L'oxaliplatine est un médicament anticancéreux utilisé dans la chimiohyperthermie intrapéritonéale (CHIP), pour le traitement des carcinoses péritonéales (CP). En dépit de l'efficacité de la CHIP, l'infiltration de l'oxaliplatine dans les tumeurs traitées est très peu connue. L'étude de la pénétration du médicament dans des tumeurs prélevées à partir de patients atteints de CP et traités CHIP, a fait l'objet de la première partie du projet de recherche. Par ailleurs, les mécanismes de transport du médicament jusqu'à l'ADN cellulaire n'ont pas été bien déterminés. Néanmoins, des hypothèses suggèrent que certains métabolites soufrés de l'oxaliplatine pourraient constituer des "formes réservoirs", capables de transporter le médicament jusqu'à l'ADN. La deuxième partie du projet a consisté à étudier de manière plus approfondie la réactivité d'un des métabolites soufrés de l'oxaliplatine. Nous avons développé une méthode d'imagerie par spectrométrie de masse MALDI/TOF, qui permet de déterminer la distribution de l'oxaliplatine et ses métabolites, dans les tumeurs humaines traitées CHIP. Nos résultats révèlent une pénétration du médicament limitée à quelques millimètres et une détection exclusive du métabolite oxaliplatine-méthionine (Ox-M) : un métabolite considéré « inactif », puisqu'il serait stable et incapable d'interagir avec l'ADN. Afin de démontrer la réactivité de ce métabolite, nous avons tout d'abord étudié son interaction avec les cibles de l'oxaliplatine, à savoir la guanine et l'ADN. Nos résultats démontrent la capacité de Ox-M à libérer la partie réactive de la molécule pour interagir avec la guanine, et former des adduits sur des duplexes d'oligonucléotides qui miment la structure de l'ADN. De plus, les adduits formés par Ox-M induisent un arrêt de l'élongation de l'ADN. Ces résultats démontrent la réactivité du métabolite Ox-M de l'oxaliplatine, et suggèrent son implication dans une nouvelle voie active du médicament. / Oxaliplatin is an anticancer drug used in Heated Intraoperative Chemotherapy (HIPEC) to treat peritoneal carcinomatosis. In spite of HIPEC efficiency, oxaliplatin penetration in treated tumors is not very well known. Study of oxaliplatin penetration in tumors of patients suffering from CP and treated with HIPEC, was the first part of the research project. Furthermore, transport mechanisms of the drug to cell DNA are not well established. Nevertheless, hypotheses suggest that some sulfur metabolites of oxaliplatin, could constitute "tanks" which are able to transport drug until DNA. The second part of this project aimed to study more deeply the reactivity of oxaliplatin sulfur metabolites. We have developed a MALDI imaging mass spectrometry method, which allows studying the distribution of oxaliplatin and its metabolites in human tumors. Our results reveal a drug penetration limited to few millimeters and an exclusive detection of the oxaliplatin- methionine metabolite (Ox-M): a supposed "Inactive" metabolite, because of its stability that prevents its interaction with DNA. To provide evidence of Ox-M reactivity, we studied its interaction with oxaliplatin targets: guanine and DNA. Our results showed that Ox-M is able to release the active part of the molecule to interact with guanine, and to form adducts on oligonucleotides duplexes that mimic DNA structure. Moreover, Ox-M adducts induce an arrest of DNA elongation. These results suggest the implication of Ox-M in a new active pathway of oxaliplatin cytotoxicity.

L'émergence de disciplines post-génomiques, telles que la protéomique et la métabolomique, requiert le développement d'outils analytiques toujours plus performants afin de déterminer, respectivement, l'ensemble des peptides et protéines et des composés organiques de faible masse moléculaire présents dans un milieu biologique. En raison de sa sensibilité, spécificité et rapidité d'acquisition des données, la désorption/ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) constitue une des méthodes d'ionisation majeure en spectrométrie de masse (MS) permettant d'envisager les analyses de ces composés. Cependant, elle présente des limitations pour la détection de petites molécules (<700 Da) due à la présence des ions de matrice dans les basses masses du spectre. Dans ce contexte, le potentiel de différentes techniques LDI alternatives a été évalué dans le cadre de la détection de peptides synthétiques de compositions et de tailles variées. Dans le cadre de cette thèse, de nouvelles stratégies analytiques LDI-MS et LDI-MS/MS basées sur l'utilisation de matrices inertes ont été développées. Pour ce faire, des substrats, à base de silice et de titane présentant différentes structurations, ont été utilisés pour assister la désorption/ionisation sans ajout de matrice organique. L'optimisation des méthodologies a été réalisée, puis l'évaluation de la sensibilité et de la reproductibilité des techniques a ensuite été appréciée. Les problématiques de discrimination spectrale dans le cas d'analyses de mélanges de peptides synthétiques et ou issus de digestats trypsiques de protéines ont été abordées afin de valider ces méthodologies LDI pour des applications en protéomique. Les performances des méthodes ont été comparées à celles obtenues dans des stratégies LDI assistées par des matrices organiques (MALDI) pour des échantillons de peptides synthétiques seuls et en mélange ainsi que de quatre digestats trypsiques issus du Cytochrome C (12 kDa), de la β-Caséine (24 kDa), de l'albumine de sérum bovin (BSA, 66 kDa) et du fibrinogène (340 kDa). Un second aspect a consisté en l'analyse de peptide en spectrométrie de masse en tandem. Pour cela, des expériences de dissociation de peptides en fragmentation basse et haute énergie respectivement sur des appareillages de type ESI-QqTOF et MALDI-TOF/TOF ont été menées. Les résultats obtenus ont contribué à une meilleure compréhension du séquençage peptidique et ont démontré des comportements particuliers propres à certaines séquences observés quelles que soient les méthodes d'activation vibrationnelle employées. La présence de résidus basiques, à partir du moment où ils ne se trouvent pas en position C-terminale, a été déterminante pour déclencher des voies de fragmentation en compétition avec les dissociations bx-yn attendues. Ces comportements doivent être impérativement pris en compte par les logiciels de séquençage. / The advent of proteomics and metabolomics require the development of highly efficient analytical tool in order to detect and identify peptides and proteins as well as small organic compounds present in biological media. Due to its sensitivity, specificity and speed of data acquisition, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization constitutes one of the major ionization methods in mass spectrometry suitable for the analyses of biomolecules. However the sensitive detection of low molecular weight compounds (<700 Da) is most of the time troublesome, being hampered by the production of matrix ions in the low mass range. In that case, the potency of various alternative LDI techniques based on inert ionization promoting substrates was evaluated for the detection of synthetic peptides presenting wide sequence diversity. Silicon and titanium based materials exhibiting different physico-chemical properties were probed for LDI-MS and LDI-MS/MS analyses of the designed model peptides. These methods, which were devoted of the use of any organic matrix, were optimized through a large set of experiments, taking particular attention to detection sensitivity and reproducibility. Spectral discrimination was another matter of concern, especially in the case of peptide mixture analyses which is encountered in proteomics for tryptic digest elucidation. The performances of the design LDI methods were compared with the original MALDI technique for peptide detection and sequencing from various samples i.e. pure and mixed synthetic peptides, and four tryptic digests issued from Cytochrome C (12 kDa), β-Casein (24 kDa), Bovin serum albumin (BSA, 66 kDa) and fibrinogen (340 kDa). A second research topic dealing with peptide sequencing by MS/MS technologies was pursued in order to contribute to the knowledge of the fragmentation rules. Vibrational activation methods through various mass analyzer configurations (MALDI-TOF/TOF, ESI-QqTOF) were investigated. Specific dissociation behaviors were extracted from the recorded MS/MS data sets. The presence of basic residues, provided that they are not located at the peptide C-terminal end, triggered specific backbone fragmentation in competition to the expected bx-yn pathway. This was found to be a critical issue to be considered by sequencing softwares.

Les retardateurs de flamme bromés sont des agents ignifuges utilisés dans de nombreux produits manufacturés. Les plus courants sont les polybromodiphényl éther (PBDE), le tétrabromo-bisphénol A (TBBPA) et l'hexabromocyclododécane (HBCD). Ces composés considérés comme des polluants organiques persistants (POPs) sont désormais retrouvés dans l'environnement et chez l'Homme, et sont suspectés, ainsi que leurs métabolites, d'être des perturbateurs endocriniens. Des développements analytiques basés sur la spectrométrie de masse ont été engagés afin d'étudier le métabolisme in vitro du TBBPA et des PBDE et rechercher les composés parents et leurs métabolites dans différents prélèvements d'origine humaine. Les métabolites formés chez l'Homme ont ainsi été identifiés comme étant des conjugués pour le TBBPA, et des dérivés hydroxylés, dihydrodiol et conjugués pour les PBDE. La plupart de ces métabolites ont été identifiés et quantifiés dans les fluides biologiques humains, démontrant ainsi l'exposition du foetus et du nouveau-né à ces composés, à des niveaux similaires à ceux retrouvé dans d'autres pays. D'un point de vue qualitatif, la présence de métabolites potentiellement actifs sur des cibles cellulaires a été mise en évidence, ainsi que le passage des résidus vers le lait (TBBPA, HBCD) et/ou au travers de la barrière placentaire (TBBPA et PBDE). Un métabolite spécifique, présent en importantes (octa-BDE hydroxylé) pourrait être un bon biomarqueur d'exposition, et son potentiel toxique devrait par ailleurs être étudié / Brominated Flame Retardants are widely used for the manufacture of fire-proofed industrial products and consumer goods. Major BFRs are polybromodiphenyl ether (PBDE), tetrabromobisphenol A (TBBPA) and hexabromocyclododecane (HBCD). Considered as persistent organic pollutants (POPs), they are detected in various environmental compartments and human samples. Parent compounds as well as several metabolites could act as endocrine disruptors. Methodological developments based on mass spectrometry, in vitro approaches (TBBPA, PBDE) and an extensive review of the available literature have been used to sharpen our current knowledge of the fate of BFR, and to identify both parent compounds and metabolite in human samples. Results obtained in vitro using human primary hepatocyte cultures as well as human cell lines show that human cells biotransform TBBPA into conjugated metabolites and PBDE into hydroxylated, dihydrodiol and conjugated metabolites. Those metabolites were detected in human samples, demonstrating foetal and newborn exposition. BFR and some of their metabolites, including bioactive compounds, are transferred through the placental barrier (TBBPA, PBDE) and/or into milk (TBBPA, HBCD). Even though the monitored concentration levels were found to be low, one of these metabolites, namely (OH-octaBDE) was found to be abundant in almost all serum samples, and appears to be a relevant candidate biomarker of exposure

En contrôlant le passage para- et transcellulaire des composés du sang vers le cerveau (et inversement), la barrière hémato-encéphalique (BHE) constitue la « gardienne » du compartiment cérébral. Bien que relativement connu dans son aspect physiologique, le phénotype BHE des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (BCECs) reste mal compris au regard des mécanismes moléculaires qui gouvernent son établissement et son maintien. Dans cette optique, à l’aide du modèle in vitro de BHE développé au laboratoire (co-culture de BCECs bovines et de cellules gliales de rats), nous avons réalisé deux études protéomiques comparatives afin d’identifier les protéines cytoplasmiques potentiellement impliquées dans l’induction et le maintien de ce phénotype: d’une part une approche qualitative sans marquage (label free) et d’autre part une approche quantitative grâce à un marquage isotopique préalable des protéines (isotope-coded protein label, ICPL). Les deux approches, label free et ICPL se sont révélées complémentaires et ont permis, respectivement, l’identification de 447 et de 412 protéines (dont 290 quantifiées). Quatre protéines d’un intérêt particulier dans le domaine de la BHE (phosphatase alcaline tissu-non spécifique, TNAP ; protéine 1 possédant un domaine d’homologie à Eps15, EHD1 ; superoxyde dismutase, SODC et homologue 7 de la protéine de la maladie de Parkinson PARK7, DJ-1) ont fait l’objet de caractérisations biochimiques approfondies et ouvrent des pistes d’investigation sur des potentielles voies cellulaires induites par les cellules gliales et impliquées dans le phénotype BHE. / The blood-brain barrier (BBB) controls the para- and transcellular crossing of compounds from blood to brain (and inversely) and establishes the “gatekeepers” of the brain. The major part of therapeutic drugs developed to fight the brain diseases is deemed inefficient in vivo due to the presence of the BBB that they are unable to cross. Although relatively well known in its physiological aspect, the BBB phenotype of brain capillary endothelial cells (BCECs) remains largely under known and misunderstood in regards of the molecular mechanisms that govern its establishment and its maintenance. To this goal, using the in vitro BBB model developed in the laboratory (co-culture of bovine BCECs with rat glial cells), we performed two differential proteomic studies to identify the main cytoplasmic proteins involved in the establishment and maintenance of this phenotype: a qualitative label free approach and a quantitative isotope-coded protein labeling (ICPL) approach.The two different approaches, label free and ICPL, are complementary and led to the identification of 447 and 412 proteins, respectively. Four proteins of particular interest for BBB (tissue-non specific alkaline phosphatase, TNAP; Eps15 homology domain containing protein 1, EHD1; superoxide dismutase, SODC and Parkinson disease protein 7 homolog PARK7, DJ-1) have been more deeply studied and they open new discovery prospects related to cellular pathways induced by glial cells and involved in the BBB phenotype.

Mes travaux de thèse mettent en avant le développement de la stratégie métabonomique dans le cadre de deux thématiques d'actualité : le domaine du dopage sportif (Partie A) et celui de l'Exposome (Partie B). La première partie regroupe deux études et a pour objectif d'évaluer la contribution de la métabonomique au développement de nouveaux outils de criblage du dopage. Au cours de ces études, je me suis intéressée à l'analyse non-ciblée d'échantillons d'urine d'athlètes dopés et non- dopés, fournis par l'Agence Française de Lutte contre le Dopage et par des volontaires. L'originalité de cette démarche réside dans son caractère non-ciblé et plus particulièrement, dans sa capacité à mettre en évidence des perturbations au niveau métabolique grâce à (i) la spectrométrie de masse haute résolution (ToF) et très-haute résolution (FT-ICR) et (ii) l'analyse de données multivariées. Des potentiels biomarqueurs du dopage au tétrahydrocannabinol, salbutamol et budésonide ont ainsi pu être mis en évidence. La deuxième partie de ma thèse a pour objectif d'évaluer l'impact de la vinclozoline sur le système hormonal de rats et répond ainsi aux besoins de la nouvelle réglementation. Pour cette étude, je me suis donc intéressée aux échantillons de testicules de rats ayant subi un traitement à la vinclozoline. De par son caractère compréhensif, l'approche métabonomique m'a permis d'apporter des informations complémentaires aux études ciblées réalisées auparavant. Ces travaux me permettent alors de mettre en évidence les apports et les limites de la stratégie métabonomique par rapport : (1) au choix et à la préparation des échantillons d'origine biologique, (2) aux avantages et aux inconvénients des différentes techniques analytiques, (3) aux possibilités en termes de traitement des données, (4) aux exigences statistiques et (5) à la valeur biologique des résultats obtenus / My research work highlights the development of a metabonomic strategy through two topical issues: the doping in sport (Part A) and the Exposome (Part B). The first part includes two studies and aims to assess the contribution of metabonomics to the development of new screening tools. During these studies, I focused on the non-targeted analysis of clean and doped urine samples provided by the French Anti-Doping Agency and by volunteers. The originality of this approach lies in its non-targeted nature and, particularly, in its ability to highlight metabolic disruptions by (i) high-resolution (ToF) and very high-resolution (FT ICR) mass spectrometry and (ii) the analysis of multivariate data. The implemented strategy revealed several potential biomarkers for the use of tetrahydrocannabinol, budesonide and salbutamol. The second part of this thesis aims to evaluate the impact of vinclozolin on the hormonal system of rats and thus meets the requirements of the new regulations. For this study, I focused on testes extracts coming from rats treated with vinclozolin. Due to its comprehensive nature, the metabonomic study provided additional information to the previous targeted approach. All these results highlight the contributions and the limitations of metabonomics with regard to: (1) the choice and the preparation of biological samples, (2) the advantages and disadvantages of different analytical techniques, (3) the opportunities in terms of data processing, (4) the statistical requirements and (5) the biological value of the results

La spectrométrie de masse est une méthode d’analyse qui permet de travailler sur une large gamme d’échantillons. Elle est utilisée dans de nombreux domaines de recherche comme la chimie analytique, la protéomique, la lipidomique et la métabolomique…Dans un premier temps, mon travail s’est focalisé sur le développement d’une méthode indépendante d’analyse de données par spectrométrie de masse à transformée de Fourier bidimensionnelle. Pour augmenter la résolution en première dimension, une analyse FT-ICR 2D avec un échantillonnage non uniforme (NUS) a été développée. L’augmentation de la résolution dans la première dimension a permis l’obtention d’une haute résolution pour les ions précurseurs. La FT-ICR 2D a été utilisée avec succès pour l’analyse de triacylglycérols contenus dans du plasma mais aussi pour l’analyse d’échantillons archéologiques.Dans un second temps, une stratégie protéomique conjointe bottom-up et top-down a été appliquée à l’analyse d’échantillons archéologiques et paléontologiques à partir d’ossements ou de céramiques. Le développement d’une méthodologie bottom-up, a permis à partir d’ossements archéologiques d’espèces inconnues l’identification des protéines et leurs modifications chimiques. Cet ossement a pu être attribué comme appartenant à l’espèce Homo sapiens. Une analyse top-down a été utilisée pour l’analyse d’échantillons archéologiques. Pour la première fois, une protéine (la caséine de lait) a été identifiée dans un échantillon archéologique d’amphore de l’époque de l’empereur Claude (1er siècle de notre ère) grâce la détection de grands fragments de caséine. / Mass spectrometry is a method of analysis which works on a wide range of sample types. It is used in many research fields such as analytical chemistry, proteomics, lipidomics and metabolomics...Firstly, my work was dedicated to the development of an independent data analysis methodology based on two-dimensional Fourier transform mass spectrometry. For increasing the resolution on the first dimension a 2D FT-ICR analysis with non-uniform sampling was developed. The resolution increase in the first dimension leading to high resolution for the precursor ions. The 2D FT-ICR has been successfully applied for the analysis of triacylglycerol contained on plasma and also for archaeological samples. This methodology led to 2D maps allowing a rapid classification of plants or animals samples.Secondly, a joint bottom-up and top-down proteomics strategy was applied for the analysis of archaeological and paleontological samples from bones or ceramics. The development of a bottom-up methodology, allowed the identification of proteins and their chemical modifications from archeological bones. These bones have been attributed to Homo sapiens. The development of a top-down methodology was applied to the analysis of archaeological ceramic. For the first time, a protein (milk casein) was identified in an archaeological sample of an amphora from Claudius emperor era (1st century A.D) via the detection of large fragments of casein. This first application of the top down proteomics showed that new information can be provided such as the in situ molecular degradation.

La spectrométrie de masse tandem est une technique analytique versatile, notamment utilisée dans le champ de la protéomique pour dériver la séquence de peptides. Cette thèse vise à contribuer au développement de méthodes intégrées à la spectrométrie de masse afin d’apporter des informations structurales sur les ions moléculaires, intermédiaires réactionnels ou produits de réactions. La fragmentation des peptides protonés est induite par collisions avec une gaz rare (CID). Des multiples fragments sont observés et la séquence peptidique peut être dérivée de la mesure de la masse de séries d’ions analogues. Les mécanismes de fragmentation par CID des peptides protonés sont très complexes, constituant un champ de recherche important. Dans ce contexte, le couplage de deux techniques comme la spectrométrie de masse et la spectroscopie infrarouge a été utilisé pour caractériser des ions fragments (an et bn) de peptides. Divers signatures infrarouges identifiées dans les gammes spectrales 1000-2000 et 3000-3800 cm-1 et caractéristiques de différents motifs structuraux ont mis en évidence la permutation de la séquence de la chaîne peptidique pour les ions an. Dans le cas des ions bn, la formation d’une structure macrocyclique s’appuie sur la formation spécifique d’un complexe produit d’une réaction avec NH3, que nous avons caractérisé par spectroscopie infrarouge. L’objectif ultime de cette thèse était de mettre en place une approche multimodale sur un spectromètre de masse unique, intégrant la séparation par mobilité ionique et la spectroscopie infrarouge d’ions moléculaires en permettant la caractérisation structurale par spectroscopie infrarouge des ions simultanément sélectionnés en masse et par mobilité ionique. La technique de mobilité ionique mise en œuvre est de type « Differential Ion Mobility spectrometry » (DIMS). Nous aurions souhaité pouvoir exploiter l’IMS sur des ions fragments de peptides, mais la technique DIMS ne le permettait pas. Nous avons choisi d’explorer la séparation et la caractérisation des monosaccharides cationisés par Li+, Na+ et K+. Dans le cas des complexes de Li+, les résultats spectroscopiques et de mobilité ionique sont cohérents avec les structures les plus stables prédites par la théorie. Ces calculs de chimie quantique permettent aussi d’interpréter une signature spectrale spécifique de complexes de Li+ avec des anomères de glucose. / Tandem mass spectrometry is a versatile analytical technique, used in particular in the field of proteomics to derive peptide sequence. This thesis aims to contribute to the development of integrated approaches to mass spectrometry to provide structural information on molecular ions, which can either be reaction intermediates or reaction products. The fragmentation of protonated peptides is induced by multiple collisions with rare gas atoms (CID). Multiple fragments are observed and the peptide sequence is derived from the measurement of the mass difference between two consecutive analogous ions. Fragmentation mechanisms of the protonated peptides under CID conditions constitute an intense research field. In the frame of this PhD thesis, mass spectrometry and infrared spectroscopy were coupled to characterize the fragment ions (an and bn) peptides. Several infrared signatures were found in the 1000-2000 and 3000-3800 cm-1 spectral ranges characteristic of different structural motifs. In the case of the an ions, these IR signatures provide evidence of the permutation of the sequence of the peptide chain. In the case of the middle size bn ions, the formation of a macrocyclic structure relies on the specific formation of an ion-molecule complex with NH3, whose structure has been characterized by IR spectroscopy.The ultimate objective of this thesis was to develop a multimodal approach based on a single mass spectrometer, which incorporates ion mobility spectrometry and infrared spectroscopy in order to characterize the structure of mobility- and mass-selected molecular ions. The ion mobility technique used is the "Differential Ion Mobility spectrometry" (DIMS). Peptide fragment ions could not be studied using this new set-up. We chose to study the separation and characterization of cationized monosaccharides with Li+, Na+ or K+. In the case of lithiated complexes, the spectroscopic and ion mobility data are consistent with the low energy structures predicted by theory, allowing in particular the interpretation of an IR specific signature characteristic of some Li+ complexes of glucose anomers.

Nous nous sommes intéressés à la compréhension des mécanismes régissant la symbiose Rhizobium-Acacia dans les conditions de stress salin. Les lipopolysaccharides jouent un rôle important dans les étapes de cette symbiose. Le but était de mettre en évidence les modifications pariétales de la bactérie en réponse au stress salin par l’étude de la structure des lipopolysaccharides des souches isolées du désert marocain tolérant NaCl 7%. Ainsi, une nouvelle méthode d’hydrolyse des lipopolysaccharides sensible, non destructive et compatible avec la spectrométrie de masse a été développée. En présence de stress salin, nous avons montré que la membrane externe devenait plus hydrophobe en augmentant l’acylation de la région lipidique ainsi qu’en réduisant la présence des molécules de LPSs à longues chaînes de sucres.Des essais d’évaluation de l’efficience et de l’infectivité des Rhizobia étudiés ont été mis en œuvre pour déterminer l’impact de ces modifications des LPSs sur la symbiose sous stress salin. / We were interested in the understanding of the mechanisms governing Rhizobium-Acacia symbiosis in salt stress conditions. Lipopolysaccharides play an important role in the stages of this symbiosis. The aim of this work was to highlight the changes occurring in the bacterial membrane in response to salt stress by studying the structure of the lipopolysaccharides isolated from Moroccan desert strains tolerating 7% NaCl. Thus, a new method of hydrolysis of the lipopolysaccharide - sensitive, non-destructive and compatible with mass spectrometry- was developed. We studied the LPSs strains grown with or without salt stress and we showed that in salt stress conditions, the outer membrane becomes more hydrophobic by increasing acylation of the lipid region and reducing the number of long sugar chains in LPSs. Tests for evaluating the efficiency and infectivity of the studied rhizobia were carried out to determine the impact of these LPS modifications on symbiosis under salt stress.

De nouvelles méthodes de détection et de quantification du VX (O-éthyl S–(2(diisopropylamino)éthyl) (méthylphosphonothioate)) dans le plasma par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS) ont été développées. Après avoir été mise en œuvre en milieu HBSS (rendement > 99%), la méthode d'extraction liquide-liquide de notre composé d'intérêt nous permet d'obtenir en milieu plasmatique un rendement de soixante-cinq pour cent (65%). Cette méthode d'extraction permet d'évaluer la présence de VX dans de très faibles volumes d'échantillons de plasma (entre 20 et 1000 µL), donc dans des volumes compatibles avec des expérimentations sur de petits rongeurs. Cette extraction est suivie d'une analyse par LC-MS/MS en phase 100% organique. Des limites de détection de 0,15 et 0,5 pg/mL (pour 5 µL injecté) sont obtenues respectivement avec l'utilisation de la colonne Allure Biphényl (Restek) et Lux Cellulose-1 (Phenomenex). Afin d'étudier la toxicocinétique des énantiomères du VX dans le plasma, nos recherches se sont ensuite focalisées sur la séparation de ces derniers. Des résultats prometteurs ont été obtenus en utilisant une colonne Lux cellulose-2 (Phenomenex). / Innovative analytical methods have been developed to detect and quantify the organophosphorus nerve agent, VX (O-ethyl S–(2(diisopropylamino)ethyl) (methylphosphonothioate)), in plasma using liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS) technique. Liquid-liquid extraction of VX from HBSS environment was achieved with excellent yields (> 99%). Next, extraction from plasma was performed and generated a recovery rate of approximately sixty-five percent (65%). Our distinctive extraction methodology was implemented to evaluate the presence of VX in very small quantities of plasma (between 20 to 1000 µL) as in small rodents' experiments. It was followed by an LC-MS/MS analysis in a 100% organic phase. A Lux Cellulose-1 column (Phenomenex) and an Allure biphenyl column (Restek) were tested with detection limit at 0.15 pg/mL and 0.5 pg/mL in plasma (5 µL injected), respectively. Finally, our study was focused on the separation of VX enantiomers and hopeful results were provided using a Lux cellulose-2 column (Phenomenex).

Ce travail de thèse s’est focalisé sur le développement des approches génériques de spectrométrie de masse (MS) pour la quantification des anticorps monoclonaux (mAbs) et de leurs produits dérivés dans des études précliniques. Premièrement, le développement des protocoles de préparation d’échantillons basée sur la digestion directe à partir de sérum ou comportant une étape d’immuno-précipitation spécifique par anticorps a permis la quantification des mAbs couvrant une large gamme d'étalonnage de cinq ordres de grandeur. En outre, l'emploi de peptides provenant de la région constante du mAb a démontré la polyvalence de telles approches génériques de chromatographie liquide en tandem MS (LC-MS/MS). Deuxièmement, les instruments de MS à haute résolution (HRMS) ont étés évalués dans le cadre de cette thèse en tant qu'alternative aux spectromètres de masse de type triple quadripôle traditionnellement utilisés pour l’analyse bottom-up quantitative. L’avantage majeur de l’intégration des analyseurs de HRMS a été associé à la possibilité de l’analyse quantitative simultanée des mAbs et leurs produits associés directement au niveau de la protéine fournissant un niveau d'informations bien au-delà de celui obtenu avec des approches bottom-up. Par conséquent, l’apport essential de la HRMS pour les analyses qualitative et quantitative des protéines thérapeutiques de type mAbs et produits associés a été démontré dans cette thèse. / This PhD thesis focused on the development of generic mass spectrometry (MS)-based workflows for monoclonal antibody (mAb)-related therapeutic protein quantification in pre-clinical species. First, the development of bottom-up sample preparation protocols either based on direct serum digestion or immuno-capture allowed mAb-related therapeutic protein quantification over five orders of magnitude whereas the employment of peptides from the constant region of the mAb demonstrated the versatility of such generic liquid chromatography tandem MS (LC-MS/MS)-based approaches. Second, high-resolution MS (HRMS) instruments were evaluated as an alternative to triple quadrupole mass analyzers, traditionally utilized for bottom-up mAb quantification by LC-MS/MS. The major benefit of HRMS incorporation into the workflow was associated with the possibility to quantify simultaneously mAb-related therapeutic proteins directly at an intact level, providing an information level far beyond the one obtained with bottom-up LC-MS/MS methodologies. Hence, the pivotal role of HRMS for the qualitative and quantitative analyses of mAb-related therapeutic proteins was further outlined throughout this doctoral work.