicament limitée à quelques millimètres et une détection exclusive du métabolite oxaliplatine-méthionine (Ox-M) : un métabolite considéré « inactif », puisqu'il serait stable et incapable d'interagir avec l'ADN. Afin de démontrer la réactivité de ce métabolite, nous avons tout d'abord étudié son interaction avec les cibles de l'oxaliplatine, à savoir la guanine et l'ADN. Nos résultats démontrent la capacité de Ox-M à libérer la partie réactive de la molécule pour interagir avec la guanine, et former des adduits sur des duplexes d'oligonucléotides qui miment la structure de l'ADN. De plus, les adduits formés par Ox-M induisent un arrêt de l'élongation de l'ADN. Ces résultats démontrent la réactivité du métabolite Ox-M de l'oxaliplatine, et suggèrent son implication dans une nouvelle voie active du médicament. / Oxaliplatin is an anticancer drug used in Heated Intraoperative Chemotherapy (HIPEC) to treat peritoneal carcinomatosis. In spite of HIPEC efficiency, oxaliplatin penetration in treated tumors is not very well known. Study of oxaliplatin penetration in tumors of patients suffering from CP and treated with HIPEC, was the first part of the research project. Furthermore, transport mechanisms of the drug to cell DNA are not well established. Nevertheless, hypotheses suggest that some sulfur metabolites of oxaliplatin, could constitute "tanks" which are able to transport drug until DNA. The second part of this project aimed to study more deeply the reactivity of oxaliplatin sulfur metabolites. We have developed a MALDI imaging mass spectrometry method, which allows studying the distribution of oxaliplatin and its metabolites in human tumors. Our results reveal a drug penetration limited to few millimeters and an exclusive detection of the oxaliplatin- methionine metabolite (Ox-M): a supposed "Inactive" metabolite, because of its stability that prevents its interaction with DNA. To provide evidence of Ox-M reactivity, we studied its interaction with oxaliplatin targets: guanine and DNA. Our results showed that Ox-M is able to release the active part of the molecule to interact with guanine, and to form adducts on oligonucleotides duplexes that mimic DNA structure. Moreover, Ox-M adducts induce an arrest of DNA elongation. These results suggest the implication of Ox-M in a new active pathway of oxaliplatin cytotoxicity.

L'émergence de disciplines post-génomiques, telles que la protéomique et la métabolomique, requiert le développement d'outils analytiques toujours plus performants afin de déterminer, respectivement, l'ensemble des peptides et protéines et des composés organiques de faible masse moléculaire présents dans un milieu biologique. En raison de sa sensibilité, spécificité et rapidité d'acquisition des données, la désorption/ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) constitue une des méthodes d'ionisation majeure en spectrométrie de masse (MS) permettant d'envisager les analyses de ces composés. Cependant, elle présente des limitations pour la détection de petites molécules (<700 Da) due à la présence des ions de matrice dans les basses masses du spectre. Dans ce contexte, le potentiel de différentes techniques LDI alternatives a été évalué dans le cadre de la détection de peptides synthétiques de compositions et de tailles variées. Dans le cadre de cette thèse, de nouvelles stratégies analytiques LDI-MS et LDI-MS/MS basées sur l'utilisation de matrices inertes ont été développées. Pour ce faire, des substrats, à base de silice et de titane présentant différentes structurations, ont été utilisés pour assister la désorption/ionisation sans ajout de matrice organique. L'optimisation des méthodologies a été réalisée, puis l'évaluation de la sensibilité et de la reproductibilité des techniques a ensuite été appréciée. Les problématiques de discrimination spectrale dans le cas d'analyses de mélanges de peptides synthétiques et ou issus de digestats trypsiques de protéines ont été abordées afin de valider ces méthodologies LDI pour des applications en protéomique. Les performances des méthodes ont été comparées à celles obtenues dans des stratégies LDI assistées par des matrices organiques (MALDI) pour des échantillons de peptides synthétiques seuls et en mélange ainsi que de quatre digestats trypsiques issus du Cytochrome C (12 kDa), de la β-Caséine (24 kDa), de l'albumine de sérum bovin (BSA, 66 kDa) et du fibrinogène (340 kDa). Un second aspect a consisté en l'analyse de peptide en spectrométrie de masse en tandem. Pour cela, des expériences de dissociation de peptides en fragmentation basse et haute énergie respectivement sur des appareillages de type ESI-QqTOF et MALDI-TOF/TOF ont été menées. Les résultats obtenus ont contribué à une meilleure compréhension du séquençage peptidique et ont démontré des comportements particuliers propres à certaines séquences observés quelles que soient les méthodes d'activation vibrationnelle employées. La présence de résidus basiques, à partir du moment où ils ne se trouvent pas en position C-terminale, a été déterminante pour déclencher des voies de fragmentation en compétition avec les dissociations bx-yn attendues. Ces comportements doivent être impérativement pris en compte par les logiciels de séquençage. / The advent of proteomics and metabolomics require the development of highly efficient analytical tool in order to detect and identify peptides and proteins as well as small organic compounds present in biological media. Due to its sensitivity, specificity and speed of data acquisition, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization constitutes one of the major ionization methods in mass spectrometry suitable for the analyses of biomolecules. However the sensitive detection of low molecular weight compounds (<700 Da) is most of the time troublesome, being hampered by the production of matrix ions in the low mass range. In that case, the potency of various alternative LDI techniques based on inert ionization promoting substrates was evaluated for the detection of synthetic peptides presenting wide sequence diversity. Silicon and titanium based materials exhibiting different physico-chemical properties were probed for LDI-MS and LDI-MS/MS analyses of the designed model peptides. These methods, which were devoted of the use of any organic matrix, were optimized through a large set of experiments, taking particular attention to detection sensitivity and reproducibility. Spectral discrimination was another matter of concern, especially in the case of peptide mixture analyses which is encountered in proteomics for tryptic digest elucidation. The performances of the design LDI methods were compared with the original MALDI technique for peptide detection and sequencing from various samples i.e. pure and mixed synthetic peptides, and four tryptic digests issued from Cytochrome C (12 kDa), β-Casein (24 kDa), Bovin serum albumin (BSA, 66 kDa) and fibrinogen (340 kDa). A second research topic dealing with peptide sequencing by MS/MS technologies was pursued in order to contribute to the knowledge of the fragmentation rules. Vibrational activation methods through various mass analyzer configurations (MALDI-TOF/TOF, ESI-QqTOF) were investigated. Specific dissociation behaviors were extracted from the recorded MS/MS data sets. The presence of basic residues, provided that they are not located at the peptide C-terminal end, triggered specific backbone fragmentation in competition to the expected bx-yn pathway. This was found to be a critical issue to be considered by sequencing softwares.

Les retardateurs de flamme bromés sont des agents ignifuges utilisés dans de nombreux produits manufacturés. Les plus courants sont les polybromodiphényl éther (PBDE), le tétrabromo-bisphénol A (TBBPA) et l'hexabromocyclododécane (HBCD). Ces composés considérés comme des polluants organiques persistants (POPs) sont désormais retrouvés dans l'environnement et chez l'Homme, et sont suspectés, ainsi que leurs métabolites, d'être des perturbateurs endocriniens. Des développements analytiques basés sur la spectrométrie de masse ont été engagés afin d'étudier le métabolisme in vitro du TBBPA et des PBDE et rechercher les composés parents et leurs métabolites dans différents prélèvements d'origine humaine. Les métabolites formés chez l'Homme ont ainsi été identifiés comme étant des conjugués pour le TBBPA, et des dérivés hydroxylés, dihydrodiol et conjugués pour les PBDE. La plupart de ces métabolites ont été identifiés et quantifiés dans les fluides biologiques humains, démontrant ainsi l'exposition du foetus et du nouveau-né à ces composés, à des niveaux similaires à ceux retrouvé dans d'autres pays. D'un point de vue qualitatif, la présence de métabolites potentiellement actifs sur des cibles cellulaires a été mise en évidence, ainsi que le passage des résidus vers le lait (TBBPA, HBCD) et/ou au travers de la barrière placentaire (TBBPA et PBDE). Un métabolite spécifique, présent en importantes (octa-BDE hydroxylé) pourrait être un bon biomarqueur d'exposition, et son potentiel toxique devrait par ailleurs être étudié / Brominated Flame Retardants are widely used for the manufacture of fire-proofed industrial products and consumer goods. Major BFRs are polybromodiphenyl ether (PBDE), tetrabromobisphenol A (TBBPA) and hexabromocyclododecane (HBCD). Considered as persistent organic pollutants (POPs), they are detected in various environmental compartments and human samples. Parent compounds as well as several metabolites could act as endocrine disruptors. Methodological developments based on mass spectrometry, in vitro approaches (TBBPA, PBDE) and an extensive review of the available literature have been used to sharpen our current knowledge of the fate of BFR, and to identify both parent compounds and metabolite in human samples. Results obtained in vitro using human primary hepatocyte cultures as well as human cell lines show that human cells biotransform TBBPA into conjugated metabolites and PBDE into hydroxylated, dihydrodiol and conjugated metabolites. Those metabolites were detected in human samples, demonstrating foetal and newborn exposition. BFR and some of their metabolites, including bioactive compounds, are transferred through the placental barrier (TBBPA, PBDE) and/or into milk (TBBPA, HBCD). Even though the monitored concentration levels were found to be low, one of these metabolites, namely (OH-octaBDE) was found to be abundant in almost all serum samples, and appears to be a relevant candidate biomarker of exposure

L'objectif de ce travail est l'élaboration de nouveaux matériaux nanocomposites hybrides à propriétés spécifiques (piézoélectricité, optique non-linéaire). Dans un premier temps, des modèles numériques simples portant sur les propriétés mécaniques des nanocomposites sont présentées, ainsi que des simulations de déformation réalisées sur les nanocomposites à nanoparticules piézoélectriques. Les résultats expérimentaux de caractérisation mécanique (par spectrométrie Brillouin) et tribologique de différents nanocomposites sont exposés, y compris de nanocomposites réalisés au sein du laboratoire. L'influence des nanoparticules et de leur fonctionnalisation sur la matrice polymère y est discutée, et en particulier leur incidence sur les volumes libres dans les nanocomposites. Plusieurs procédés de synthèse de nanoparticules aux propriétés piézoélectriques ont parallèlement été étudiées. En particulier, un protocole de synthèse de nanoparticules de LiNbO3 a été mis au point. Ces nanoparticules ont été caractérisées par des techniques structurales, chimiques et d'imagerie. Enfin, ces travaux ont conduit à l'élaboration de films nanocomposites à matrice PVDF-TrFE incorporant des nanoparticules produites en laboratoire ou d'origine commerciale. Les méthodes de polarisation des films sont décrites, et les propriétés piézoélectriques de ces films nanocomposites ont été mesurées. Plus particulièrement, des films nanocomposites PVDF-TrFE/Al2O3 polarisés présentant une bonne réponse piézoélectrique ont été élaborés. / This work aims at the elaboration of new hybrid nanocomposites with specific properties (piezoelectricity, non-linear optic). First, simple numeric modelings on mechanical properties of nanocomposites are presented, as well as simulation of deformation in nanocomposites with piezoelectric nanoparticles. Experimental results on tribological and mechanical (performed by Brillouin Spectroscopy) characterization of different nanocomposites are exposed. The influence of nanoparticles and their fonctionalization on the polymer matrix is discussed, and in particular the incidence on free volume in nanocomposites. Several piezoelectric nanoparticles synthesis processes have been also studied. In particular, a LiNbO3 nanoparticles synthesis protocol has been worked out. These nanoparticles were characterized by structural, chemical and imaging techniques. Finally, these works leads to the elaboration of PVDF-TrFE matrix thin films nanocomposites filled with commercial or produced in laboratory nanoparticles. The methods used to polarize the films are described. The piezoelectric properties of the nanocomposites have been measured. More particularly, PVDF-TrFE/Al2O3 nanocomposites thin films with a good piezoelectric response have been elaborated.

En contrôlant le passage para- et transcellulaire des composés du sang vers le cerveau (et inversement), la barrière hémato-encéphalique (BHE) constitue la « gardienne » du compartiment cérébral. Bien que relativement connu dans son aspect physiologique, le phénotype BHE des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (BCECs) reste mal compris au regard des mécanismes moléculaires qui gouvernent son établissement et son maintien. Dans cette optique, à l’aide du modèle in vitro de BHE développé au laboratoire (co-culture de BCECs bovines et de cellules gliales de rats), nous avons réalisé deux études protéomiques comparatives afin d’identifier les protéines cytoplasmiques potentiellement impliquées dans l’induction et le maintien de ce phénotype: d’une part une approche qualitative sans marquage (label free) et d’autre part une approche quantitative grâce à un marquage isotopique préalable des protéines (isotope-coded protein label, ICPL). Les deux approches, label free et ICPL se sont révélées complémentaires et ont permis, respectivement, l’identification de 447 et de 412 protéines (dont 290 quantifiées). Quatre protéines d’un intérêt particulier dans le domaine de la BHE (phosphatase alcaline tissu-non spécifique, TNAP ; protéine 1 possédant un domaine d’homologie à Eps15, EHD1 ; superoxyde dismutase, SODC et homologue 7 de la protéine de la maladie de Parkinson PARK7, DJ-1) ont fait l’objet de caractérisations biochimiques approfondies et ouvrent des pistes d’investigation sur des potentielles voies cellulaires induites par les cellules gliales et impliquées dans le phénotype BHE. / The blood-brain barrier (BBB) controls the para- and transcellular crossing of compounds from blood to brain (and inversely) and establishes the “gatekeepers” of the brain. The major part of therapeutic drugs developed to fight the brain diseases is deemed inefficient in vivo due to the presence of the BBB that they are unable to cross. Although relatively well known in its physiological aspect, the BBB phenotype of brain capillary endothelial cells (BCECs) remains largely under known and misunderstood in regards of the molecular mechanisms that govern its establishment and its maintenance. To this goal, using the in vitro BBB model developed in the laboratory (co-culture of bovine BCECs with rat glial cells), we performed two differential proteomic studies to identify the main cytoplasmic proteins involved in the establishment and maintenance of this phenotype: a qualitative label free approach and a quantitative isotope-coded protein labeling (ICPL) approach.The two different approaches, label free and ICPL, are complementary and led to the identification of 447 and 412 proteins, respectively. Four proteins of particular interest for BBB (tissue-non specific alkaline phosphatase, TNAP; Eps15 homology domain containing protein 1, EHD1; superoxide dismutase, SODC and Parkinson disease protein 7 homolog PARK7, DJ-1) have been more deeply studied and they open new discovery prospects related to cellular pathways induced by glial cells and involved in the BBB phenotype.

Mes travaux de thèse mettent en avant le développement de la stratégie métabonomique dans le cadre de deux thématiques d'actualité : le domaine du dopage sportif (Partie A) et celui de l'Exposome (Partie B). La première partie regroupe deux études et a pour objectif d'évaluer la contribution de la métabonomique au développement de nouveaux outils de criblage du dopage. Au cours de ces études, je me suis intéressée à l'analyse non-ciblée d'échantillons d'urine d'athlètes dopés et non- dopés, fournis par l'Agence Française de Lutte contre le Dopage et par des volontaires. L'originalité de cette démarche réside dans son caractère non-ciblé et plus particulièrement, dans sa capacité à mettre en évidence des perturbations au niveau métabolique grâce à (i) la spectrométrie de masse haute résolution (ToF) et très-haute résolution (FT-ICR) et (ii) l'analyse de données multivariées. Des potentiels biomarqueurs du dopage au tétrahydrocannabinol, salbutamol et budésonide ont ainsi pu être mis en évidence. La deuxième partie de ma thèse a pour objectif d'évaluer l'impact de la vinclozoline sur le système hormonal de rats et répond ainsi aux besoins de la nouvelle réglementation. Pour cette étude, je me suis donc intéressée aux échantillons de testicules de rats ayant subi un traitement à la vinclozoline. De par son caractère compréhensif, l'approche métabonomique m'a permis d'apporter des informations complémentaires aux études ciblées réalisées auparavant. Ces travaux me permettent alors de mettre en évidence les apports et les limites de la stratégie métabonomique par rapport : (1) au choix et à la préparation des échantillons d'origine biologique, (2) aux avantages et aux inconvénients des différentes techniques analytiques, (3) aux possibilités en termes de traitement des données, (4) aux exigences statistiques et (5) à la valeur biologique des résultats obtenus / My research work highlights the development of a metabonomic strategy through two topical issues: the doping in sport (Part A) and the Exposome (Part B). The first part includes two studies and aims to assess the contribution of metabonomics to the development of new screening tools. During these studies, I focused on the non-targeted analysis of clean and doped urine samples provided by the French Anti-Doping Agency and by volunteers. The originality of this approach lies in its non-targeted nature and, particularly, in its ability to highlight metabolic disruptions by (i) high-resolution (ToF) and very high-resolution (FT ICR) mass spectrometry and (ii) the analysis of multivariate data. The implemented strategy revealed several potential biomarkers for the use of tetrahydrocannabinol, budesonide and salbutamol. The second part of this thesis aims to evaluate the impact of vinclozolin on the hormonal system of rats and thus meets the requirements of the new regulations. For this study, I focused on testes extracts coming from rats treated with vinclozolin. Due to its comprehensive nature, the metabonomic study provided additional information to the previous targeted approach. All these results highlight the contributions and the limitations of metabonomics with regard to: (1) the choice and the preparation of biological samples, (2) the advantages and disadvantages of different analytical techniques, (3) the opportunities in terms of data processing, (4) the statistical requirements and (5) the biological value of the results