A pós-genômica surgiu como um próspero campo para que as infinidades de seqüências provenientes dos projetos genoma tenham os seus significados biológicos elucidados. Um dos mecanismos descritos na literatura capaz de gerar surpreendente diversidade protéica é o splicing alternativo (AS). Próximo de 22% das proteínas com estruturas tridimensionais resolvidas por difração de raios-X ou ressonância magnética nuclear (RMN) são humanas e pouco se sabe dos efeitos de eventos de splicing alternativo em suas funções. Uma vez que estas estruturas tridimensionais (3D) protéicas humanas são de alguma forma redundantes, o conjunto de genes humanos únicos que as correspondem é muito reduzido, em torno de 1%. Hoje em dia ainda são escassos os exemplos de duas isoformas de splicing alternativo de um mesmo gene com estruturas tridimensionais experimentais disponíveis. A variedade de proteínas que este evento pode potencialmente produzir é demasiado grande para que projetos de genômica estrutural em andamento consigam determinar suas estruturas. Isto tem inviabilizado, ainda que temporariamente, estudos sobre implicações funcionais de splicing alternativo no proteoma quando se utilizando dados estruturais experimentais. Entretanto, a bioinformática possibilita estudos deste porte com base nos dados de mapeamento no genoma, tanto de transcritos como de proteínas com estrutura tridimensional (3D) determinada. Torna-se possível, então, a prospecção de genes com isoformas de AS com estruturas 3D contendo informação adicional quando comparada à isoforma de AS. Produzimos para tal finalidade uma nova metodologia para detecção de eventos de AS no transcriptoma humano utilizando matrizes binárias para cada transcrito e estrutura de proteína 3D. Selecionadas as isoformas protéicas putativas, foram construídas 73 estruturas 3D utilizando conceitos de modelagem molecular por homologia. Foram escolhidas aleatoriamente 21 isoformas de AS para simulações por dinâmicas moleculares (SDM), e que cerca de 80% destes modelos se apresentaram estruturalmente estáveis. A anotação biológica relativa a cada fragmento não inserido na seqüência da proteína devido à sua remoção no mRNA resultante do evento de AS foi obtida e mostrou que mais de 80% delas possuem algum tipo de relevância funcional para a proteína. Concluímos que, para o nosso conjunto de dados, os eventos de splicing alternativo produzem isoformas que podem atuar como dominantes negativas, antagonistas ou atenuadoras da sua atividade biológica. / The post-genomic era has emerged as one prosper field to deal with the huge amount of sequences produced by genome projects and increase the understanding of its biological meaning. One of the most surprising mechanisms capable to generate a lot of protein diversity is alternative splicing in immature mRNAs. No more than 22% of the known protein structures elucidated by X-ray diffraction or nuclear magnetic resonance (NMR) were made using human proteins and the knowledge about alternative splicing functional implications is weak. Since those human protein three-dimensional structures (3D) are redundant, the unique number of human genes represented by them is estimated around 1%. Nowadays there are only a few cases describing two isoforms that have their own protein 3D structures done experimentally. The variety that alternative splicing can produce is large enough to structural genome projects undergoing could determinate its structures, fact that have negating, at least for a while, large-scale studies about functional implications of alternative splicing using experimental data. However, bioinformatics turn possible this kind of projects using the mapping onto the genome of transcripts and the sequence of the known protein 3D structures. Using this approach we searched for alternative splicing isoforms which have at least one known protein structure with additional biological information when compared against the isoform. We have produced a new methodology for detecting alternative splicing in the human transcriptoma using binary matrices for each transcript and known 3D protein structure. After the selection of putative isoforms, there were constructed 73 3D protein using concepts of molecular modelling by homology. There were randomly selected 21 of them to the submitted to molecular dynamics simulations and 80% of them showed that they were structurally stable. The biological annotation of each non-inserted fragment due to alternative splicing shows that 80% of them have in some degree functional importance. Then, we conclude that, for our dataset, the alternative splicing events produce isoforms that can act as negative dominants, antagonists or even regulators of their biological activity.

O gene, uma seqüência de nucleotídeos necessária para a síntese de moléculas funcionais, é transcrito e regulado por um conjunto de processos e fatores extremamente complexos. Entender o momento e o tecido em que os genes são expressos, as isoformas funcionais, as regiões controladoras e os fatores envolvidos na regulação da expressão de cada gene é um dos grandes desafios da biologia molecular moderna. Hoje, com a enorme quantidade de informações de seqüências genômicas e de transcriptomas, aliado ao desenvolvimento de métodos computacionais para agrupar e analisar estes dados em larga escala, o estudo dos fenômenos relacionados à transcrição e regulação gênica está passando por uma revolução. Por exemplo, é possível medir, concomitantemente, a expressão gênica de milhares de genes em diferentes tecidos, assim como identificar diversos fenômenos que atuam nestes genes. Neste trabalho nós desenvolvemos e aplicamos métodos computacionais no estudo de quatro temas envolvendo aspectos chave da transcrição e regulação gênica. No primeiro trabalho, nós abordamos a expressão gênica tecido-específica através do estudo dos genes expressos no cérebro e em dez regiões cerebrais de camundongo. No segundo trabalho, nós identificamos seqüências potencialmente envolvidas no controle da transcrição gênica através do estudo de motivos sobre representados na região promotora dos genes de receptores olfativos. No terceiro trabalho, analisamos o transcriptoma humano quanto a presença de eventos de retenção de intron, um tipo de splicing alternativo. No quarto trabalho, nós abordamos a complexidade do transcriptoma e a regulação da expressão gênica através do estudo de pares de genes senso-antisenso em humanos e camundongos. Em todos os trabalhos, obtivemos resultados que nos permitiram tirar conclusões específicas sobre cada fenômeno estudado e nos mostraram a importância de estudá-los através de uma abordagem em larga escala. Adicionalmente, verificamos que os nossos métodos computacionais foram eficientes e adequados para o estudo da transcrição e regulação gênica em Homo sapiens e Mus musculus. / Genes, nucleotide sequences necessary for the synthesis of functional molecules, are transcribed and regulated by extremely complex cellular and molecular processes. To understand when and in which tissues the genes are expressed, their functional isoforms, control regions and the factors involved in gene regulation is one of major challenges of modern molecular biology. Today, the availability of complete genome sequences and transcriptomes, together with the development of new computational methods allows the study of phenomena related to the transcription and gene regulation in a large scale. For example, it is possible to quantify, concomitantly, gene expression of thousands of genes in different tissues and analyze different aspects of their regulation. In this work we developed and applied computational methods to the study of four key aspects of gene transcription and regulation. In the first study, we addressed tissue specific gene expression through the study of genes that are preferentially expressed in the brain and ten different mouse brain regions. In the second study, we identified sequences that are potentially involved in the control of gene transcription through the study of motifs that are over represented in the promoter region of olfactory receptor genes. In the third study, we browsed the human for the presence of intron retention, a type of alternative splicing. In the fourth study, we addressed the transcriptoma complexity and gene expression regulation through the study of pair of sense-antisense genes in human and mouse. In all studies, our results allowed us to make specific conclusions about each phenomenon analyzed which showed us the importance of a large scale approach. In addition, we verified that our computational methods can be efficiently applied to the study of transcription and gene regulation in Homo sapiens and Mus musculus.

Neste trabalho, nós mostramos estudos em larga-escala de RNAs não codificadores antisenso que são transcritos em regiões intrônicas de genes humanos. Alguns destes transcritos intrônicos possuem níveis de expressão correlacionados ao grau de diferenciação tumoral de câncer de próstata, apontando para uma relevância biológica destas mensagens em doenças complexas como o câncer. Nós também avaliamos a existência de um mecanismo comum de regulação de transcrição, compartilhado por mRNAs codificadores de proteína e RNAs intrônicos, através de análises de perfis de expressão de uma linhagem tumoral de próstata estimulada por andrógeno. A análise de ESTs e mRNAs depositados em bancos públicos de seqüências revelou mais de 55 mil RNAs Totalmente Intrônicos Não-codificadores (TIN), transcritos dos íntrons de 74% de todos os genes RefSeq únicos. Guiados por esta informação, nós desenhamos uma plataforma de oligonucleotídeos contendo sondas senso e antisenso para cada um de 7.520 transcritos TIN selecionados aleatoriamente, além de sondas para os genes codificadores de proteína correspondentes. Nós identificamos assinaturas intrônicas e exônicas de expressão tecido-específicas em fígado, próstata e rim. Os RNAs TIN antisenso mais altamente expressos eram transcritos de íntrons de genes codificadores de proteína enriquecidos na categoria ?Regulação da transcrição?. A inibição da RNA Polimerase II resultou num aumento de expressão de uma fração dos RNAs intrônicos em células em cultura, sugerindo que outras RNA Polimerases possam estar envolvidas em sua biossíntese. Um subconjunto das assinaturas intrônicas e exônicas localizadas nos mesmos loci genômicos possuíram padrões de expressão correlacionados, sugerindo que RNAs intrônicos regulem a abundância ou o padrão de uso de éxons de mensagens codificadoras de proteína. Nós identificamos diversos padrões de expressão de RNAs intrônicos, indicando que eles possam ter papéis regulatórios. Esta estratégia orientada pelo gene, que combina um microarray intrônico/exônico deve permitir análises comparativas futuras de transcrição intrônica sob várias condições fisiológicas e patológicas, avançando assim em nosso conhecimento sobre as funções biológicas destes RNAs não codificadores. / In this work, we show large-scale studies of antisense noncoding RNAs transcribed from intronic regions of human genes. The correlation of expression levels of some intronic transcripts to the degree of tumor differentiation in prostate cancer points to the biological relevance of these messages in complex diseases such as cancer. We also evaluated the existence of a common mechanism of regulation of transcription shared by protein-coding mRNAs and intronic RNAs by measuring the effect of androgen on the transcriptional profile of a prostate cancer cell line. Survey of mRNA and EST public databases revealed more than 55,000 Totally Intronic Noncoding (TIN) RNAs transcribed from the introns of 74% of all unique RefSeq genes. Guided by this information, we designed an oligoarray platform containing sense and antisense probes for each of 7,520 randomly-selected TIN transcripts plus probes for the corresponding protein-coding genes. We identified exonic and intronic tissue-specific expression signatures for human liver, prostate and kidney. The most highly expressed antisense TIN RNAs were transcribed from introns of proteincoding genes enriched in the \"Regulation of transcription\" class. RNA Polymerase II inhibition resulted in increased expression of a fraction of the intronic RNAs in cell cultures, suggesting that other RNA polymerases may be involved in their biosynthesis. A subset of intronic and protein-coding signatures transcribed from the same genomic loci has correlated expression patterns, suggesting that intronic RNAs regulate the abundance or the pattern of exon usage in protein-coding messages. We have identified diverse intronic RNA expression patterns, indicating that they may have regulatory roles. This gene-oriented approach, using a combined intronic/exonic microarray should permit further comparative analysis of intronic transcription under various physiological and pathological conditions, thus advancing current knowledge about the biological functions of these noncoding RNAs.

O relógio biológico é um mecanismo molecular autossustentado gerador de ritmos. Ele integra vias de percepção das condições ambientais com um oscilador central para gerar respostas fisiológicas rítmicas em escalas diária e sazonal. Nas plantas, o relógio biológico está associado a vias metabólicas e fisiológicas importantes, como fotossíntese. Na cana-de-açúcar, uma gramínea de grande interesse econômico, estudos realizados em condições circadianas mostraram que o relógio biológico tem uma influência superior àquela vista em outras plantas. Assim, este trabalho visa a compreender os mecanismos de funcionamento do oscilador central do relógio biológico da cana-de-açúcar crescida em campo. Para tanto, foram investigados o transcriptoma de diferentes órgãos da cana-de-açúcar; a expressão de isoformas alternativas e de múltiplos alelos dos genes do relógio biológico da cana; e o efeito do sombreamento mútuo das plantas em campo sobre o funcionamento do relógio biológico. Os resultados obtidos sugerem que o relógio biológico é funcional e sincronizado entre os diferentes órgãos da cana-de-açúcar analisados. Os transcritos regulados sinergicamente pelo relógio biológico e pelo ambiente flutuante pertencem a vias metabólicas, fisiológicas e de regulação gênica e epigenéticas todas essenciais à produtividade da cana-de-açúcar. O sombreamento mútuo observado em campo parece alterar a fase de expressão de genes do relógio biológico da cana-de-açúcar. Além disso, eventos de splicing alternativo foram observados nos genes do relógio biológico em condições de baixa temperatura e múltiplos alelos dos genes do relógio biológico são expressos e a regulação de sua expressão parece ser sazonal. / The circadian clock is a self-sustaining molecular mechanism that generates rhythms. It perceives the environmental conditions and connects this pathway with its central oscillator, generating daily and seasonal rhythms of physiological responses. In plants, the circadian clock is associated with major metabolic and physiological pathways. In sugarcane, an economically important grass, previous studies showed that the circadian clock has the largest influence on plants seen so far under circadian conditions. This work aims to understand how the central oscillator of the circadian clock works in field-grown sugarcane. Thus, the transcriptome from different sugarcane organs; the expression of alternative isoforms and multiple alleles of circadian clock genes; and the effect of mutual shading in the field on the circadian clock function were analyzed. The results suggest that there is a functional and synchronized circadian clock in the different sugarcane organs. The transcripts regulated synergistically by the circadian clock and the variable environment are related to metabolic, physiological, genetic or epigenetic pathways, all important to sugarcane productivity. Mutual shading observed in the field seems to change the phase of expression of the sugarcane circadian clock. Besides, alternative splicing events have been reported for circadian clock genes under low temperature conditions and multiple alleles of circadian clock genes are expressed and their expression is likely to be seasonally regulated.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2015-12-04T17:40:43Z No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 8250469 bytes, checksum: d5749466ebaf01dd23c74317cbef4a6a (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2015-12-07T03:23:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 8250469 bytes, checksum: d5749466ebaf01dd23c74317cbef4a6a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-07T03:23:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 8250469 bytes, checksum: d5749466ebaf01dd23c74317cbef4a6a (MD5) Previous issue date: 2015-01-27 / O objetivo geral deste estudo foi investigar variações genômicas e transcriptômicas do receptor de hormônio luteinizante (LHR) e seu papel nos processos de dominância folicular e resposta à superovulação em bovinos. Foram realizados três experimentos, sendo que em todos se utilizou cDNA sintetizado a partir do RNA total extraído de células da granulosa (CG) folicular. Para a caracterização do transcrito do LHR, CG foram recuperadas de folículos dominantes de vacas das raças Gir (n=16) e Holandês (n=16). Após a PCR e o sequenciamento, os dados foram analisados para a presença de polimorfismos, frequência alélica, conteúdo de informação polimórfica (PIC) e Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE). Vinte e um polimorfismos de base única (SNPs) foram identificados, sendo 17 em Gir e 14 em Holandês. A classificação dos SNPs de acordo com os valores de PIC identificou 12 como altamente informativos em Gir e cinco em Holandês. Em relação a HWE, oito SNPs não estavam em equilíbrio em Gir e 10 em Holandês. Duas isoformas derivadas de splicing alternativo também foram identificadas, uma no éxon 1 e outra no éxon 10. Conclui-se que o LHR em bovinos leiteiros apresenta uma alta frequência de polimorfismos e múltiplas isoformas. Para avaliar o papel das isoformas do LHR nas CG durante a divergência folicular, a emergência da onda folicular foi sincronizada em novilhas Gir (n=10) e Holandês (n=10) e os folículos foram aspirados individualmente em diâmetros correspondentes aos períodos de pré-divergência, divergência, e pós-divergência. A expressão relativa das isoformas de LHR foi determinada por PCR em Tempo Real e os resultados foram relacionados com as concentrações intrafoliculares de estradiol (E2if). Em ambas as raças, houve um aumento progressivo na concentração de E2if ao longo do desenvolvimento folicular. O E2if foi maior em Holandês quando comparado com Gir antes, durante, e depois da divergência; mas foi similar em folículos de mesmo diâmetro nas duas raças. Observou-se um pico de expressão de LHR total após o início da divergência folicular. A expressão das isoformas de LHR foi ou baixa (Holandês) ou sub-regulada (Gir) durante este mesmo período. Os resultados sugerem que a divergência precoce do folículo dominante em raças de Bos indicus podem estar relacionados à maior sensibilidade ao feedback negativo do estradiol. Além disso, mudanças sequenciais na expressão das isoformas de LHR podem regular a função do LHR durante da divergência folicular em bovinos. A avaliação do comportamento das isoformas de LHR durante a indução exógena do crescimento folicular foi realizada em novilhas Gir caracterizadas com boa (n=5) ou má (n=5) resposta à superovulação. Em ambos os grupos, foram coletadas CG de folículos (8 mm) cujo crescimento ocorreu sem (Controle) ou com estimulação por FSH (SOV). No grupo de boa resposta, não houve diferença na expressão de LHR total entre os tratamentos Controle e SOV. No grupo de má resposta, a expressão de LHR total foi menor em SOV comparado com Controle, mas não houve diferença na expressão das isoformas. Conclui-se que o LHR é diferencialmente expresso em folículos dominantes de novilhas caracterizadas com boa ou má resposta a superovulação. / The aim of this study was to evaluate genomic and transcriptomic variations at the luteinizing hormone receptor (LHR) and its role at the follicular dominance establishment and superovulation outcome in bovine. Three experiments were performed, and for all evaluations cDNA synthesized from total RNA extracted from follicular granulosa cells (GC) were used. To characterize the LHR transcript, GC were recovered from dominant follicles from Gir (n=16) and Holstein (n=16) cows. After PCR and sequencing, data were analized to identify polymorphisms, allelic frequency, polymorphic information content (PIC) and Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). Twenty one single nucleotide polymorphism (SNP) were identified, being 17 in Gir and 14 in Holstein. The classification of SNP according to PIC values identified 12 as highly informative in Gir and five in Holstein. Considering HWE, eight SNP were not in equilibrium in Gir and 10 in Holstein. Two isoforms were also identified, one in exon 1 and other in exon 10. We concluded that LHR in dairy cattle shows a high frequency of polymorphism and multiple isoforms. To evaluate the LHR isoforms role in GC during follicular divergence, the follicular wave emergence was synchronized in Gir (n=10) and Holstein (n=10) heifers and follicles were individually aspirated at the corresponding sizes of pre-, divergence, and post-. The relative expression of LHR isoforms was determined by real time PCR and results were correlated to the intrafollicular estradiol (E2if) concentrations. In both breeds, there was a progressive increase in E2if concentration during follicular development. The E2if in Holstein was higher when compared to Gir before, during, and after divergence; but was similar in follicles of same size in both breeds. We observed a peak for the total LHR expression after the beginning of the follicular divergence. The expression of LHR isoforms was low (Holstein) or under-regulated (Gir) during this same period. The results suggest that the early follicular divergence of the dominat follicle in Bos indicus breeds can be related to a higher sensitivity to the estradiol negative feedback. Besides, sequential changes in LHR isoforms expression can act regulating the LHR function during folicullar divergence in bovine. The evaluation of LHR isoforms behavior during the exogenous induction of follcilualr development was performed in Gir heifer previously characterized as good (n=5) or poor (n=5) responders to superovulation. In both groups, GC were collected from follicles (8 mm) which growth occurred without (Control) or with FSH stimulation (SOV). In good responders group, there was no difference in the LHR expression between the Control and SOV treatments. In the poor responders group, the total LHR expression was lower in SOV when compared to Control, but there was no difference in the expression of the isoforms. We concluded that LHR is differentially expressed in dominant follicles from heifers characterized as good or poor responders to superovulation.

A pós-genômica surgiu como um próspero campo para que as infinidades de seqüências provenientes dos projetos genoma tenham os seus significados biológicos elucidados. Um dos mecanismos descritos na literatura capaz de gerar surpreendente diversidade protéica é o splicing alternativo (AS). Próximo de 22% das proteínas com estruturas tridimensionais resolvidas por difração de raios-X ou ressonância magnética nuclear (RMN) são humanas e pouco se sabe dos efeitos de eventos de splicing alternativo em suas funções. Uma vez que estas estruturas tridimensionais (3D) protéicas humanas são de alguma forma redundantes, o conjunto de genes humanos únicos que as correspondem é muito reduzido, em torno de 1%. Hoje em dia ainda são escassos os exemplos de duas isoformas de splicing alternativo de um mesmo gene com estruturas tridimensionais experimentais disponíveis. A variedade de proteínas que este evento pode potencialmente produzir é demasiado grande para que projetos de genômica estrutural em andamento consigam determinar suas estruturas. Isto tem inviabilizado, ainda que temporariamente, estudos sobre implicações funcionais de splicing alternativo no proteoma quando se utilizando dados estruturais experimentais. Entretanto, a bioinformática possibilita estudos deste porte com base nos dados de mapeamento no genoma, tanto de transcritos como de proteínas com estrutura tridimensional (3D) determinada. Torna-se possível, então, a prospecção de genes com isoformas de AS com estruturas 3D contendo informação adicional quando comparada à isoforma de AS. Produzimos para tal finalidade uma nova metodologia para detecção de eventos de AS no transcriptoma humano utilizando matrizes binárias para cada transcrito e estrutura de proteína 3D. Selecionadas as isoformas protéicas putativas, foram construídas 73 estruturas 3D utilizando conceitos de modelagem molecular por homologia. Foram escolhidas aleatoriamente 21 isoformas de AS para simulações por dinâmicas moleculares (SDM), e que cerca de 80% destes modelos se apresentaram estruturalmente estáveis. A anotação biológica relativa a cada fragmento não inserido na seqüência da proteína devido à sua remoção no mRNA resultante do evento de AS foi obtida e mostrou que mais de 80% delas possuem algum tipo de relevância funcional para a proteína. Concluímos que, para o nosso conjunto de dados, os eventos de splicing alternativo produzem isoformas que podem atuar como dominantes negativas, antagonistas ou atenuadoras da sua atividade biológica. / The post-genomic era has emerged as one prosper field to deal with the huge amount of sequences produced by genome projects and increase the understanding of its biological meaning. One of the most surprising mechanisms capable to generate a lot of protein diversity is alternative splicing in immature mRNAs. No more than 22% of the known protein structures elucidated by X-ray diffraction or nuclear magnetic resonance (NMR) were made using human proteins and the knowledge about alternative splicing functional implications is weak. Since those human protein three-dimensional structures (3D) are redundant, the unique number of human genes represented by them is estimated around 1%. Nowadays there are only a few cases describing two isoforms that have their own protein 3D structures done experimentally. The variety that alternative splicing can produce is large enough to structural genome projects undergoing could determinate its structures, fact that have negating, at least for a while, large-scale studies about functional implications of alternative splicing using experimental data. However, bioinformatics turn possible this kind of projects using the mapping onto the genome of transcripts and the sequence of the known protein 3D structures. Using this approach we searched for alternative splicing isoforms which have at least one known protein structure with additional biological information when compared against the isoform. We have produced a new methodology for detecting alternative splicing in the human transcriptoma using binary matrices for each transcript and known 3D protein structure. After the selection of putative isoforms, there were constructed 73 3D protein using concepts of molecular modelling by homology. There were randomly selected 21 of them to the submitted to molecular dynamics simulations and 80% of them showed that they were structurally stable. The biological annotation of each non-inserted fragment due to alternative splicing shows that 80% of them have in some degree functional importance. Then, we conclude that, for our dataset, the alternative splicing events produce isoforms that can act as negative dominants, antagonists or even regulators of their biological activity.

O splicing alternativo é um processo no qual moléculas idênticas de pré-mRNA são processadas de diferentes formas. Ele é fundamental em organismos complexos, pois é responsável por criar uma ampla diversidade de proteínas a partir de um número relativamente pequeno de genes. Contudo, poucas proteínas advindas do splicing alternativo já foram identificadas, visto que a maioria dos espectros de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) não encontra sequências correspondentes nos diversos bancos de dados de proteínas disponíveis. Entre diversos fatores, isso ocorre porque um número reduzido de eventos de splicing alternativo (ASEs) são conhecidos e devidamente estudados. Nesse trabalho, o espectro de eventos observáveis foi ampliado por meio da análise de eventos complexos de splicing alternativo (CASEs), que consideram múltiplos ASEs em um ou diferentes transcritos. Foi desenvolvido um novo método de análise utilizando expressões regulares (regexes) associada a uma sintaxe baseada em caracteres intuitivos. O método de análise e a sintaxe foram implementados em uma ferramenta web denominada de SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) que também apresenta ferramentas extras de análise. Adicionalmente, os subestimados eventos do tipo retenção de íntron (IR) foram explorados em busca de evidências funcionais por meio de análises de MS/MS. Como resultado, eventos bastante incomuns foram observados no proteoma humano, sugerindo que muito pouco ainda é conhecido sobre a complexidade transcriptômica e proteômica humana. Portanto, com base nesses dados, esse trabalho representa um grande avanço no estudo de fenômenos de splicing alternativo ainda pouco explorados. / Alternative splicing is defined, basically, as a process in which identical pre-mRNA molecules are processed in different ways in terms of usage of exon/introns borders. It is a fundamental process in complex organisms, and is responsible for creating a large diversity of proteins from a relatively small number of genes. However, just a few proteins resulted from alternative splicing were already identified, since only a small part of \\emph mass spectrometry (MS/MS) spetras match proteins in sequence databases. Among different factors, it occurs because a reduced number of alternative splicing events (ASEs) are known and properly studied. In this work, the landscape of observable events was amplified through the analysis of complex alternative splicing events (CASEs), which consider different ASEs within the same or different transcripts. A method of analysis was developed using regular expressions (regexes) associated with a syntax composed of intuitive characters. Those features were implemented in a web tool called SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) that also has extra analysis tools.Furthermore, the understudied events known as intron retention (IR) were explored using MS/MS analyses as a strategy to identify functional roles. As result, very uncommon events were observed in human proteome, suggesting that little is currently known about the complexity of the human proteome and transcriptome. Based on those data, it can be concluded that this work represents a significant advance in the study of uncommon and understudied alternative splicing events.

A proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (do inglês, Fragile Mental Retardation 1, FMR1) tem expressão significativa no encéfalo, gônadas e células proliferativas. A FMRP é uma proteína ligante de RNA, repressora traducional, que transita entre o núcleo celular, grânulos citoplasmáticos e polissomos. Sua associação a RNA pode se dar pelos domínios Tudor N-terminais, dois domínios centrais, com homologia à heteronucleoproteína K (KH) ou motivos RGG, ricos em arginina (R) e glicina (G), C-terminais. A abolição da expressão da FMRP por mutações no gene FMR1 é a causa mais frequente de deficiência intelectual hereditária entre homens. Transcritos desse gene sofrem splicing alternativo de quatro éxons, podendo gerar até 20 isoformas não redundantes da FMRP. A tradução de RNAm do FMR1 contendo o éxon 12 causa uma extensão em fase, em 21 aminoácidos na alça variável do segundo domínio KH (KH-2) da FMRP, cujos padrão de expressão e função ainda são desconhecidos. Embora a FMRP tenha alta similaridade com duas proteínas parálogas, proteínas relacionadas à FMRP, FRX1P e FXR2P, ela apresenta algumas características de expressão e função que lhes são próprias. A longa alça variável do domínio KH-2, por exemplo, não é observada nas parálogas e é característica somente de ortólogas da FMRP em mamíferos. Assim, é possível que o estudo deste segmento da proteína traga informações funcionais específicas para o encéfalo de mamífero. Demonstramos anteriormente, por qRT-PCR, que, em transcritos do Fmr1 de rato, a expressão da sequência do éxon 12 é regulada ao longo do desenvolvimento pós-natal precoce, de forma diferencialmente positiva no córtex cerebral frontal e cerebelo, em relação ao hipocampo. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos, tendo como objetivo a análise cuidadosa da expressão desse éxon em isoformas da FMRP (FMRP+12ISO), pelo uso de um anticorpo dirigido ao segmento codificado por ele, em encéfalos do décimo segundo dia pós-natal (P12, controle positivo) ou embrionários. Para tal, foram realizadas análises por imunoistoquímica e, em P12, ensaios de cromatografia de exclusão molecular de partículas ribonucleoproteicas. Análises de níveis de RNAm e proteicos em fase embrionária (E12 a E20) do encéfalo do rato foram também conduzidas in vivo e in vitro, em cultivo primário de neuroesferas em suspensão, a partir da dissociação de vesículas telencefálicas de ratos em E14. Os dados de imunoistoquímica de encéfalo de ratos em P12 indicaram que (i) as camadas granular externa e a camada piramidal externa do córtex cerebral e as células de Purkinje no cerebelo são mais ricas em FMRP+12ISO; (ii) o giro denteado e CA3 foram fontes de FMRP+12ISO no hipocampo, porém em mais baixa intensidade; e (iii) o conjunto das isoformas da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, foram expressas em região periventricular dos ventrículos laterais em período pós-natal, sugestivo de células-tronco neurais do adulto ou recém diferenciadas. No córtex cerebral, as FMRP+12ISO foram expressas em áreas motora (segmento rostrodorsal), sensorial (segmentos dorsolaterais a laterais), auditiva (segmentos dorsolaterais), olfatória (córtex piriforme) e visual (segmentos ventrolaterais), além da área do cingulado (segmentos mediais) de ambos os hemisférios cerebrais. Os dados também confirmaram que, em P12, as FMRP+12ISO têm expressão mais pronunciada no córtex cerebral e cerebelo do que no hipocampo. À cromatografia, as FMRP+12ISO tiveram o mesmo padrão de distribuição que o conjunto das isoformas da FMRP, fracionando em complexos ribonucleoproteicos maiores que 600 kDa. De modo geral, a expressão das FMRP+12ISO foi baixa em E12 e E14. Houve concordância entre as análises por qRT-PCR, Western blotting e imunoistoquímica, corroborando a baixa expressão do éxon 12 do FMR1 na vesículas telencefálicas em E14. Observamos por imunoistoquímica poucas células sugestivas de progenitoras, na base do neuroepitélio, que expressassem FMRP+12ISO ou outras isoformas da FMRP. O córtex cerebral em E20 foi raramente positivo para FMRP+12ISO ou o conjunto das isoformas da FMRP. Por outro lado, células da camada mais superficial da placa cortical, indicativa de ser a camada I, mostraram expressão de isoformas da FMRP sem o segmento codificado pelo éxon 12 do Fmr1, em E18 e da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, em E20, de forma contínua em várias regiões corticais. Em neuroesferas em suspensão, a expressão das FMRP+12ISO foi muito baixa enquanto isoformas da FMRP, supostamente com a alça variável de KH- 2 em sua conformação curta, tiveram alta expressão nessas células. Desde as primeiras 24 horas sob condições de diferenciação neuronal in vitro, células de neuroesferas aumentaram a expressão das FMRP+12ISO, que se mantiveram alta no período analisado (12 dias in vitro), colocalizando-se com outras isoformas da FMRP. Ensaios preliminares in vitro pela interferência do RNA, em células imortalizadas C6, indicaram um RNA em fita dupla, entre dois testados, com capacidade de inibição de mensagens do Fmr1 que especificamente contenham o éxon 12. A expressão do éxon 12 do FMR1 no córtex cerebral frontal, humano, em envelhecimento foi baixa pela análise de RNAm, enquanto o total de transcritos deste gene apresentou-se em níveis significativos. Nossos dados sugerem que a expressão do éxon 12 do Fmr1 é mais significativa para FMRP+12ISO em células neuronais, durante um período crítico de sinaptogênese, no primeiro mês pós-natal do rato. O tecido telencefálico, embrionário não se mostrou uma fonte rica dessas isoformas, principalmente em células indiferenciadas, que foram francamente negativas / Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), codified by Fragile Mental Retardation 1 (FMR1) gene, is significantly expressed in the brain, gonads and proliferative cells. FMRP is an RNA-binding protein and acts as a translation repressor, which transits between cell nucleus, cytoplasmic granules and polysomes. Its association with RNA occurs via several domains, namely: Nterminal Tudor domains; two central domains with K-heteronucleoprotein (KH) homology; and C-terminal RGG motifs, that are rich in arginine (R) and glicine (G). The absence of FMRP expression triggered by mutations in the FMR1 gene is the most frequent cause of hereditary intellectual disability in human men. Four FMR1 exons may undergo alternative splicing, generating up to 20 non-redundant FMRP isoforms. The translation of the FMR1 mRNA containing exon 12 leads to an in-phase extension of 21 amino acids in the variable loop on FMRP the second KH domain (KH-2). The pattern of expression and function of this isoform are unknown. Although FMRP is highly similar to two paralogs proteins, FMRP-related proteins FRX1P and FRX2P, it presents some unique expression and function characteristics. The long variable loop of the KH-2 domain, for example, is not observed in these paralogs and is a hallmark of FMRP mammal orthologs. Therefore, the study of this protein segment can potentially bring information about its function specifically in the mammalian brain. Using qRT-PCR and Western blotting, we previously demonstrated that, for rat Fmr1 transcripts, the expression of sequences containing exon 12 is regulated during early postnatal development. In this period, expression of these segments in the frontal cerebral cortex and in the cerebellum is higher when compared to hippocampus expression. In the present work, we deepened these studies with the objective of carefully analysing the expression of FMRP isoforms containing FMRP exon 12 (FMRP+12ISO). For this purpose, we employed rat postnatal brains at the twelfth postnatal day (P12, used as a positive control) and rat embryo brain in immunohistochemistry assays with antibodies detecting peptides codified by exon 12. In this strategy, we also carried out molecular exclusion chromatography of ribonucleoproteins particles with lysates from rat P12 encephalon. Analysis of mRNA and protein levels in rat brain in the embryonic period [embryonic days 12 to 20 (E12 to E20)] were conducted in vivo and in vitro, in neurosphere suspension primary cultures, obtained by dissociation of telencephalic vesicles from E14 rats. Immunohistochemical data from P12 rat brain indicated that (i) the granular external layers and pyramidal external layer in the brain cortex and Purkinje cells in the cerebellum are richer in FMRP+12ISO; (ii) in the hippocampus, FMRP+12ISO can be found in dentate gyrus and CA3, although in lesser intensities; and (iii) FMRP isoforms, including FMRP+12ISO, are expressed in the periventricular regions from the lateral ventricles, suggesting their expression in adult neural stem cells or in differentiating cells. In the cerebral cortex, FMRP+12ISO are expressed in motor areas (rostrodorsal segment) and in sensorial areas (dorsolateral and lateral segments), specifically in auditory (dorsolateral segments), olfactory (piriform cortex) and visual (ventrolateral segments) areas, besides expression in the cingulate área (medial segment) in both hemispheres. Our data also confirmed that, in P12 brain, cerebral cortex and cerebellum have higher FMRP+12ISO expression when compared to the hippocampus. Chromatography data indicated that FMRP+12ISO have the same pattern of distribution than the FMRP isoform group, fractionating in ribonucleoproteics complexes heavier than 600kDa. Altogether, FMRP+12ISO expression is low in E12 and E14 rat brain. qRT-PCR, Western blotting and immunohistochemistry data were concordant, corroborating the low expression of exon 12 in E14 telencephalic vesicles. In immunohistochemistry images, we observed few cells with progenitor phenotype, at the basal neuroepithelium, expressing FMRP+12ISO or other FMRP isoforms. In E20, cerebral cortex was rarely positive for FMRP+12ISO or other FMRP isoforms. Still, cells in the superficial layer of the cortical plate, possibly layer 1, were positive for FMRP isoforms that do not contain the segment codified by exon 12 in E18, brains and positive for the ensemble of FMRP, isoforms, FMRP+12ISO included, in E20 brains, in continuous portions of several cortical regions. In suspension neurosphere cultures, FMRP+12ISO expression was very low, while the expression of FMRP isoforms, supposedly with the variable loop of KH-2 in its short conformation, was high in. After 24 hours under neuron differentiation conditions in vitro, neurosphere cells showed increasing expression of FMRP+12ISO, which remained high during the period analyzed (12 days in vitro), co-localizing with other FMRP isoforms. Preliminary assays using RNA interference in vitro in an immortalized glioma cell lineage (C6), disclosed a double-stranded RNA, among two tested samples, with the ability to suppress exon 12 containig Fmr1 mRNA. The expression of FMR1 transcripts containing exon 12 in aging human brain frontal cortex was low, while total FMR1 transcripts levels were significant. Our data suggest that the expression of exon 12 from Fmr1 is more significant in rat neuronal cells during a critical period of synaptogenesis in the first postnatal month. The embryonic telencephalic tissue is not rich in FMRP+12ISO, which were notably absent from undifferentiated cells

O splicing alternativo do pré-mRNA de BCL-X produz duas isoformas de mRNAs com funções antagônicas, a pró-apoptótica BCL-XS e a anti-apoptótica BCL-XL, cujo balanço regula a homeostasia celular. Entretanto, o mecanismo que regula esse processamento ainda é desconhecido. Nesse trabalho, nós identificamos e caracterizamos um longo RNA não codificador de proteínas (lncRNA) nomeado INXS, que é transcrito a partir da fita oposta do locus genômico de BCL-X, sendo menos abundante em linhagens celulares tumorais e tecidos tumorais de pacientes quando comparados com os respectivos pares não tumorais. INXS é um RNA unspliced de 1903 nts, é transcrito pela RNA Polimerase II, possui cap 5\', está enriquecido na fração nuclear das células e se liga à proteína Sam68 do complexo modulador de splicing. O tratamento de células tumorais 786-O com cada um de três agentes indutores de apoptose aumentou a expressão endógena do INXS, levando ao aumento expressivo da proporção entre os mRNAs de BCL-XS / BCL-XL, e ativação das caspases 3, 7 e 9. Estes efeitos foram anulados na presença do knockdown do INXS. Da mesma forma, a superexpressão ectópica do INXS causou uma mudança no splicing favorecendo a isoforma BCL-XS e ativação das caspases, aumentando os níveis da proteína BCL-XS e conduzindo as células à apoptose. Utilizando um modelo in vivo, cinco injeções intra-tumorais do INXS durante 15 dias causaram uma regressão acentuada no volume dos xenotumores. Portanto, INXS é um lncRNA que induz a apoptose, sugerindo que essa molécula seja um possível alvo a ser explorado na terapia contra o câncer. / BCL-X mRNA alternative splicing generates pro-apoptotic BCL-XS or anti-apoptotic BCL-XL, whose balance regulates cell homeostasis. However, the mechanism that regulates the splice shifting is incompletely understood. Here, we identified and characterized a long noncoding RNA (lncRNA) named INXS, transcribed from the opposite genomic strand of BCL-X, that was less abundant in tumor cell lines and patient tumor tissues compared with non-tumors. INXS is an unspliced 1903 nt-long RNA, is transcribed by RNA Polymerase II, 5\'-capped, nuclear enriched and binds Sam68 splicing-modulator. The treatment of tumor cell line 786-O with each of three apoptosis-inducing agents increased endogenous INXS lncRNA, increased BCL-XS / BCL-XL mRNA ratio, and activated caspases 3, 7 and 9. These effects were abrogated in the presence of INXS knockdown. Similarly, ectopic INXS overexpression caused a shift in splicing towards BCL-XS and activation of caspases, increasing the levels of BCL-XS protein and then leading the cells to apoptosis. In a mouse xenograft model, five intra-tumor injections of INXS along 15 days caused a marked regression in tumor volume. INXS is an lncRNA that induces apoptosis, suggesting that INXS is a possible target to be explored in cancer therapies.

O gene, uma seqüência de nucleotídeos necessária para a síntese de moléculas funcionais, é transcrito e regulado por um conjunto de processos e fatores extremamente complexos. Entender o momento e o tecido em que os genes são expressos, as isoformas funcionais, as regiões controladoras e os fatores envolvidos na regulação da expressão de cada gene é um dos grandes desafios da biologia molecular moderna. Hoje, com a enorme quantidade de informações de seqüências genômicas e de transcriptomas, aliado ao desenvolvimento de métodos computacionais para agrupar e analisar estes dados em larga escala, o estudo dos fenômenos relacionados à transcrição e regulação gênica está passando por uma revolução. Por exemplo, é possível medir, concomitantemente, a expressão gênica de milhares de genes em diferentes tecidos, assim como identificar diversos fenômenos que atuam nestes genes. Neste trabalho nós desenvolvemos e aplicamos métodos computacionais no estudo de quatro temas envolvendo aspectos chave da transcrição e regulação gênica. No primeiro trabalho, nós abordamos a expressão gênica tecido-específica através do estudo dos genes expressos no cérebro e em dez regiões cerebrais de camundongo. No segundo trabalho, nós identificamos seqüências potencialmente envolvidas no controle da transcrição gênica através do estudo de motivos sobre representados na região promotora dos genes de receptores olfativos. No terceiro trabalho, analisamos o transcriptoma humano quanto a presença de eventos de retenção de intron, um tipo de splicing alternativo. No quarto trabalho, nós abordamos a complexidade do transcriptoma e a regulação da expressão gênica através do estudo de pares de genes senso-antisenso em humanos e camundongos. Em todos os trabalhos, obtivemos resultados que nos permitiram tirar conclusões específicas sobre cada fenômeno estudado e nos mostraram a importância de estudá-los através de uma abordagem em larga escala. Adicionalmente, verificamos que os nossos métodos computacionais foram eficientes e adequados para o estudo da transcrição e regulação gênica em Homo sapiens e Mus musculus. / Genes, nucleotide sequences necessary for the synthesis of functional molecules, are transcribed and regulated by extremely complex cellular and molecular processes. To understand when and in which tissues the genes are expressed, their functional isoforms, control regions and the factors involved in gene regulation is one of major challenges of modern molecular biology. Today, the availability of complete genome sequences and transcriptomes, together with the development of new computational methods allows the study of phenomena related to the transcription and gene regulation in a large scale. For example, it is possible to quantify, concomitantly, gene expression of thousands of genes in different tissues and analyze different aspects of their regulation. In this work we developed and applied computational methods to the study of four key aspects of gene transcription and regulation. In the first study, we addressed tissue specific gene expression through the study of genes that are preferentially expressed in the brain and ten different mouse brain regions. In the second study, we identified sequences that are potentially involved in the control of gene transcription through the study of motifs that are over represented in the promoter region of olfactory receptor genes. In the third study, we browsed the human for the presence of intron retention, a type of alternative splicing. In the fourth study, we addressed the transcriptoma complexity and gene expression regulation through the study of pair of sense-antisense genes in human and mouse. In all studies, our results allowed us to make specific conclusions about each phenomenon analyzed which showed us the importance of a large scale approach. In addition, we verified that our computational methods can be efficiently applied to the study of transcription and gene regulation in Homo sapiens and Mus musculus.