Les protéines sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. Il est nécessaire pour comprendre en détail leur fonction et leur mode d'action afin d'obtenir des informations sur leur structure et sur leurs interactions éventuelles avec leurs partenaires. Le travail réalisé durant cette thèse a consisté à développer deux méthodes innovantes utilisant la spectrométrie de masse pour étudier la structure des protéines et à appliquer ces méthodes à une problématique biologique. Nous avons optimisé une méthode associant les échanges H/D et la spectrométrie de masse sur une protéine modèle, la protéine PBP-2X. L'utilisation combinée de trois protéases nous a permis d'obtenir un meilleur recouvrement de séquence de la protéine étudiée et une plus grande résolution spatiale dans la localisation des zones d'intérêt. Une méthode associant la réticulation chimique et la spectrométrie de masse a été mise au point sur une protéine modèle : le cytochrome c. Les contraintes de distances ainsi obtenues vont intervenir dans une démarche bioinformatique visant à déterminer la famille de repliement d'une protéine de structure inconnue. Enfin, ces deux méthodes ont été appliquées avec succès sur des protéines du système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa : PcrV et PcrG. Nos résultats expérimentaux sur PcrV corrèlent à la structure modélisée de PcrV et la protéine PcrG est globalement peu structurée. L'interaction PcrV-PcrG a été caractérisée, elle met en jeu les domaines « coiled-coil » de chacune des deux protéines. La formation du complexe induit un changement de la conformation de PcrV qui pourrait avoir pour conséquence la stabilisation de PcrG.

PARMI LES DIFFERENTES SOURCES NATURELLES DE COMPOSES BIOLOGIQUEMENT ACTIFS, LES VENINS REPRESENTENT, DE PAR LA GRANDE VARIETE DE LEURS CONSTITUANTS, UNE CIBLE DE CHOIX POUR LA RECHERCHE MEDICALE. LES TOXINES QU'ILS CONTIENNENT SONT VARIEES ET COMPRENDRE LEUR MODE D'ACTION DANS LE BUT DE SYNTHETISER DES ANALOGUES D'INTERET PHARMACOLOGIQUE PASSE PAR UNE DETERMINATION PRECISE DE LEUR STRUCTURE CHIMIQUE AVEC LA CONTRAINTE QUE LA FAIBLE QUANTITE DE MATERIEL GENERALEMENT DISPONIBLE REND L'ENSEMBLE DES PROCESSUS DE SEPARATION ET DE CARACTERISATION TRES DELICAT. C'EST DANS CE CONTEXTE QUE SE SITUE CETTE THESE DONT L'OBJECTIF A ETE DE METTRE AU POINT DE NOUVELLES STRATEGIES D'ANALYSE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE A HAUTE RESOLUTION DE NOUVELLES TOXINES PEPTIDIQUES. CETTE THESE A PARTICULIEREMENT CIBLE L'ETUDE DE TOXINES PEPTIDIQUES DE CONES (MOLLUSQUES UTILISANT UN HARPON VENIMEUX POUR ATTEINDRE ET PARALYSE! R LEUR PROIE) ET DE SERPENTS. AU FINAL, LA SPECTROMETRIE DE MASSE A HAUTE RESOLUTION S'EST REVELEE COMME UN OUTIL TRES PUISSANT POUR LA CARACTERISATION DE PETITES TOXINES MODIFIEES PAR SES GRANDES CAPACITES EN TERMES DE PRECISION SUR LA MESURE DE MASSE MAIS AUSSI DANS L'ETUDE DE PLUS GROSSES TOXINES POUR LESQUELLES LA RECENTE TECHNIQUE DE DISSOCIATION PAR CAPTURE D'ELECTRON S'EST MONTREE DES PLUS PERFORMANTES.

Until first half of the XX century, sickle cell disease was practically limited to the malaria endemic areas and countries having known an important surge of African slaves. Today, migratory flows and progress of medicine have modified considerably the distribution of sickle cell disease which is from now on a frequent affection in Western Europe. The preventive implementation of medical care makes it possible to reduce morbidity and mortality associated with this pathology. Stake of a medical policy and economic interests, neonatal screening for hemoglobin disorders justifies then fully the implementation of powerful and adapted means. In order to initiate a newborn screening programme in our centre, we developed various immunological tests allowing to identify the sickle hemoglobin. We first of all developed an indirect immunoassay and led a population study on 46082 Belgian newborns and 1825 neonates from Central Africa. The performances of this assay were improved thereafter by conceiving a competitive test. Next, for reasons independent of our will, we had unfortunately to abandon the immunological approach. This methodology was thus supplanted in our center by an innovative method for this indication: the mass spectrometry. Our promising results currently authorize us to perennialize our policy in the neonatal screening for sickle cell disease and open the way for new developments in other fields. / Jusquà la première moitié du XXe siècle, la drépanocytose se limitait pratiquement aux zones dendémie palustre et aux pays ayant connu un important afflux desclaves dorigine africaine. Aujourdhui, les flux migratoires et les progrès de la médecine ont considérablement modifié la distribution de cette maladie qui est désormais une affection fréquente en Europe occidentale. La prise en charge précoce permet de réduire la morbidité et la mortalité associées à cette maladie. Enjeu dune politique sanitaire et dintérêts économiques, le dépistage néonatal de la drépanocytose justifie donc ainsi pleinement la mise en uvre de moyens performants et adaptés. Afin dinitier un programme de dépistage au sein de notre centre, nous avons initialement développé divers tests immunologiques permettant didentifier lhémoglobine anormale. Nous avons tout dabord mis au point un immunoessai indirect et conduit une étude de population sur 46082 nouveau-nés belges et 1825 bébés originaires dAfrique centrale. Les performances de lessai ont par la suite été améliorées en concevant un test compétitif. Lapprovisionnement laborieux danticorps nécessaires aux tests de détection a par la suite entravé notre programme. En effet, la commercialisation en a été interrompue et la production danticorps monoclonaux par nos moyens propres na pas été couronnée du succès escompté. Lapproche immunologique du dépistage néonatal de la drépanocytose a ainsi été supplantée dans notre centre par une méthode novatrice pour cette indication : la spectrométrie de masse. Nos résultats prometteurs nous autorisent actuellement à pérenniser notre nouvelle façon de faire dans le dépistage néonatal de la drépanocytose et ouvre la voie pour de nouveaux développements dans dautres domaines.

Les pesticides appartiennent à la grande famille des polluants organiques. Ils sont destinés à lutter contre les parasites des cultures au sens large.La diffusion des pesticides dans la nature engendre une pollution des différents compartiments de la biosphère (eau, sol et atmosphère) et peut induire des effets toxiques aigus sur les êtres vivants de la biomasse terrestre et aquatique. Il est aujourd'hui démontré que certains pesticides sont des perturbateurs endocriniens et présentent en particulier des effets cancérogènes et mutagènes chez l'être humain. Les pesticides peuvent subir différents processus de transformation dans le cycle biologique naturel (biodégradation, volatilisation, irradiation solaire...) ou suite aux traitements appliqués dans les filières de potabilisation des eaux naturelles et dans les stations de retraitement des eaux usées. La présence de produits de dégradation de pesticides dans notre environnement est d'autant plus alarmante que leurs structures et leurs toxicités potentielles demeurent généralement inconnues. Des molécules qui appartiennent à deux familles de pesticides ont été choisies pour cette étude : les herbicides, représentés par le metholachlore, et les fongicides, représentés par la procymidone, le pyrimethanil et le boscalid. Le premier volet de la thèse a porté sur le développement d'une stratégie analytique permettant de caractériser les structures de composés issus de la dégradation par photolyse de ces pesticides. Le deuxième volet a porté sur l'estimation de la toxicité des produits de dégradation à l'aide d'une base de test in silico. L'identification des produits de dégradation a été réalisée grâce à deux techniques d'analyses complémentaires : la chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse "multi étapes" (GC-MSn) et la chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS). L'estimation de la toxicité des produits de dégradation a été réalisée grâce au programme T.E.S.T. QSAR récemment développés pour tenter de prévoir la toxicité des molécules. La stratégie d'élucidation structurale des produits de dégradation des pesticides étudiés est basée sur l'étude des mécanismes de fragmentation des molécules mères des produits de dégradation. La masse molaire des molécules mères a été précisée par l'identification des masses sur charge (m/z) des ions pseudo moléculaires obtenus à l'aide des différentes modes d'ionisations en spectrométrie de masse : ionisation électronique (EI) et ionisation chimique (CI) en GC-MS et ionisation par électronébulisation (ESI) en LC-MS. La stratégie utilisée pour l'élucidation structurale des produits de dégradation est avérée très efficace, la plupart des structures chimiques des produits formés ayant été élucidées. Une étude cinétique a été réalisée pour visualiser l'apparition et la disparition des produits de dégradation durant la photolyse et pour donner une idée sur le taux de disparition de la molécule mère pour chaque pesticide. Les résultats de photolyse ont montré que le méthalochlore, le procymidone et le boscalid ont été dégradés sous irradiation après un certain temps en libérant des produits de dégradation avec des structures proches ou différentes des molécules mères. Tandis que le pyrimethanil a présenté une grande stabilité pendant 8 heurs d'irradiation (quantité restante après irradiation est de 60%) et a donné des produits de dégradation avec des quantités modérées. Concernant l'estimation de la toxicité, la plupart des produits de dégradation identifiés présentent des toxicités équivalentes ou plus importantes que celles des molécules d'origine. Les méthodes chimiques d'analyses utilisées et l'estimation de toxicités des produits de dégradations identifiés sont avérées complémentaires et indispensables pour mettre en évidence la présence d'autres produits polluants toxiques qui émergent dans l'environnement sans vrai contrôle.

Le transporteur d'ADP/ATP est une protéine de la membrane interne mitochondriale qui joue un rôle physiologique majeur en catalysant l'échange d'un ADP cytoplasmique contre un ATP néo-synthétisé dans la matrice mitochondriale. Cette protéine peut être inhibée de manière très spécifique par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrekique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés au cours du mécanisme de transport. Afin de mieux appréhender cette dynamique fonctionnelle, une étude du transporteur d'ADP/ATP bovin en complexe avec le CATR ou le BA dans le détergent Triton X-100 a été réalisée par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse. Ces travaux se sont déroulés en 4 parties. La première a consisté à adapter cette technique à l'étude des protéines membranaires intégrales. En effet, la présence de détergents, nécessaires au maintien en solution de l'état natif de ces protéines, n'a pas permis jusqu'ici de les étudier par cette approche. Pour pallier cette difficulté, un protocole automatisé de chromatographie liquide permettant l'élimination du Triton X-100 a été mis au point. Les cinétiques de deutération des différents complexes ont alors pu être analysées dans le deuxième volet de cette étude. Les données obtenues ont permis de proposer des modèles conformationnels du transport de nucléotides à travers la membrane interne mitochondriale, dans lesquels le transporteur présenterait une cavité ouverte tour à tour vers l'espace intermembranaire et vers la matrice. Afin d'apporter d'autres éléments de réponse sur ce mécanisme de transport et de s'affranchir de différents problèmes liés à l'utilisation des détergents, des essais de deutération du transporteur d'ADP/ATP bovin dans les mitochondries ont été entrepris et représentent le troisième volet de ces travaux. Cette approche, qui nécessite encore plusieurs améliorations, a permis d'obtenir les premières données de deutération d'une protéine membranaire dans son environnement natif. Le transporteur d'ADP/ATP est aussi impliqué dans des pathologies humaines plus ou moins graves. Dans une dernière partie, l'étude de ces mutations a été abordée en réalisant chez la levure Saccharomyces cerevisiae une étude phénotypique et biochimique de plusieurs mutants du transporteur de l'amibe Dictyostelium discoideum correspondant aux mutations humaines. Cette étude a mis en évidence un problème dans le mécanisme intrinsèque de transport, induit par la mutation V291M, qui pourrait être à l'origine de la pathologie associée.

Aujourd'hui la recherche en biologie dispose d'une masse d'informations génomiques considérable qu'il faut comprendre fonctionnellement pour faire émerger de nouveaux concepts, qui formeront le berceau de nouvelles thérapies. Ces études mettent en jeu des mécanismes contrôlés à l'échelle moléculaire et nécessitent le traitement d'informations à haut-débit et de manière parallèle. Les travaux pluridisciplinaires présentés ont permis de mettre au point une technologie miniaturisée de culture de cellules en gouttes matricées sur supports solides, pour tester l'action des molécules sur le comportement de cellules.<br />Après avoir mis au point un démonstrateur macroscopique validé par des transfections de molécules nucléiques, nous avons développé un protocole de fabrication de substrats miniaturisés capable de maintenir 100 nano-gouttes par cm² à l'aide d'un différentiel de tension de surface. Un robot de dispense de pico-gouttes a été intégré pour réaliser les gouttes de culture cellulaire de manière automatique. Le comportement des cellules au sein des gouttes est évalué par microscopie en fluorescence à haut-contenu après fixation. Chaque cellule de chaque goutte est caractérisée par des dizaines de paramètres de manière individuelle.<br />Cette nouvelle approche analytique a été appliquée dans le cadre d'un projet multipartenaire de criblage de siRNA visant à étudier l'impact de gènes sur la chimiorésistance de glioblastomes. Par ailleurs nous avons montré l'utilisation de la spectrométrie de masse comme méthode de phénotypage multiparamétrique. Cette technologie de puce à cellules est particulièrement adaptée à l'étude à haut-débit des comportements fins de cultures cellulaires.

The quality of food is an increasingly important matter of concern in Europe. The feeding stuffs poisoning episode that occurred in Belgium in May 1999 pointed out the vulnerability of the food chain and the lack of appropriate monitoring. Polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans (PCDD/Fs) and polychlorobiphenyls (PCBs) were the key contaminants involved. This has triggered new EU legislation, including maximum and action limits for relevant food and feed products as well as requirements for analytical method used to verify compliance. Large monitoring programs to test food and feed have been launched and, in many countries, efforts to monitor dioxins and related compounds strongly increased. To cope with the large number of samples statistically required for monitoring, the recommanded strategy involves the use of screening methods based on low resolution mass spectrometry (LRMS) and/or bio-assays, and high resolution mass spectrometry (HRMS) method, used to bear out their presence. Major analytical challenges had to be met to face with the large number of samples including the authoritys requests on developing screening and alternative methods for monitoring programs of PCDD/Fs and PCBs in food and feed. The first part of this document is devoted to the development of an alternative LRMS-based method for PCDD/Fs and PCBs measurement in food and feed. The second part of this thesis is an answer to the basic questions commonly addressed to all analytical chemists developing method but here in a particular context due to very specific family of compounds involved: How to make sure that my method is able to achieve sufficient accuracy on results? Are there any analytical benchmarks available for validation purposes? How to evaluate measurement uncertainty expressed in toxic equivalent (TEQ) units? How to report results right? How can the proficiency of my laboratory be measured? To ensure the quality of data obtained, laboratories in charge of the food control on PCDD/Fs and dioxin-like PCBs encounter a number of severe problems. One has to mention the lack of sufficient and reliable certified reference materials that are necessary to validate methods, too scarce data available on current analytical method performances, and the absence of quality criteria approach for analytical method. During the course of this work, I contributed to answer these questions to the general analytical effort by providing useful tools and methodologies. At that time, straightforward answers could not be found in the scientific literature. One of the reasons was the scarce data of dioxins in food and feed available. One can also mention the unusual part the dioxins play in chemical analysis. Indeed, the main features that characterize a dioxin measurement are the low levels at which these compounds occur in biological samples (sub parts-per-trillion), levels that are currently not explored by any other applications in chemical analysis in the food sector and therefore the difficulty to cope with precision models available; the reporting of results expressed in total tetrachloro dibenzo-p-dioxin (TCDD) toxic equivalent concentration for compliance assessment with statutory limits; and, what necessarily follows from the decision-making: the statement of the uncertainty interval also expressed in toxic units. To answer the foregoing questions in an international frame, notions such as validation of analytical procedures, fitness for purpose, internal quality control, interlaboratory studies, proficiency testing, measurement uncertainty, traceability had to be introduced. They are all encompassed in the analytical quality assurance management a laboratory should implement. These concepts are strongly connected to statistical techniques. This branch of analytical chemistry that consists in extracting relevant information from data using statistical and mathematical methods adapted to the specific needs for the chemists is called chemometrics. Quality is an essential preoccupation of chemometrics but it cannot be only limited to these aspects. Chemometrics relates also to other topics such as experiments and experimental design methodologies, (new) knowledge about chemical systems. Chemometrics and quality This thesis treats several aspects and new approaches of quality assurance for an ultra-trace contaminant laboratory: external method validation through interlaboratory studies and estimation of repeatability, reproducibility and trueness using simple statistics based on normal distributions (ISO 5725) but also more complex statistical tests for heavily tailed, skewed or even bimodal distributions; the production and the use of a reference material for internal validation and internal quality control (QC) purposes; advanced statistics in quality control chart and multi-level control charts for sensitive detection of bias; proposal of quality criteria for assessment of proficiency of dioxin laboratories; proposal of benchmark precision for internal validation purposes; estimation of measurement uncertainty. The thesis is divided in the following chapters: Chapter 1 is a general introduction for dioxins and related compounds. It consists of a brief introduction to general characterization, mechanism of toxicity, human exposure and European legislation in food and feed. Chapter 2 provides an overview of the analytical procedures for mass spectrometry based methods. It gives a brief summary of the most frequently used techniques to extract and purify PCDDs, PCDFs and dioxin-like PCBs (DL-PCBs) from food and feed matrices. Regarding detection, special attention of the principles of detection and quantification by HRMS in selected ion monitoring mode (SIM) and the quadrupole ion storage low resolution mass spectrometer in MS/MS mode is addressed. Chapter 3 discusses the development and optimization of a large volume injection (LVI)-gas chromatography (GC)-ion trap MS/MS method as an alternative to GC-HRMS for the measurement of PCDD/Fs in food and feed. Instrumental detection limits were lowered by a factor 2 to 3 with the development, in collaboration with the manufacturer, of a system of damping gas pressure inside the trap that improves precursor ions trapping efficiency. We achieved 5:1 signal to noise with the injection of 200 fg of 2,3,7,8 TCDD. With slight adjustments to sample size and final extract volume, we demonstrated on QC samples the good agreement between this method and the reference GC/HRMS method for PCDD/Fs and DL-PCBs in food and feed. In chapter 4, the first European inter-laboratory study on dioxins, furans and dioxin-like PCBs using the HRGC/HRMS method in animal feed samples is described with two main objectives. The first objective was to produce a reference material for internal validation and QC purposes. The second objective was to assess the analytical performances of the GC-HRMS method close to maximum levels as no data were available at that time and to check whether EU directives requirements were met. Chapter 5 is a general discussion on the capability of the state-of-the-art HRGC/HRMS method to provide reliable results at decreasing maximum levels. Levels have to decrease according to EU policy regarding human exposure to those contaminants. In this case, we present the issue from a different angle, i.e. the analytical point of view for the future establishment of target levels. Based on the results of PCDD/Fs and DL-PCBs interlaboratory study in animal feedingstuffs described in chapter 4, we demonstrated for the sum of the 17 PCCD/Fs toxic congeners that reliable results can be easily provided up to a value of 0.17 ng WHO-TEQ/kg. The ability to reliably quantify a minute trace of these contaminants has been pointed out with the aim of providing an analytical benchmark for the future establishment of target dioxin levels in animal feedingstuffs. Hence, both analytical and toxicological aspects should be examined together to set realistic target levels achievable for most dioxin laboratories involved in monitoring programs. One of the central themes of this thesis is the establishment of an empirical relationship between reproducibility standard deviation and the dioxin congeners level in food and feed. Chapter 6 deals with raw data from numerous performances interlaboratory studies of PCDD/Fs and DL-PCBs in food and feed. Striking linear functions in log scale between reproducibility standard deviation and congeners level over a concentration range of 10-8 to 10-14 g per g fresh weight were observed. The data fit very well to a Horwitz-type function of the form sR = 0.153c0.904, where sR and c are dimensionless mass ratios expressed in pg/g on fresh weight, regardless of the nature of the toxic congeners, food and feed matrices, or sample preparation methods. I called this relationship the dioxin function. One of the main features of the dioxin function could be its use as a suitable fitness-for-purpose criterion for dioxins and related compounds in proficiency testing (PT) exercises. We illustrated its use with practical example with data from the largest international PT in this field. Another application is its use as benchmark precision criteria for internal validation. Chapter 7 discusses the role of internal quality control (IQC) to monitor analytical processes. Introducing new QC methods derived from the industrial practice to analytical chemistry, improving data evaluation and allowing to detect shifts or trends, are elements that are difficult to point out with classical approach (Shewhart chart). The importance of ARL (average run length) as a key-criteria of the efficiency of a quality control procedure will be emphasized. The introduction of the multivariate approach of multilevel control with the Hotelling's T2-test will lead to a better detection of random errors than the independently managed conventional Shewhart charts. Moreover, the Exponentially Weighted Moving Average (EWMA) will offer a flexible tool for detecting the inacurracy of a method, especially where small shifts or bias are of interest. All these concepts, recently introduced in clinical chemistry, were applied here for the monitoring of PCDD/Fs and DL-PCBs in food and feed. Chapter 8 introduces the concept of measurement uncertainty (MU). Three top-down approaches for uncertainty estimation are proposed on the example of the GC-HRMS method for PCDD/Fs and DL-PCBs in various food and feed matrices: the approach which combines long-term precision and trueness data to obtain an estimate of MU (Barwick and Ellision method); the approach which uses the reproducibility estimate from interlaboratory-studies as uncertainty estimate; the concept of accuracy profile used in the context of validation and internal quality control to assess MU. Chapter 9 presents a general conclusion

La couronne de Mars est la partie extrêmement tenue son atmosphère située au-delà de 200km d'altitude. A l'interface entre le vent solaire et la haute atmosphère, cette région conditionne la perte de matière à l'échelle globale et sur des périodes géologiques. Ce travail de thèse concerne la modélisation de la formation de la couronne de particules neutres suprathermiques, d'une part, et d'autre part, l'étude expérimentale et la modélisation d'un dispositif de caractérisation de ses composés. Les particules de la couronne sont crées par recombinaison dissociative des ions O2+ et CO+, et par criblage de la haute atmosphère par des ions pick-up O+. Leur création ainsi que leur transport ballistique sont simulés dans une atmosphère à symétrie sphérique, suivant une approche particulaire du type Monte-Carlo. Les collisions et le partitionnement de l'énergie lors des dissociations sont traitées grâce à un modèle de dynamique moléculaire. Les sorties de ce modèle permettent de décrire la couronne en incluant ses composés lourds tels que le CO2 et le CO. Elles permettent également de définir les spécifications d'un spectromètre de masse dédié à la mesure de ces populations de particules. Cette mesure nécessite l'emploi de sources d'ionisation à très grande luminosité. Une caractérisation physique des sources d'électrons envisagées (basées sur l'effet de champ), qui sont des cathodes à micropointes et à nanotubes de carbone, est effectuée à partir d'un analyseur d'énergie hémisphérique à potentiel retardateur. Les paramètres obtenus sont ensuite utilisés pour déterminer la sensibilité de la source nécessaire à la mesure. Le simulation numérique du spectromètre est également abordée.

La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF vient d'être largement adoptée dans les laboratoires de microbiologie clinique, qu'ils soient de ville ou hospitalier. Le MALDI-TOF est maintenant utilisée en routine pour l'identification des micro-organismes. Les micro-organismes sont identifiés en quelques minutes à un coût minime et avec une meilleure précision qu'en utilisant les méthodes conventionnelles. Le MALDI-TOF permet une identification microbienne révolutionnaire mais il ne permet pas aisément la détection de résistances aux antimicrobiens ou de facteurs de virulence. Le travail de thèse a eu pour objectif d'adresser cette problématique : est-il possible d'identifier, de typer un micro-organisme et de détecter sa résistance ou sa virulence par spectrométrie de masse ? Pour cela, l'utilisation d'une chromatographie liquide conventionnelle couplée à un spectromètre de type triple-quadripôle travaillant en mode SRM a été proposée. Nous avons démontré que la caractérisation complète des micro-organismes était possible à l'aide d'une seule méthode. La preuve de concept a été apportée pour des bactéries à Gram positive, à Gram négative et pour des levures. L'approche a été démontrée pour la détection des mécanismes majeurs de résistance aux bêta-lactamines, aux glycopeptides et aux azolés. La détection de toxines a également été démontrée. Fort de ces démonstrations, une évaluation clinique a été réalisée avec des souches et des hémocultures cliniques. La caractérisation de staphylocoques dorés, une des espèces capitales dans les maladies infectieuses du fait de sa prévalence, de sa sévérité et de sa résistance aux antibiotiques, a été engagée pour illustrer l'intégration de l'approche ESI-MS. La méthode SRM développée a permis en moins de deux heures d'obtenir des résultats en parfait accord avec les méthodes conventionnelles. Ce concept ouvre de nouveaux horizons pour la spectrométrie de masse en microbiologie clinique / Whole cell mass spectrometry based on MALDI-TOF technology has been broadly embraced in clinical microbiology. MALDI-TOF is routinely used for microbial identification. WC-MS is faster, more accurate and cheaper for large laboratories than conventional biochemical tests. MALDI-TOF revolutionizes microbial identification but the selection of the right antibiotic treatment still requires time consuming antibiotic susceptibility testing. Thesis work is dedicated to answer to this problematic : it is possible to perform identification of a micro-organism to the species or sub-species level and to detect its resistance or its virulence by mass spectrometry ? To this purpose, a conventional bore chromatography coupled to a triple-quadripole mass spectrometer in SRM mode is proposed. We show that complete microorganism characterization was possible thanks to only one method. A proof of concept was given for Gram negative, for Gram positive and for yeasts. The approach was extended to major resistance mechanisms to beta-lactamin, to glycopeptides and to azoles. Toxins detection was also proved. Driven by this success, a clinical evaluation was carried out based on strains and blood culture. Staphylococcus aureus was chosen to illustrate ESI-MS approach integration. This common Gram positive commensal bacteria is responsible for both community- and hospital-acquired infections. The developed SRM method allows obtaining results in less than two hours in perfect agreement with conventional methods. This concept opens new horizons for mass spectrometry in clinical microbiology

Cette thèse vise à démontrer la pertinence de la chromatographie en phase supercritique (SFC) et de son couplage à la spectrométrie de masse tandem haute résolution (HRMS/MS) quant à l’étude de produits naturels en mélange complexe. Pour y parvenir trois projets ont été menés en parallèle.Une méthode d’analyse structurale ciblée sur les acétogénines d’Annonaceae a été développée. Le recours à une cationisation post-colonne par des sels de lithium a permis d’obtenir les informations structurales recherchées. Des études ont également été menées quant à l’influence de la nature du cation sur la conformation de l’adduit formé et les voies de fragmentation observées.Une séparation de composés polaires et ionisables a également été mise au point à travers l’étude des nucléosides modifiés de l’ARN. La SFC-HRMS permet la séparation et l’étude d’un grand nombre de modifications et constitue donc un nouvel outil d’analyse pour le biologiste.Pour finir, une étude en lipidomique globale a également été entreprise. Bien que préliminaires, les premiers résultats semblent très prometteurs avec pour but de développer des méthodes d’analyses non ciblées associés à des outils d’annotation automatique.Pour chaque projet, la pertinence de nos approches a été vérifiée par l’étude d’échantillons réels et complexes permettant de tirer des conclusions réalistes quant aux possibilités de la SFC-HRMS/MS pour l’étude de composés naturels. / This PhD work aims to demonstrate the relevance of supercritical fluid chromatography (SFC) and its hyphenation to high resolution tandem mass spectrometry (HRMS/MS) in the field of natural product analysis. Three different research projects were carried out.A new strategy for structural analysis of Annonaceous acetogenins was developed by SFC and targeted HRMS/MS including post-column lithium cationisation to give access to the relevant structural information. Investigations were conducted to observe the influence of cations onto the gas-phase conformation and fragmentation pathways.A separation of polar and ionisable compounds was also developed using modified nucleosides from RNA as models. The SFC-HRMS method led to the separation and analysis of several tens of modifications and demonstrated to be a new performant analytical tool for biologists.Finally, a global lipidomic approach was optimized. Preliminary results look compatible with the development of untargeted approaches using automatic annotation tools.For each project, the relevance of our work was evaluated analyzing complex samples to obtain a realistic point of view of the capabilities for SFC-HRMS/MS systems for natural product studies.