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Semiquantificação de RNAm para receptores de gonadotrofinas em folículos de novilhas Nelore (Bos taurus indicus) / Semiquantification of mRNA for gonadotropins receptors in follicles of Nelore heifers (Bos taurus indicus)Fábio Varoni Pereira 06 February 2004 (has links)
A identificação de mecanismos moleculares é importante para entender os eventos fisiológicos que ocorrem durante o processo de maturação sexual. O objetivo deste trabalho foi semiquantificar o RNAm para os receptores de gonadotrofinas em células da granulosa de folículos dominantes em crescimento de novilhas Nelore pré-púberes, buscando associação com a fertilidade precoce. As novilhas foram separadas em Precoce (P, n=6) e Não Precoce (NP, n=16), de acordo com o diagnóstico positivo de gestação aos 15 meses de idade. Realizou-se exame ultra-sonográfico dos ovários durante 17 dias para a identificação da onda folicular, o folículo dominante com 8-9 mm foi aspirado via trans-vaginal. O RNA total foi extraído das amostras e convertido a DNA complementar que teve uma região amplificada para a expressão dos genes para os receptores de gonadotrofinas. A semiquantificação foi feita por análise digital onde levou-se em consideração a intensidade média das bandas (unidade arbitrária - UA) em gel de poliacrilamida (8%) corado com uma solução de TBE-brometo de etídio (0,02%). Foi utilizado o RNAm para o gene do GAPDH como controle interno para corrigir a expressão dos receptores de gonadotrofinas em função da quantidade de RNA em cada amostra. Não houve diferença entre P e NP na quantidade de RNAm para o receptor de FSH (FSHr, 1,14±0,07 e 1,19±0,04 UA) e de LH (LHr 0,79±0,12 e 0,78±0,05 UA, respectivamente). Foi detectada a presença de splicing alternativo do RNAm para o receptor de LH (LHrs), pelo aparecimento de banda com peso molecular diferente, em todos os animais do experimento, constatando-se através do sequenciamento que o material apresentava a deleção do exon 10. As novilhas P apresentaram maior percentagem de LHrs em relação ao LHr (LHrs/LHr) (83,66±4,26%) quando comparadas a NP (70,05±3,39%). A quantidade de RNAm para receptores de gonadotrofinas parece não estar relacionada com o aparecimento de fertilidade precoce, mas a maior percentagem de deleção do exon 10 no RNAm para o LHr pode estar envolvida com a fertilidade precoce em novilhas Nelore. / Identification of molecular mechanisms is important to understand the physiological events occurring during the process of sexual maturation. The objective of this work was to semiquantify the mRNA for gonadotropins receptors from granulosa cells of developing dominant follicles in pre-pubertal Nellore heifers and associate the results to precocious fertility. The heifers were sorted in Precocious (P, n=6) and Non Precocious (NP, n=16), according to positive pregnancy at 15 months of age. Ovarian ultrasound examination was performed through 17 days for follicular wave identification, the growing dominant follicle was aspirated at 8-9 mm. Total mRNA was extracted from the granulosa cells samples, converted to complementary DNA and had a region amplified for gene expression for gonadotropins receptors. The semiquantification was performed by digital analysis of intensity average for the bands (arbitrary unit - AU) in poliacrilamida gel (8%) stained with etidio TBE-bromide solution (0,02%). mRNA for GAPDH gene was used as internal control to correct the expression of gonadotropins receptors to the amount of mRNA in each sample. There was no difference between P and NP in the amount of mRNA for FSH receptors (FSHr, 1,14±0,07 and 1,19±0,04 AU) and LH receptors (LHr 0,79±0,12 and 0,78±0,05 AU, respectively). Heifers presented alternative splicing of mRNA for LH receptors (LHrs) evidenced through sequencing, as the absence of exon 10. P heifers presented greater percentage of LHrs in relation to LHr (LHrs/LHr) (83,66±4,26%) when compared the NP (70,05±3,39%). The amount of mRNA for gonadotropins receptors was not related with precocious fertility, but the greater percentage of exon 10 deletion from mRNA for LHr was associate the precocious fertility in Nelore heifers.
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Análise global do perfil transcricional e splicing alternativo no dermatófito Trichophyton rubrum exposto à doses subinibitórias de ácido undecanóico / Comprehensive analysis of the transcriptional profile and alternative splicing in the dermatophytes Trichophyton rubrum exposed to subinibitory doses of undecanoic acidNiege Silva Mendes 18 March 2016 (has links)
O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico, que invade tecidos queratinizados causando infecções superficiais e cutâneas. Algumas drogas são usadas para o tratamento das dermatofitoses, sendo o ácido undecanóico (AUN) uma delas. O AUN é o mais tóxico dos ácidos graxos saturados de cadeia média, utilizado como medicamento de uso tópico. O estudo de expressão gênica e mecanismos regulatórios são fundamentais para ampliar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta à exposição a estes agentes citotóxicos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos no processo adaptativo da exposição ao ácido undecanóico, através da análise global do transcriptoma e mecanismos regulatórios como o processamento alternativo. Para tanto o micélio de T.rubrum foi submetido ao ácido undecanóico por 3 e 12 h de exposição, em triplicata biológica, e o RNA resultante foi submetido ao sequenciamento por RNAseq. O sequenciamento gerou aproximadamente 58 milhões de reads por biblioteca, as quais foram filtradas e alinhadas com o genoma de referência utilizando-se os softwares FASTQC e bowtie2, respectivamente. A análise de expressão gênica diferencial foi feita por meio do pacote do Bioconductor DESeq e, para esta análise, foi utilizada a amostra de 0h como referência. Foram identificados 492 genes diferencialmente expressos em resposta ao AUN, sendo 385 e 210 genes modulados em resposta a 3 e 12 horas de exposição, respectivamente. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares envolvendo transporte transmembrana, degradação de xenobióticos, metabolismo de lipídeos e aminoácidos, secreção de enzimas proteolíticas e patogênese, sugerindo que o AUN ativa duas principais vias de sobrevivência em resposta a este agente estressor, a degradação e o efluxo da droga. Posteriormente, foram realizadas as análises de processamento alternativo quanto ao uso diferencial de exons por meio do algoritmo HTSeq e DEXSeq e retenção de introns utilizando-se algoritmos construídos na linguagem Perl. Os genes envolvidos em algum tipo de processamento alternativo estão relacionados com funções metabólicas variadas como tradução, transporte vesicular, metabolismo lipídico, biogênese ribossomal, sequência de ligação ao DNA, regulação da transcrição e processamento do pré-mRNA. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta de sobrevivência perante a exposição ao AUN. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is a filamentous fungus, anthropophilic that invades keratinized tissue causing superficial infections on the skin. Some drugs are used for the treatment of dermatophytosis, being the undecanoic acid (AUN) one of them. The AUN the most toxic of the saturated medium chain fatty acids, is used as a topical medicine. The study of gene expression and the regulatory mechanisms are fundamental to understand the molecular mechanisms involved in response to exposure of these cytotoxic agents. So, the aim of this study was to characterize the molecular mechanisms involved in the adaptive process of the exposure to undecanoic acid, by the global analysis of the transcriptome and regulatory mechanisms such as alternative splicing. To this end, the mycelium of T. rubrum was exposed to undecanoic acid for 3 or 12 hours in biological triplicate, and the resulting RNA was sequenced by RNA-Seq. The sequencing generated approximately 58 million of reads per library, which were filtered and aligned with the reference genome using the softwares and Bowtie2 and FASTQC, respectively. The analysis of differential gene expression was performed through the Bioconductor package DESeq and, for this analysis, we used as reference sample the 0h time. We identified 492 differentially expressed genes in response to UDA, being 385 and 210 genes modulated in response to 3 and 12 hours of exposure, respectively. These genes are related to various cellular processes involving the transmembrane transport, xenobiotics degradation, lipids and amino acids metabolism, secretion of proteolytic enzymes and pathogenesis, suggesting the activation of two major survival pathways in response to this stressor, degradation and drug efflux, by UDA. Also, the alternative splicing analysis was performed through the differential use of exons using the algorithms HTSeq and DEXSeq and intron retention using algorithms built in Perl language. The genes involved in some kind of alternative splicing are associated with various metabolic functions such as translation, vesicular transport, lipid metabolism, ribosomal biogenesis, DNA binding sequence, transcription regulation and processing of pre-mRNA. These results contribute to increase the knowledge of the molecular mechanisms involved in the survival response upon exposure to the AUN.
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Identificação de variantes de splicing sob influência da alta expressão do oncogene ERBB2 em câncer de mama / Identification of alternative splicing variants under the influence of ERBB2 high expression in breast cancerElisa Napolitano e Ferreira 16 September 2010 (has links)
O splicing alternativo é o processo pelo qual diversos transcritos podem ser gerados a partir de um único gene, sendo de extrema importância para diversidade do repertório transcricional e proteico. Diferentes variantes de splicing são expressas entre os diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento garantindo o funcionamento normal da célula, portanto, qualquer alteração neste padrão pode resultar no aparecimento de doenças. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de metodologias para identificação de variantes de splicing em câncer de mama sob influência do oncogene ERBB2, o qual é um marcador de mau prognóstico altamente expresso em cerca de 30% dos tumores de mama. Foram estabelecidas duas estratégias para construção de bibliotecas de cDNA. A construção de bibliotecas de cDNA enriquecidas para splicing alternativo, baseada na formação e captura de moléculas de heteroduplexes em combinação com a amplificação de RNAm, foi realizada a partir de RNA total de linhagem celular de mama e a partir de um grupo de cinco amostras tumorais, todas com alta expressão de ERBB2. Foram identificadas 79 possíveis variantes de splicing alternativo em câncer de mama, das quais 18 foram selecionadas para validação por RT-PCR. Foi obtida uma taxa de vallidação de 94% e foram identificadas duas novas variantes de splicing alternativo. A regulação da expressão mediada por ERBB2 de três variantes de splicing foi confirmada por duas metodologias distintas, eletroforese em chip e estratégia baseada na ligação de sondas específicas, que revelou desbalanço de expressão entre as variantes, demonstrando a influência do oncogene na regulação de variantes de splicing. A segunda abordagem utilizada, foi a construção de bibliotecas de cDNA para avaliação do transcriptoma total, utilizando sequênciamento de alto desempenho. Foram utilizados RNA total de duas linhagens celulares de mama que diferem apenas na expressão do gene ERBB2. Foram identificadas 2.865 novas variantes de splicing, das quais 20, que reportaram a identificação de um novo éxon, foram selecionadas para validação, com uma taxa de validação de 90%. Seis destas variantes apresentaram aumento de expressão na linhagem com alta expressão de ERBB2. Além disso, foi detectado um enriquecimento de algumas categorias de variantes na linhagem celular com alta expressão de ERBB2, reforçando a influência do oncogene na regulação do splicing alternativo, podendo resultar em variantes de splicing associadas a este grupo de câncer de mama, que podem ser candidatas a marcadores moleculares. / Alternative splicing is a process, by which many differente transcripts can be generated by one single gene, significantly expanding the transcriptional and proteomic diversity. Different splicing variants are generated among different transcripts and developmental stages, assuring normal cell function. Therefore, alterations in the splicing process can lead to diseases outcome. In this context, the aim of this study was the establishment of methodologies for the identification of alternative splicing in breast cancer influenced by ERBB2 oncogene, which is a poor prognostic molecular marker, highly expressed in 30% of human breast cancer. Two strategies were established for the construction of cDNA libraries. Alternative enriched splicing libraries, based on heteroduplex capture combined with mRNA amplification, were constructed from total RNA from a cell line and also from five tumor samples, all of them presenting high ERBB2 expression. Seventy nine putative splicing variants were identified and 18 of them were selected for RT-PCR validation. A high validation level was obtained (94%) and two novel alternative splicing variants were identified. ERBB2 mediated regulation was confirmed for three variants by two distinct methodologies, electrophoresis on a chip and probe specific ligation approach. The alteration in the expression balance of variants suggests the influence of the oncogene in the splicing pattern regulation. The second strategy was the construction of cDNA libraries for global transcriptome analysis based on deep sequencing. Total RNA from two mammary epithelial cell lines expressing different ERBB2 levels were used and 2,865 novel splicing variants were identified. Twenty novel events reporting the inclusion of novel exons were selected for RT-PCR validation with 90% validation rate. Six variants presented higher expression in the cell line with high levels of ERBB2. Moreover enrichment in splicing events was detected in the ERBB2 high expressing cell line, supporting the ERBB2 influence in alternative splicing regulation, possibly resulting in splicing variants associated to this subgroup of cancer that can be tested as molecular markers.
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Análise de características das seqüencias genômicas relacionadas a eventos de splicing alternativo do tipo retenção de intron no transcriptoma humano / Analysis of genomic sequence features related to alternative splicing events (intron retention) in the human transcriptomeNoboru Jo Sakabe 09 February 2007 (has links)
Os genes eucarióticos, em sua maioria, são divididos em exons e introns, requerendo processamento do RNAm para remover as sequências intrônicas e juntar os exons (splicing). As bordas exon/intron são definidas por sítios de splice que normalmente são reconhecidos com alta fidelidade, gerando os mesmos RNAms processados a cada vez. Apesar desse reconhecimento preciso, tem sido observada a junção de exons de maneiras alternativas (splicing alternativo), foco de muitos estudos recentes devido à sua importância em vários processos biológicos. Este processamento alternativo do RNAm pode ser principalmente de três tipos: exclusão de exon, no qual um exon pode ser incluído ou não no RNAm maduro; uso alternativo de sítios de splice, resultando em exons mais longos ou mais curtos e retenção de intron, o tipo menos estudado, no qual uma sequência intrônica é mantida no RNAm maduro. Um dos aspectos cruciais no entendimento de splicing alternativo é conhecer os mecanismos que levam à geração de diferentes transcritos. Coerente com a importância dos sítios de splice no splicing de RNAms, a retenção de intron parece ser causada por falha no reconhecimento daqueles que são sub-ótimos. Como os sítios de splice são reconhecidos aos pares ao se estabelecer uma ponte através de exons ou introns, dependendo de qual é mais curto, uma falha no reconhecimento de um exon ou de um intron leva a diferentes tipos de splicing alternativo (exclusão de exon ou retenção de intron, respectivamente). Desta forma, acredita-se que a ocorrência de retenção de intron esteja também associada a uma falha no reconhecimento de introns curtos. Embora estudos de introns retidos individuais tenham abordado estas questões, poucas análises sistemáticas de grandes quantidades de dados foram conduzidas sobre as características gerais que levam à retenção de intron. Para este fim, realizamos uma análise de bioinformática de sequências do genoma e transcriptoma (RNAm) humanos armazenadas em formato de computador. Para realizar as análises computacionais, desenvolvemos um sistema de anotação de splicing alternativo completo. Particionamos os eventos de retenção de intron identificados em sequências expressas pelo nosso sistema de anotação em dois grupos, com base na abundância relativa das duas isoformas (um grupo de eventos com <50% e outro com >50% de transcritos retendo o intron) e comparamos características relevantes. Verificamos que uma maior frequência de retenção de intron em humano está associada a sítios de splice mais fracos, genes com introns mais curtos e maior nível de expressão gênica, e menor densidade de um conjunto de elementos inibitórios exônicos e do promotor de splicing intrônico GGG. Os dois grupos apresentaram eventos conservados em camundongo, nos quais os introns retidos também eram curtos e apresentavam sítios de splice mais fracos. Embora nossos resultados tenham confirmado que sítios de splice mais fracos estão associados à retenção de intron, eles mostram que uma fração não-desprezível dos eventos não pode ser explicada apenas por esta característica. Nossa análise sugere que elementos reguladores em cis provavelmente têm um papel na regulação da retenção de intron e também revelou características previamente desconhecidas que parecem influenciar sua ocorrência. Estes resultados salientam a importância de considerar o compromisso entre estas características na regulação da frequência relativa de retenção de intron. / Most eukaryotic genes are split in exons and introns, requiring mRNA processing to remove intervening sequences and join exons (splicing). Exon/intron borders are defined by splice sites that are normally recognized with high fidelity, yielding the same processed mRNA each time. Notwithstanding such precise recognition, alternative joining of exons has been observed (alternative splicing) and is the focus of many recent studies, due to its importance in several biological processes. This alternative mRNA processing can be mainly of three types: exon skipping, whereby an exon may be included or not in the mature mRNA; alternative use of splice sites, resulting in longer or shorter exons and intron retention, the least studied type whereby an intronic sequence is maintained in the mature mRNA. One of the key aspects in understanding alternative splicing is to know the mechanisms that lead to the generation of different transcripts. Coherent with the importance of splice sites in mRNA splicing, intron retention seems to be caused by failure in the recognition of those that are sub-optimal. As splice sites are recognized in pairs by bridging either exons or introns, depending on which is the shortest, failure to recognize an exon or an intron leads to different types of alternative splicing (exon skipping or intron retention, respectively). This way, the occurrence of intron retention is believed to be associated to failure in recognition of short introns also. Although studies on individual retained introns have addressed such issues, few systematic surveys of large amounts of data have been conducted on the general features leading to intron retention. To this end, we performed a bioinformatics analysis of human genome and transcriptome (mRNA) sequences stored in computer format. To perform the computational analyses we developed a complete alternative splicing annotation system. We partitioned intron retention events identified in expressed sequences by our annotation system in two groups based on the relative abundance of both isoforms (one group of events with <50% and another with >50% of transcripts retaining the intron) and compared relevant features. We found that a higher frequency of intron retention in human is associated to weaker splice sites, genes with shorter intron lengths and higher expression level, and lower density of a set of exonic inhibitory elements and the intronic splicing enhancer GGG. Both groups of events presented conserved events in mouse, in which the retained introns were also short and presented weaker splice sites. Although our results confirmed that weaker splice sites are associated to intron retention, they showed that a non-negligible fraction of events can not be explained by this feature alone. Our analysis suggests that cis-regulatory elements are likely to play a crucial role in regulating intron retention and also revealed previously unknown features that seem to influence its occurrence. These results highlight the importance of considering the interplay among these features in the regulation of the relative frequency of intron retention.
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Explorando a complexidade do transcriptoma humano / Exploring the Complexity of Human TranscriptomeKroll, José Eduardo 12 December 2013 (has links)
O splicing alternativo é um processo no qual moléculas idênticas de pré-mRNA são processadas de diferentes formas. Ele é fundamental em organismos complexos, pois é responsável por criar uma ampla diversidade de proteínas a partir de um número relativamente pequeno de genes. Contudo, poucas proteínas advindas do splicing alternativo já foram identificadas, visto que a maioria dos espectros de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) não encontra sequências correspondentes nos diversos bancos de dados de proteínas disponíveis. Entre diversos fatores, isso ocorre porque um número reduzido de eventos de splicing alternativo (ASEs) são conhecidos e devidamente estudados. Nesse trabalho, o espectro de eventos observáveis foi ampliado por meio da análise de eventos complexos de splicing alternativo (CASEs), que consideram múltiplos ASEs em um ou diferentes transcritos. Foi desenvolvido um novo método de análise utilizando expressões regulares (regexes) associada a uma sintaxe baseada em caracteres intuitivos. O método de análise e a sintaxe foram implementados em uma ferramenta web denominada de SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) que também apresenta ferramentas extras de análise. Adicionalmente, os subestimados eventos do tipo retenção de íntron (IR) foram explorados em busca de evidências funcionais por meio de análises de MS/MS. Como resultado, eventos bastante incomuns foram observados no proteoma humano, sugerindo que muito pouco ainda é conhecido sobre a complexidade transcriptômica e proteômica humana. Portanto, com base nesses dados, esse trabalho representa um grande avanço no estudo de fenômenos de splicing alternativo ainda pouco explorados. / Alternative splicing is defined, basically, as a process in which identical pre-mRNA molecules are processed in different ways in terms of usage of exon/introns borders. It is a fundamental process in complex organisms, and is responsible for creating a large diversity of proteins from a relatively small number of genes. However, just a few proteins resulted from alternative splicing were already identified, since only a small part of \\emph mass spectrometry (MS/MS) spetras match proteins in sequence databases. Among different factors, it occurs because a reduced number of alternative splicing events (ASEs) are known and properly studied. In this work, the landscape of observable events was amplified through the analysis of complex alternative splicing events (CASEs), which consider different ASEs within the same or different transcripts. A method of analysis was developed using regular expressions (regexes) associated with a syntax composed of intuitive characters. Those features were implemented in a web tool called SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) that also has extra analysis tools.Furthermore, the understudied events known as intron retention (IR) were explored using MS/MS analyses as a strategy to identify functional roles. As result, very uncommon events were observed in human proteome, suggesting that little is currently known about the complexity of the human proteome and transcriptome. Based on those data, it can be concluded that this work represents a significant advance in the study of uncommon and understudied alternative splicing events.
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Variabilidade do domínio KH-2 da proteína do retardo mental do X frágil (FMRP) / Variability of the KH-2 domain in fragile X mental retardation proteinVelloso, Fernando Janczur 29 October 2013 (has links)
A proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (do inglês, Fragile Mental Retardation 1, FMR1) tem expressão significativa no encéfalo, gônadas e células proliferativas. A FMRP é uma proteína ligante de RNA, repressora traducional, que transita entre o núcleo celular, grânulos citoplasmáticos e polissomos. Sua associação a RNA pode se dar pelos domínios Tudor N-terminais, dois domínios centrais, com homologia à heteronucleoproteína K (KH) ou motivos RGG, ricos em arginina (R) e glicina (G), C-terminais. A abolição da expressão da FMRP por mutações no gene FMR1 é a causa mais frequente de deficiência intelectual hereditária entre homens. Transcritos desse gene sofrem splicing alternativo de quatro éxons, podendo gerar até 20 isoformas não redundantes da FMRP. A tradução de RNAm do FMR1 contendo o éxon 12 causa uma extensão em fase, em 21 aminoácidos na alça variável do segundo domínio KH (KH-2) da FMRP, cujos padrão de expressão e função ainda são desconhecidos. Embora a FMRP tenha alta similaridade com duas proteínas parálogas, proteínas relacionadas à FMRP, FRX1P e FXR2P, ela apresenta algumas características de expressão e função que lhes são próprias. A longa alça variável do domínio KH-2, por exemplo, não é observada nas parálogas e é característica somente de ortólogas da FMRP em mamíferos. Assim, é possível que o estudo deste segmento da proteína traga informações funcionais específicas para o encéfalo de mamífero. Demonstramos anteriormente, por qRT-PCR, que, em transcritos do Fmr1 de rato, a expressão da sequência do éxon 12 é regulada ao longo do desenvolvimento pós-natal precoce, de forma diferencialmente positiva no córtex cerebral frontal e cerebelo, em relação ao hipocampo. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos, tendo como objetivo a análise cuidadosa da expressão desse éxon em isoformas da FMRP (FMRP+12ISO), pelo uso de um anticorpo dirigido ao segmento codificado por ele, em encéfalos do décimo segundo dia pós-natal (P12, controle positivo) ou embrionários. Para tal, foram realizadas análises por imunoistoquímica e, em P12, ensaios de cromatografia de exclusão molecular de partículas ribonucleoproteicas. Análises de níveis de RNAm e proteicos em fase embrionária (E12 a E20) do encéfalo do rato foram também conduzidas in vivo e in vitro, em cultivo primário de neuroesferas em suspensão, a partir da dissociação de vesículas telencefálicas de ratos em E14. Os dados de imunoistoquímica de encéfalo de ratos em P12 indicaram que (i) as camadas granular externa e a camada piramidal externa do córtex cerebral e as células de Purkinje no cerebelo são mais ricas em FMRP+12ISO; (ii) o giro denteado e CA3 foram fontes de FMRP+12ISO no hipocampo, porém em mais baixa intensidade; e (iii) o conjunto das isoformas da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, foram expressas em região periventricular dos ventrículos laterais em período pós-natal, sugestivo de células-tronco neurais do adulto ou recém diferenciadas. No córtex cerebral, as FMRP+12ISO foram expressas em áreas motora (segmento rostrodorsal), sensorial (segmentos dorsolaterais a laterais), auditiva (segmentos dorsolaterais), olfatória (córtex piriforme) e visual (segmentos ventrolaterais), além da área do cingulado (segmentos mediais) de ambos os hemisférios cerebrais. Os dados também confirmaram que, em P12, as FMRP+12ISO têm expressão mais pronunciada no córtex cerebral e cerebelo do que no hipocampo. À cromatografia, as FMRP+12ISO tiveram o mesmo padrão de distribuição que o conjunto das isoformas da FMRP, fracionando em complexos ribonucleoproteicos maiores que 600 kDa. De modo geral, a expressão das FMRP+12ISO foi baixa em E12 e E14. Houve concordância entre as análises por qRT-PCR, Western blotting e imunoistoquímica, corroborando a baixa expressão do éxon 12 do FMR1 na vesículas telencefálicas em E14. Observamos por imunoistoquímica poucas células sugestivas de progenitoras, na base do neuroepitélio, que expressassem FMRP+12ISO ou outras isoformas da FMRP. O córtex cerebral em E20 foi raramente positivo para FMRP+12ISO ou o conjunto das isoformas da FMRP. Por outro lado, células da camada mais superficial da placa cortical, indicativa de ser a camada I, mostraram expressão de isoformas da FMRP sem o segmento codificado pelo éxon 12 do Fmr1, em E18 e da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, em E20, de forma contínua em várias regiões corticais. Em neuroesferas em suspensão, a expressão das FMRP+12ISO foi muito baixa enquanto isoformas da FMRP, supostamente com a alça variável de KH- 2 em sua conformação curta, tiveram alta expressão nessas células. Desde as primeiras 24 horas sob condições de diferenciação neuronal in vitro, células de neuroesferas aumentaram a expressão das FMRP+12ISO, que se mantiveram alta no período analisado (12 dias in vitro), colocalizando-se com outras isoformas da FMRP. Ensaios preliminares in vitro pela interferência do RNA, em células imortalizadas C6, indicaram um RNA em fita dupla, entre dois testados, com capacidade de inibição de mensagens do Fmr1 que especificamente contenham o éxon 12. A expressão do éxon 12 do FMR1 no córtex cerebral frontal, humano, em envelhecimento foi baixa pela análise de RNAm, enquanto o total de transcritos deste gene apresentou-se em níveis significativos. Nossos dados sugerem que a expressão do éxon 12 do Fmr1 é mais significativa para FMRP+12ISO em células neuronais, durante um período crítico de sinaptogênese, no primeiro mês pós-natal do rato. O tecido telencefálico, embrionário não se mostrou uma fonte rica dessas isoformas, principalmente em células indiferenciadas, que foram francamente negativas / Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), codified by Fragile Mental Retardation 1 (FMR1) gene, is significantly expressed in the brain, gonads and proliferative cells. FMRP is an RNA-binding protein and acts as a translation repressor, which transits between cell nucleus, cytoplasmic granules and polysomes. Its association with RNA occurs via several domains, namely: Nterminal Tudor domains; two central domains with K-heteronucleoprotein (KH) homology; and C-terminal RGG motifs, that are rich in arginine (R) and glicine (G). The absence of FMRP expression triggered by mutations in the FMR1 gene is the most frequent cause of hereditary intellectual disability in human men. Four FMR1 exons may undergo alternative splicing, generating up to 20 non-redundant FMRP isoforms. The translation of the FMR1 mRNA containing exon 12 leads to an in-phase extension of 21 amino acids in the variable loop on FMRP the second KH domain (KH-2). The pattern of expression and function of this isoform are unknown. Although FMRP is highly similar to two paralogs proteins, FMRP-related proteins FRX1P and FRX2P, it presents some unique expression and function characteristics. The long variable loop of the KH-2 domain, for example, is not observed in these paralogs and is a hallmark of FMRP mammal orthologs. Therefore, the study of this protein segment can potentially bring information about its function specifically in the mammalian brain. Using qRT-PCR and Western blotting, we previously demonstrated that, for rat Fmr1 transcripts, the expression of sequences containing exon 12 is regulated during early postnatal development. In this period, expression of these segments in the frontal cerebral cortex and in the cerebellum is higher when compared to hippocampus expression. In the present work, we deepened these studies with the objective of carefully analysing the expression of FMRP isoforms containing FMRP exon 12 (FMRP+12ISO). For this purpose, we employed rat postnatal brains at the twelfth postnatal day (P12, used as a positive control) and rat embryo brain in immunohistochemistry assays with antibodies detecting peptides codified by exon 12. In this strategy, we also carried out molecular exclusion chromatography of ribonucleoproteins particles with lysates from rat P12 encephalon. Analysis of mRNA and protein levels in rat brain in the embryonic period [embryonic days 12 to 20 (E12 to E20)] were conducted in vivo and in vitro, in neurosphere suspension primary cultures, obtained by dissociation of telencephalic vesicles from E14 rats. Immunohistochemical data from P12 rat brain indicated that (i) the granular external layers and pyramidal external layer in the brain cortex and Purkinje cells in the cerebellum are richer in FMRP+12ISO; (ii) in the hippocampus, FMRP+12ISO can be found in dentate gyrus and CA3, although in lesser intensities; and (iii) FMRP isoforms, including FMRP+12ISO, are expressed in the periventricular regions from the lateral ventricles, suggesting their expression in adult neural stem cells or in differentiating cells. In the cerebral cortex, FMRP+12ISO are expressed in motor areas (rostrodorsal segment) and in sensorial areas (dorsolateral and lateral segments), specifically in auditory (dorsolateral segments), olfactory (piriform cortex) and visual (ventrolateral segments) areas, besides expression in the cingulate área (medial segment) in both hemispheres. Our data also confirmed that, in P12 brain, cerebral cortex and cerebellum have higher FMRP+12ISO expression when compared to the hippocampus. Chromatography data indicated that FMRP+12ISO have the same pattern of distribution than the FMRP isoform group, fractionating in ribonucleoproteics complexes heavier than 600kDa. Altogether, FMRP+12ISO expression is low in E12 and E14 rat brain. qRT-PCR, Western blotting and immunohistochemistry data were concordant, corroborating the low expression of exon 12 in E14 telencephalic vesicles. In immunohistochemistry images, we observed few cells with progenitor phenotype, at the basal neuroepithelium, expressing FMRP+12ISO or other FMRP isoforms. In E20, cerebral cortex was rarely positive for FMRP+12ISO or other FMRP isoforms. Still, cells in the superficial layer of the cortical plate, possibly layer 1, were positive for FMRP isoforms that do not contain the segment codified by exon 12 in E18, brains and positive for the ensemble of FMRP, isoforms, FMRP+12ISO included, in E20 brains, in continuous portions of several cortical regions. In suspension neurosphere cultures, FMRP+12ISO expression was very low, while the expression of FMRP isoforms, supposedly with the variable loop of KH-2 in its short conformation, was high in. After 24 hours under neuron differentiation conditions in vitro, neurosphere cells showed increasing expression of FMRP+12ISO, which remained high during the period analyzed (12 days in vitro), co-localizing with other FMRP isoforms. Preliminary assays using RNA interference in vitro in an immortalized glioma cell lineage (C6), disclosed a double-stranded RNA, among two tested samples, with the ability to suppress exon 12 containig Fmr1 mRNA. The expression of FMR1 transcripts containing exon 12 in aging human brain frontal cortex was low, while total FMR1 transcripts levels were significant. Our data suggest that the expression of exon 12 from Fmr1 is more significant in rat neuronal cells during a critical period of synaptogenesis in the first postnatal month. The embryonic telencephalic tissue is not rich in FMRP+12ISO, which were notably absent from undifferentiated cells
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Caracterização do relógio biológico e seu impacto no metabolismo da cana-de-açúcar / Characterization of the circadian clock and its impact on sugarcane metabolismDantas, Luíza Lane de Barros 10 April 2017 (has links)
O relógio biológico é um mecanismo molecular autossustentado gerador de ritmos. Ele integra vias de percepção das condições ambientais com um oscilador central para gerar respostas fisiológicas rítmicas em escalas diária e sazonal. Nas plantas, o relógio biológico está associado a vias metabólicas e fisiológicas importantes, como fotossíntese. Na cana-de-açúcar, uma gramínea de grande interesse econômico, estudos realizados em condições circadianas mostraram que o relógio biológico tem uma influência superior àquela vista em outras plantas. Assim, este trabalho visa a compreender os mecanismos de funcionamento do oscilador central do relógio biológico da cana-de-açúcar crescida em campo. Para tanto, foram investigados o transcriptoma de diferentes órgãos da cana-de-açúcar; a expressão de isoformas alternativas e de múltiplos alelos dos genes do relógio biológico da cana; e o efeito do sombreamento mútuo das plantas em campo sobre o funcionamento do relógio biológico. Os resultados obtidos sugerem que o relógio biológico é funcional e sincronizado entre os diferentes órgãos da cana-de-açúcar analisados. Os transcritos regulados sinergicamente pelo relógio biológico e pelo ambiente flutuante pertencem a vias metabólicas, fisiológicas e de regulação gênica e epigenéticas todas essenciais à produtividade da cana-de-açúcar. O sombreamento mútuo observado em campo parece alterar a fase de expressão de genes do relógio biológico da cana-de-açúcar. Além disso, eventos de splicing alternativo foram observados nos genes do relógio biológico em condições de baixa temperatura e múltiplos alelos dos genes do relógio biológico são expressos e a regulação de sua expressão parece ser sazonal. / The circadian clock is a self-sustaining molecular mechanism that generates rhythms. It perceives the environmental conditions and connects this pathway with its central oscillator, generating daily and seasonal rhythms of physiological responses. In plants, the circadian clock is associated with major metabolic and physiological pathways. In sugarcane, an economically important grass, previous studies showed that the circadian clock has the largest influence on plants seen so far under circadian conditions. This work aims to understand how the central oscillator of the circadian clock works in field-grown sugarcane. Thus, the transcriptome from different sugarcane organs; the expression of alternative isoforms and multiple alleles of circadian clock genes; and the effect of mutual shading in the field on the circadian clock function were analyzed. The results suggest that there is a functional and synchronized circadian clock in the different sugarcane organs. The transcripts regulated synergistically by the circadian clock and the variable environment are related to metabolic, physiological, genetic or epigenetic pathways, all important to sugarcane productivity. Mutual shading observed in the field seems to change the phase of expression of the sugarcane circadian clock. Besides, alternative splicing events have been reported for circadian clock genes under low temperature conditions and multiple alleles of circadian clock genes are expressed and their expression is likely to be seasonally regulated.
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INXS, um longo RNA não codificador de proteínas mediador da apoptose / INXS, a long noncoding RNA that mediates apoptosisPereira, Carlos de Ocesano 29 January 2015 (has links)
O splicing alternativo do pré-mRNA de BCL-X produz duas isoformas de mRNAs com funções antagônicas, a pró-apoptótica BCL-XS e a anti-apoptótica BCL-XL, cujo balanço regula a homeostasia celular. Entretanto, o mecanismo que regula esse processamento ainda é desconhecido. Nesse trabalho, nós identificamos e caracterizamos um longo RNA não codificador de proteínas (lncRNA) nomeado INXS, que é transcrito a partir da fita oposta do locus genômico de BCL-X, sendo menos abundante em linhagens celulares tumorais e tecidos tumorais de pacientes quando comparados com os respectivos pares não tumorais. INXS é um RNA unspliced de 1903 nts, é transcrito pela RNA Polimerase II, possui cap 5\', está enriquecido na fração nuclear das células e se liga à proteína Sam68 do complexo modulador de splicing. O tratamento de células tumorais 786-O com cada um de três agentes indutores de apoptose aumentou a expressão endógena do INXS, levando ao aumento expressivo da proporção entre os mRNAs de BCL-XS / BCL-XL, e ativação das caspases 3, 7 e 9. Estes efeitos foram anulados na presença do knockdown do INXS. Da mesma forma, a superexpressão ectópica do INXS causou uma mudança no splicing favorecendo a isoforma BCL-XS e ativação das caspases, aumentando os níveis da proteína BCL-XS e conduzindo as células à apoptose. Utilizando um modelo in vivo, cinco injeções intra-tumorais do INXS durante 15 dias causaram uma regressão acentuada no volume dos xenotumores. Portanto, INXS é um lncRNA que induz a apoptose, sugerindo que essa molécula seja um possível alvo a ser explorado na terapia contra o câncer. / BCL-X mRNA alternative splicing generates pro-apoptotic BCL-XS or anti-apoptotic BCL-XL, whose balance regulates cell homeostasis. However, the mechanism that regulates the splice shifting is incompletely understood. Here, we identified and characterized a long noncoding RNA (lncRNA) named INXS, transcribed from the opposite genomic strand of BCL-X, that was less abundant in tumor cell lines and patient tumor tissues compared with non-tumors. INXS is an unspliced 1903 nt-long RNA, is transcribed by RNA Polymerase II, 5\'-capped, nuclear enriched and binds Sam68 splicing-modulator. The treatment of tumor cell line 786-O with each of three apoptosis-inducing agents increased endogenous INXS lncRNA, increased BCL-XS / BCL-XL mRNA ratio, and activated caspases 3, 7 and 9. These effects were abrogated in the presence of INXS knockdown. Similarly, ectopic INXS overexpression caused a shift in splicing towards BCL-XS and activation of caspases, increasing the levels of BCL-XS protein and then leading the cells to apoptosis. In a mouse xenograft model, five intra-tumor injections of INXS along 15 days caused a marked regression in tumor volume. INXS is an lncRNA that induces apoptosis, suggesting that INXS is a possible target to be explored in cancer therapies.
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Análise funcional de eventos de Splicing alternativo / Functional analysis of alternative Splicing eventsCoelho, Vitor Lima 31 March 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-03-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Splicing Alternativo (SA) é um mecanismo pós-transcricional que produz mais de um produto de gene, através da combinação de diferente éxons do lócus genômico, gerando grande parcela da variedade do proteoma dos eucariotos. Ao longo da última década, como seu papel regulatório tornou-se mais e mais evidente, SA tornou-se um fator chave para criação de complexidade de diferentes organismos dado um repertório constante de genes através das gerações. Através da inserção, exclusão ou substituição de partes da sequência do transcrito, SA pode obviamente também ter um impacto nos domínios funcionais de proteínas. Apesar de algumas tentativas que tem sido principalmente prejudicadas por questões técnicas causada pela redundância nas sequências transcritos alternativos, os efeitos em larga escala do SA em nível funcional tem sido pouco estudados até os dias de hoje.
Este projeto descreve o desenvolvimento de uma ferramenta computacional chamada ASTAFUNK - Alternative Splicing Trancriptional Analyses with FUNctional Knowledge - um programa stand-alone automatizado e eficiente para estudar como a diversidade de determinado transcriptoma é traduzido em variação funcional, baseado em um padrão de anotação de transcriptomas (em GTF, Gene Transfer Format) e perfis de domínios (no formato do Pfam). Resumidamente, ASTAFUNK traduz as regiões que sofreram splicing alternativo de open read frames em sequências de aminoácidos, que subsequentemente são alinhadas com o profile Hidden Markov Model da base de dados do Pfam, empregando programação dinâmica padrão (algoritmo de Viterbi) com alguns refinamentos técnicos (isto é, abordagem branch-and-bound). Em contraste com ferramentas convencionais de predição de domínios (por exemplo, HMMER), o algoritmo de ASTAFUNK foi projetado para evitar escaneamentos redundantes de sequências em transcriptomas com alto grau de SA. Neste trabalho, aspectos teóricos e práticos da abordagem do ASTAFUNK são avaliados, e a eficiente implementação em JAVA é disponível livremente na internet sob BSD 3-clause open source license. / Alternative splicing (AS) is a mechanism that produces more than one gene product at the transcriptional level, by combining different exons of a gene, generating a major part of the proteome diversity in eukaryotes. Over the last decade, as the regulatory role of splicing has become more and more evident, AS turned a key factor in creating different organism complexity given a rather constant repertoire of genes across generations. By inserting, deleting or substituting part of the transcript sequence, AS can obviously also have an impact on functional protein domains. Despite some attempts that have mainly been hampered by technical issues caused by the redundancy in alternative transcript sequences, the large-scale effects of AS on the functional level has been poorly studied so far.
This project describes the development of a computational tool called ASTAFUNK - Alternative Splicing Trancriptional Analyses with FUNctional Knowledge - an automated and efficient stand-alone program to study how diversity of a custom transcriptome translates into functional variation, based on standard transcriptome annotations (in GTF, Gene Transfer Format) and domain profiles (in Pfam format). In a nutshell, \afunk{} translates the alternatively spliced parts of open reading frames on the fly into amino acid sequences, which subsequently are aligned with the profile Hidden Markov Models from Pfam employing standard dynamic programming (Viterbi's algorithm) with some technical refinements (i.e., a branch-and-bound approach). In contrast to conventional domain prediction tools (e.g., the HMMER aligner), the ASTAFUNK algorithm has been designed to avoid redundant sequence scans in AS-enriched transcriptomes. In this work, theoretical and practical aspects of the ASTAFUNK approach are evaluated, and the efficient JAVA implementation is made freely available over the internet under the BSD 3-clause open source license.
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Identificação e análise de expressão de RNAs intrônicos não codificadores humanos / Identification and expression analysis of human intronic noncoding RNAsNakaya, Helder Takashi Imoto 09 March 2007 (has links)
Neste trabalho, nós mostramos estudos em larga-escala de RNAs não codificadores antisenso que são transcritos em regiões intrônicas de genes humanos. Alguns destes transcritos intrônicos possuem níveis de expressão correlacionados ao grau de diferenciação tumoral de câncer de próstata, apontando para uma relevância biológica destas mensagens em doenças complexas como o câncer. Nós também avaliamos a existência de um mecanismo comum de regulação de transcrição, compartilhado por mRNAs codificadores de proteína e RNAs intrônicos, através de análises de perfis de expressão de uma linhagem tumoral de próstata estimulada por andrógeno. A análise de ESTs e mRNAs depositados em bancos públicos de seqüências revelou mais de 55 mil RNAs Totalmente Intrônicos Não-codificadores (TIN), transcritos dos íntrons de 74% de todos os genes RefSeq únicos. Guiados por esta informação, nós desenhamos uma plataforma de oligonucleotídeos contendo sondas senso e antisenso para cada um de 7.520 transcritos TIN selecionados aleatoriamente, além de sondas para os genes codificadores de proteína correspondentes. Nós identificamos assinaturas intrônicas e exônicas de expressão tecido-específicas em fígado, próstata e rim. Os RNAs TIN antisenso mais altamente expressos eram transcritos de íntrons de genes codificadores de proteína enriquecidos na categoria ?Regulação da transcrição?. A inibição da RNA Polimerase II resultou num aumento de expressão de uma fração dos RNAs intrônicos em células em cultura, sugerindo que outras RNA Polimerases possam estar envolvidas em sua biossíntese. Um subconjunto das assinaturas intrônicas e exônicas localizadas nos mesmos loci genômicos possuíram padrões de expressão correlacionados, sugerindo que RNAs intrônicos regulem a abundância ou o padrão de uso de éxons de mensagens codificadoras de proteína. Nós identificamos diversos padrões de expressão de RNAs intrônicos, indicando que eles possam ter papéis regulatórios. Esta estratégia orientada pelo gene, que combina um microarray intrônico/exônico deve permitir análises comparativas futuras de transcrição intrônica sob várias condições fisiológicas e patológicas, avançando assim em nosso conhecimento sobre as funções biológicas destes RNAs não codificadores. / In this work, we show large-scale studies of antisense noncoding RNAs transcribed from intronic regions of human genes. The correlation of expression levels of some intronic transcripts to the degree of tumor differentiation in prostate cancer points to the biological relevance of these messages in complex diseases such as cancer. We also evaluated the existence of a common mechanism of regulation of transcription shared by protein-coding mRNAs and intronic RNAs by measuring the effect of androgen on the transcriptional profile of a prostate cancer cell line. Survey of mRNA and EST public databases revealed more than 55,000 Totally Intronic Noncoding (TIN) RNAs transcribed from the introns of 74% of all unique RefSeq genes. Guided by this information, we designed an oligoarray platform containing sense and antisense probes for each of 7,520 randomly-selected TIN transcripts plus probes for the corresponding protein-coding genes. We identified exonic and intronic tissue-specific expression signatures for human liver, prostate and kidney. The most highly expressed antisense TIN RNAs were transcribed from introns of proteincoding genes enriched in the \"Regulation of transcription\" class. RNA Polymerase II inhibition resulted in increased expression of a fraction of the intronic RNAs in cell cultures, suggesting that other RNA polymerases may be involved in their biosynthesis. A subset of intronic and protein-coding signatures transcribed from the same genomic loci has correlated expression patterns, suggesting that intronic RNAs regulate the abundance or the pattern of exon usage in protein-coding messages. We have identified diverse intronic RNA expression patterns, indicating that they may have regulatory roles. This gene-oriented approach, using a combined intronic/exonic microarray should permit further comparative analysis of intronic transcription under various physiological and pathological conditions, thus advancing current knowledge about the biological functions of these noncoding RNAs.
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