A trealase solúvel foi purificada a partir do intestino de S. frugiperda. Os pKas dos grupos catalíticos determinados por inativação química são similares aos pKas determinados por analise cinética, indicando que a enzima tem um grupo carboxila que atua como um nucleófilo e um grupo guanidina que atua como doador de prótons. Dietil pirocarbonato não afeta a enzima, exceto na presença de MalfaGlu (inibidor competitivo). A modificação com DPC diminui a atividade enzimática da trealase e muda o valor do pKa do resíduo de Arg, indicando que o resíduo de His modula o pKa do doador de prótons. Trealase tem dois subsítios para a ligação de glicose e baseado na proteção por MalfaGlu durante a modificação química é possível inferir que o subsítio que liga MalfaGlu contém o grupo carboxila, e o outro subsítio possui o resíduo de Arg que atua como grupo catalítico e o resíduo de His. Usando diferentes estratégias nós obtivemos uma seqüência parcial do cDNA que aparentemente codifica para trealase (denominada trealase 1) e clonamos e expressamos a enzima denominada trealase 2. A trealase 2 foi expressa em Bl21 DE3 e purificada, sendo que suas propriedades são similares a enzima solúvel. O cDNA da trealase 1 provavelmente codifica para a trealase de membrana encontrada no intestino de S. frugiperda. A trealase 2 tem 587 aminoácidos, um pepitideo sinal com 23 aminoácidos e seis possíveis sítios para glicosilação. A enzima apresenta alta identidade e similaridade (61% e 76%, respectivamente) com a trealase digestiva de B. mori. Foi determinada a atividade de trealase presente na carcaça, Túbulos de Malpighi, corpo gorduroso, intestino e hemolinfa de Tenebrio molitor, Musca domestica, Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis na presença e na ausência de ß-glicosideos tóxicos produzidos por plantas. Os glicosídeos usados foram amigdalina, prunasina, florizina e o aglicone mandelonitrila. E a atividade das trealases de T. molitor e S. frugiperda foi determinada também na presença de esculina. Prunasina é o melhor inibidor das trealases de T. molitor, já para as trealases (ligadas a membrana) de D. saccharalis o melhor inibidor é florizina e esculina é o melhor inibidor das trealases de S. frugiperda. Nós alimentamos S. frugiperda com uma dieta contendo 0,1% de esculina e sua presença nós tecidos foi detectada por fluorescência. Esculina foi encontrada no corpo gorduroso, Túbulos de Malpighi e hemolinfa e não foi encontrada na carcaça. A maior quantidade de esculina foi registrada na hemolinfa (0,2 mM) e as larvas alimentadas com uma dieta contendo esculina são 40% menor que as larvas alimentadas numa dieta controle. A inibição das trealases pode ser um dos fatores que leva a diminuição de peso das larvas experimentais. As larvas de S. frugiperda criadas numa dieta com 0,1% de amigdalina apresenta em alguns tecidos um aumento na atividade especifica de trealase o que não é observado quando as larvas são alimentadas com uma dieta com 0,1% de esculina. O aumento na atividade especifica de trealase pode ser uma das razões pela qual o desenvolvimento de S. frugiperda não é afetado pela amigdalina presente na dieta. / A soluble trehalase was purified from Spodoptera frugiperda midgut. The pKas of the catalitical groups determined by chemical inactivation agrees with the ones determined by kinetical analysis, indicating that the enzyme has a carboxyl group that acts as a nucleophile and a guanidine group that is the proton donor. Diethyl pyrocarbonate (DPC) does not affect to the enzyme, except in the presence of MalphaGlu (a competitive inhibitor). DPC modification decreases trehalase activity and changes the pKa value of the catalytical Arg residue, indicating that pKa of the proton donor His residue modulates. Trehalase has two subsites for glucose binding and based on the protection by MalphaGlu against chemical modification it is possible to infer that the subsite that binds MalphaGlu contains the catalytic carboxyl, whereas the other has the catalytical Arg residue and the His residue. Using different strategies we succeeded in obtaining a partial sequence of a cDNA that apparently codes for trehalase (called trehalase 1) and in molecular cloning and expressing the enzyme named trehalase 2. Trehalase 2, expressed in Bl21 DE3 cells was purified and its properties are similar to the soluble enzyme. Trehalase 1 cDNA probably codes for a membrane-bound trehalase found in S. frugiperda midgut. Trehalase 2 has 587 amino acids, a signal peptide with 23 amino acids and six possible sites for glycosilation. The enzyme present higher identity and similarity (61% and 76%, respectively) to digestive trehalase of Bombyx mori. Trehalase from body wall, Malpighian tubules, fat body, midgut and haemolymph from Tenebrio molitor, Musca. domestica, Spodoptera frugiperda and Diatraea saccharalis were assayed with and without the presence of toxic glucosides produced by plants. The glucosides used were amygdalin, prunasin, phlorizin and the aglycone mandelonitrile. In addition, T. molitor and S. frugiperda trehalases were assayed with esculin. Prunasin is the best inhibitor in T. molitor and M. domestica, phlorizin in D. saccharalis (only membrane-bound activity) and esculin in S. frugiperda. We fed S. frugiperda with a diet containing 0.1 % esculin and followed its fate by fluorescence. Esculin is recovered from fat body, Malpighian tubules and haemolymph. No esculin was found in body wall. The majority of esculin was recovered in haemolymph (0.2 mM) and larvae fed on esculin-containing diet weigh 40 % less than control ones. Trehalase inhibition by esculin may account for at least part of the observed decrease in larval weight. S. frugiperda larvae reared in 0.1% amygdalin-containing diet present higher trehalase activities in several tissues than the larvae reared in 0.1% esculin-containing diet. Higher trehalase activity should be the reason why S. frugiperda development is affected by esculin, but is not impaired by amygdalin present in the diet.

Foram purificadas através de uma combinação de cromatografias as duas &#946;- glicosidases digestivas (Mr 47.000 e 50.000 - denominadas &#946;47 e &#946;50, respectivamente) encontradas na larva de S. frugiperda. Experimentos de competição entre substratos e modificação química mostraram que a &#946;47 possui dois sítios ativos. Um desses sítios denominado aril&$946;glicosidase apresenta um subsítio -1 que liga galactose mais eficientemente do enquanto ,que o subsítio +1 prefere pequenos grupos hidrofóbicos cíclicos. O segundo sítio, denominado celobiase, possui um subsítio -1 que prefere glicose. Já a região de ligação do aglicone apresenta 4 subsítios, que ligam glicose com afinidade decrescente à medida que afastam-se do ponto de clivagem do substrato. O cDNA que codifica a &#946;50 foi clonado e sequenciado. Alinhamentos de sequência de aminoácidos, experimentos de competição entre substratos e inibição mostraram que esta enzima possui apenas um sítio ativo. O subsítio -1, cuja especificidade é controlada por uma rede de pontes de hidrogênio, foi estudado comparando-se os parâmetros cinéticos (Kcat e KcaUKm) para a hidrólise de NP&#946;glicosídeos. A região de posicionamento do aglicone, uma fenda hidrofóbica composta de 3 subsítios, foi caracterizada utilizando-se alquil &#946;-glucosídeos e oligocelodextrinas como inibidores. O alinhamento da sequência de aminoácidos da &#946;50 com outras glicosil hidrolases sugeriu quais aminoácidos participariam da ligação do substrato e que o GlU187 (doador de prótons - pKa = 7,5) e o GIU399 (nucleófilo - pKa = 4,5) estão diretamente envolvidos na catálise. Além disso, a Arg97 e a Tyr331 participam indiretamente modulando o pKa do GIU399. r . / Two digestive &#946;-glycosidases (MW 47,000 and 50,000, named &#946;gly47 and &#946;gly50, respectively) whose are found in the S. frugiperda larvae were purified by a combination of chromatographic steps. Substrate competition experiments and chemical modification data showed that &#946;gly47 has two active sites. One of them was called aryl &#946;-glycosidase and presents a -1 subsite that prefers galactose while the +1 subsite binds small cyclic hydrophobic groups. The other active site was called cellobiase and presents 4 subsites that bind glucose residues weaker as they get far from the cleavage point. The cDNA that codes the &#946;gly50 was cloned and sequenced. Amino acid sequence alignment, substrate competition experiments and inhibitions proved that this enzyme has just one active site. The -1 subsite specificity is controlled by a hydrogen bond network as it was showed comparing the kinetic parameters (Kcat and KcatlKm) for some NP&#946;glycosides hydrolysis. The aglycone binding region, a hydrophobic cleft, was studied with alkyl &#946;-glucosides and oligocellodextrins as competitive inhibitors. Amino acid sequence alignment between the &#946;gly50 and other glycosil hydrolases showed the amino acids responsible for the substrate binding and that the GIU<SUB.187 (proton donor - pKa = 7.5) and GIU399 (nucleophile - pKa = 4.5) are directly involved in the catalysis. Beside this, Arg97 and Tyr331 participate indirectly in the catalysis, modulating the nucleophile pKa

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreaFA.pdf: 1749500 bytes, checksum: 3468acf35904221d81b3482eef39fc68 (MD5) Previous issue date: 2005-04-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / In vivo production of viral biopesticides is the major source of viral insecticides currently in the marketplace. However, this system presents limitations during production scale-up. For the Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), the insect used for replication has cannibalistic characteristics, thus production is even more difficult. Insect cells are commonly used for in vitro baculovirus production. Most of these cell lines are derived from Lepidoptera species. The Sf21 cell line is derived from Spodoptera frugiperda caterpillar ovarian tissue, and its clonal isolate Sf9 has been used for biopesticide production due to its ease of growth in suspension cultures. In this work, the in vitro production capabilities of a Brazilian SfMNPV isolate obtained from cornfields was evaluated. Comparison of polyhedra production was carried out using both Sf21 and Sf9 cells, based on volumetric and specific yields. Both cell lines were cultivated in Hyclone medium supplemented with different fetal bovine serum concentrations (2,5 and 5%). The best results were obtained using Sf9 cells supplemented with 5% serum. These results were further confirmed quantitively through kinetic parameter estimation for both cells lines and different serum concentrations. After seven successive passages, this system still presented high specific polyhedra production / A produ??o in vivo de biopesticidas virais ? a maior fonte destes inseticidas presentes no mercado atualmente. Entretanto, o sistema in vivo apresenta limita??o em rela??o ao escalonamento de produ??o. No caso do v?rus Spodoptera frugiperda nucleopoliedrovirus (SfMNPV), o inseto usado para sua multiplica??o tem caracter?sticas canibais, o que dificulta ainda mais a sua produ??o in vivo. As c?lulas de inseto s?o comumente utilizadas para produ??o in vitro de baculov?rus. V?rias linhagens destas c?lulas s?o derivadas principalmente da esp?cie Lepidoptera. A linhagem Sf21 ? derivada do tecido ovariano da lagarta Spodoptera frugiperda e um clone isolado da linhagem original, denominado Sf9, tem sido utilizado para produ??o de biopesticidas, por apresentar f?cil crescimento em cultivo em suspens?o. Neste trabalho, foi testada a viabilidade de produ??o in vitro de um isolado viral brasileiro de SfMNPV obtido em lavouras de milho. A produ??o de poliedros, em c?lulas Sf21 e Sf9, foi determinada com base na avalia??o comparativa da produtividade volum?trica e espec?fica destes poliedros. Ambas as linhagens celulares foram cultivadas, em suspens?o, em meio HyClone suplementado com diferentes concentra??es de soro fetal bovino (2,5 e 5%). A c?lula Sf9 suplementada com 5% de soro apresentou os melhores resultados de produ??o. Os resultados foram confirmados quantitativamente atrav?s dos par?metros cin?ticos estimados para as duas linhagens e diferentes concentra??es de soro. O sistema demonstrou, ap?s sete passagens sucessivas, uma alta produ??o espec?fica de poliedros

Foram purificadas através de uma combinação de cromatografias as duas &#946;- glicosidases digestivas (Mr 47.000 e 50.000 - denominadas &#946;47 e &#946;50, respectivamente) encontradas na larva de S. frugiperda. Experimentos de competição entre substratos e modificação química mostraram que a &#946;47 possui dois sítios ativos. Um desses sítios denominado aril&$946;glicosidase apresenta um subsítio -1 que liga galactose mais eficientemente do enquanto ,que o subsítio +1 prefere pequenos grupos hidrofóbicos cíclicos. O segundo sítio, denominado celobiase, possui um subsítio -1 que prefere glicose. Já a região de ligação do aglicone apresenta 4 subsítios, que ligam glicose com afinidade decrescente à medida que afastam-se do ponto de clivagem do substrato. O cDNA que codifica a &#946;50 foi clonado e sequenciado. Alinhamentos de sequência de aminoácidos, experimentos de competição entre substratos e inibição mostraram que esta enzima possui apenas um sítio ativo. O subsítio -1, cuja especificidade é controlada por uma rede de pontes de hidrogênio, foi estudado comparando-se os parâmetros cinéticos (Kcat e KcaUKm) para a hidrólise de NP&#946;glicosídeos. A região de posicionamento do aglicone, uma fenda hidrofóbica composta de 3 subsítios, foi caracterizada utilizando-se alquil &#946;-glucosídeos e oligocelodextrinas como inibidores. O alinhamento da sequência de aminoácidos da &#946;50 com outras glicosil hidrolases sugeriu quais aminoácidos participariam da ligação do substrato e que o GlU187 (doador de prótons - pKa = 7,5) e o GIU399 (nucleófilo - pKa = 4,5) estão diretamente envolvidos na catálise. Além disso, a Arg97 e a Tyr331 participam indiretamente modulando o pKa do GIU399. r . / Two digestive &#946;-glycosidases (MW 47,000 and 50,000, named &#946;gly47 and &#946;gly50, respectively) whose are found in the S. frugiperda larvae were purified by a combination of chromatographic steps. Substrate competition experiments and chemical modification data showed that &#946;gly47 has two active sites. One of them was called aryl &#946;-glycosidase and presents a -1 subsite that prefers galactose while the +1 subsite binds small cyclic hydrophobic groups. The other active site was called cellobiase and presents 4 subsites that bind glucose residues weaker as they get far from the cleavage point. The cDNA that codes the &#946;gly50 was cloned and sequenced. Amino acid sequence alignment, substrate competition experiments and inhibitions proved that this enzyme has just one active site. The -1 subsite specificity is controlled by a hydrogen bond network as it was showed comparing the kinetic parameters (Kcat and KcatlKm) for some NP&#946;glycosides hydrolysis. The aglycone binding region, a hydrophobic cleft, was studied with alkyl &#946;-glucosides and oligocellodextrins as competitive inhibitors. Amino acid sequence alignment between the &#946;gly50 and other glycosil hydrolases showed the amino acids responsible for the substrate binding and that the GIU<SUB.187 (proton donor - pKa = 7.5) and GIU399 (nucleophile - pKa = 4.5) are directly involved in the catalysis. Beside this, Arg97 and Tyr331 participate indirectly in the catalysis, modulating the nucleophile pKa

A trealase solúvel foi purificada a partir do intestino de S. frugiperda. Os pKas dos grupos catalíticos determinados por inativação química são similares aos pKas determinados por analise cinética, indicando que a enzima tem um grupo carboxila que atua como um nucleófilo e um grupo guanidina que atua como doador de prótons. Dietil pirocarbonato não afeta a enzima, exceto na presença de MalfaGlu (inibidor competitivo). A modificação com DPC diminui a atividade enzimática da trealase e muda o valor do pKa do resíduo de Arg, indicando que o resíduo de His modula o pKa do doador de prótons. Trealase tem dois subsítios para a ligação de glicose e baseado na proteção por MalfaGlu durante a modificação química é possível inferir que o subsítio que liga MalfaGlu contém o grupo carboxila, e o outro subsítio possui o resíduo de Arg que atua como grupo catalítico e o resíduo de His. Usando diferentes estratégias nós obtivemos uma seqüência parcial do cDNA que aparentemente codifica para trealase (denominada trealase 1) e clonamos e expressamos a enzima denominada trealase 2. A trealase 2 foi expressa em Bl21 DE3 e purificada, sendo que suas propriedades são similares a enzima solúvel. O cDNA da trealase 1 provavelmente codifica para a trealase de membrana encontrada no intestino de S. frugiperda. A trealase 2 tem 587 aminoácidos, um pepitideo sinal com 23 aminoácidos e seis possíveis sítios para glicosilação. A enzima apresenta alta identidade e similaridade (61% e 76%, respectivamente) com a trealase digestiva de B. mori. Foi determinada a atividade de trealase presente na carcaça, Túbulos de Malpighi, corpo gorduroso, intestino e hemolinfa de Tenebrio molitor, Musca domestica, Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis na presença e na ausência de ß-glicosideos tóxicos produzidos por plantas. Os glicosídeos usados foram amigdalina, prunasina, florizina e o aglicone mandelonitrila. E a atividade das trealases de T. molitor e S. frugiperda foi determinada também na presença de esculina. Prunasina é o melhor inibidor das trealases de T. molitor, já para as trealases (ligadas a membrana) de D. saccharalis o melhor inibidor é florizina e esculina é o melhor inibidor das trealases de S. frugiperda. Nós alimentamos S. frugiperda com uma dieta contendo 0,1% de esculina e sua presença nós tecidos foi detectada por fluorescência. Esculina foi encontrada no corpo gorduroso, Túbulos de Malpighi e hemolinfa e não foi encontrada na carcaça. A maior quantidade de esculina foi registrada na hemolinfa (0,2 mM) e as larvas alimentadas com uma dieta contendo esculina são 40% menor que as larvas alimentadas numa dieta controle. A inibição das trealases pode ser um dos fatores que leva a diminuição de peso das larvas experimentais. As larvas de S. frugiperda criadas numa dieta com 0,1% de amigdalina apresenta em alguns tecidos um aumento na atividade especifica de trealase o que não é observado quando as larvas são alimentadas com uma dieta com 0,1% de esculina. O aumento na atividade especifica de trealase pode ser uma das razões pela qual o desenvolvimento de S. frugiperda não é afetado pela amigdalina presente na dieta. / A soluble trehalase was purified from Spodoptera frugiperda midgut. The pKas of the catalitical groups determined by chemical inactivation agrees with the ones determined by kinetical analysis, indicating that the enzyme has a carboxyl group that acts as a nucleophile and a guanidine group that is the proton donor. Diethyl pyrocarbonate (DPC) does not affect to the enzyme, except in the presence of MalphaGlu (a competitive inhibitor). DPC modification decreases trehalase activity and changes the pKa value of the catalytical Arg residue, indicating that pKa of the proton donor His residue modulates. Trehalase has two subsites for glucose binding and based on the protection by MalphaGlu against chemical modification it is possible to infer that the subsite that binds MalphaGlu contains the catalytic carboxyl, whereas the other has the catalytical Arg residue and the His residue. Using different strategies we succeeded in obtaining a partial sequence of a cDNA that apparently codes for trehalase (called trehalase 1) and in molecular cloning and expressing the enzyme named trehalase 2. Trehalase 2, expressed in Bl21 DE3 cells was purified and its properties are similar to the soluble enzyme. Trehalase 1 cDNA probably codes for a membrane-bound trehalase found in S. frugiperda midgut. Trehalase 2 has 587 amino acids, a signal peptide with 23 amino acids and six possible sites for glycosilation. The enzyme present higher identity and similarity (61% and 76%, respectively) to digestive trehalase of Bombyx mori. Trehalase from body wall, Malpighian tubules, fat body, midgut and haemolymph from Tenebrio molitor, Musca. domestica, Spodoptera frugiperda and Diatraea saccharalis were assayed with and without the presence of toxic glucosides produced by plants. The glucosides used were amygdalin, prunasin, phlorizin and the aglycone mandelonitrile. In addition, T. molitor and S. frugiperda trehalases were assayed with esculin. Prunasin is the best inhibitor in T. molitor and M. domestica, phlorizin in D. saccharalis (only membrane-bound activity) and esculin in S. frugiperda. We fed S. frugiperda with a diet containing 0.1 % esculin and followed its fate by fluorescence. Esculin is recovered from fat body, Malpighian tubules and haemolymph. No esculin was found in body wall. The majority of esculin was recovered in haemolymph (0.2 mM) and larvae fed on esculin-containing diet weigh 40 % less than control ones. Trehalase inhibition by esculin may account for at least part of the observed decrease in larval weight. S. frugiperda larvae reared in 0.1% amygdalin-containing diet present higher trehalase activities in several tissues than the larvae reared in 0.1% esculin-containing diet. Higher trehalase activity should be the reason why S. frugiperda development is affected by esculin, but is not impaired by amygdalin present in the diet.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-05-03T16:48:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2414521 bytes, checksum: 990455815ae1d3a4e482fc45c44ce722 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T16:48:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2414521 bytes, checksum: 990455815ae1d3a4e482fc45c44ce722 (MD5) Previous issue date: 2002-09-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Este trabalho objetivou otimizar a criação, em laboratório, de Campoletis flavicincta (Ashmead) (Hymenoptera: Ichneumonidae), endoparasitóide solitário de larvas de Spodoptera frugiperda (Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) na cultura do milho (Zea mays) e avaliar, em laboratório e no campo, o potencial desse inimigo natural no controle dessa praga do milho. Os estudos de laboratório foram desenvolvidos em gaiola de criação (recipiente de vidro de 12 cm diâm. x 17 cm alt.) no Laboratório de Criação de Insetos do Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo (CNPMS - EMBRAPA). No primeiro estudo, testou-se o início da oferta das larvas de S. frugiperda (tratamentos) após um, dois, três, quatro ou cinco dias da emergência de fêmeas de C. flavicincta. O número de larvas parasitadas e a produção de machos desse parasitóide foram semelhantes entre os tratamentos, mas o início da oferta de larvas do hospedeiro no terceiro ou no quarto dias após a emergência deste ichneumonídeo proporcionou maior produção de fêmeas do parasitóide e, por isso, são idades recomendadas para o início do fornecimento dessas larvas. No segundo estudo, foram avaliadas o efeito da densidade de C. flavicincta em características reprodutivas e a ocorrência de interferência mútua. Um, dois, três, quatro ou cinco casais do parasitóide, acondicionados em gaiolas de criação, receberam diariamente, do quinto ao décimo primeiro dia após a emergência, 48 larvas de S. frugiperda por gaiola. A densidade de cinco casais por gaiola apresentou maiores produção de fêmeas, razão sexual e taxa de parasitismo. Constatou-se interferência mútua para esse inimigo natural, a qual é citada, na literatura, como benéfica ao controle biológico. No terceiro estudo, foram determinadas as respostas funcional e numérica de C. flavicincta, acondicionando-se um casal desse agente de controle biológico em gaiola, com fornecimento de 10, 20, 30, 40 ou 50 larvas de S. frugiperda, trocadas diariamente. A resposta funcional foi do tipo III e a numérica (produção de descendentes em função da densidade do hospedeiro), crescente. Em outro estudo, foi introduzida uma fêmea do ichneumonídeo e 5, 10, 15 ou 20 larvas do lepidóptero por gaiola telada (35 cm de altura x 21 cm de diâmetro), sobre um vaso com planta de milho em casa-de-vegetação, durante 24 h. As respostas funcional e numérica apresentaram tendências semelhantes às do estudo em laboratório (tipo III e crescente, respectivamente). A ocorrência de interferência mútua, a resposta funcional do tipo III e a resposta numérica crescente, com a densidade do hospedeiro, indicam o potencial desse inimigo natural para o controle de S. frugiperda. O último estudo foi desenvolvido também no CNPMS – EMBRAPA, em gaiola (5 x 4 x 2 m) no campo com plantas de milho (25% dessas infestadas com S. frugiperda) e liberação de 0 (controle), 15 ou 30 casais de C. flavicincta por gaiola. A liberação desse agente de controle biológico reduziu o número de larvas de S. frugiperda nas plantas e, além disso, seus danos aos 21 dias após a infestação. Os resultados de campo, associados aos de laboratório, evidenciam o potencial de C. flavicincta no controle de S. frugiperda. / This research aimed to optimize laboratory rearing and to evaluate the potential of the natural enemy Campoletis flavicincta (Ashmead) (Hymenoptera: Ichneumonidae), a solitary larval endoparasitoid of Spodoptera frugiperda (Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) in corn crop (Zea mays). Laboratory studies were developed in rearing cages (glass vial with 12 cm diam. x 17 cm height) in the “Laboratório de Criação de Insetos do Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo (CNPMS - EMBRAPA)”. Beginning of supply of S. frugiperda larvae after one, two, three, four or five days of C. flavicincta emergence (treatments) was studied. Number of larvae parasitized and male production of this parasitoid were similar between treatments but beginning of host supply in the third or fourth day after emergence of C. flavicincta provided higher female production of this parasitoid and thus they can be recommended as the ideal ones to start supply of these larvae. The effect of C. flavicincta density on reproductive characteristics and occurrence of mutual interference for this parasitoid was evaluated in a second study. One, two, three, four or five pairs of this parasitoid were put in glass rearing cages and they received daily from fifth to eleventh day after emergence a total of 48 larvae of the host S. frugiperda per cage. Density of five pairs of C. flavicincta per cage showed higher female production, sex ratio and parasitism rate. This natural enemy showed mutual interference which is related in the literature as beneficial for biological control. Functional and numerical responses of C. flavicincta were evaluated in a third study. One pair of this parasitoid was put per glass rearing cage with 10, 20, 30, 40 or 50 S. frugiperda larvae per day and changed daily. Functional response was type III and numerical response (progeny production as function of host density) showed increasing values. In a fourth study, each C. flavicincta female were introduced with 5, 10, 15 or 20 larvae of S. frugiperda per screen cage (35 cm height x 21 cm diam.) on a vase with corn plant in greenhouse during 24 h. Functional and numerical responses showed similar tendency as of the laboratory study (type III and increasing values, respectively). Occurrence of mutual interference, type III functional response and increasing numerical response with host density indicated the potential of this natural enemy against S. frugiperda. The last study was also developed in the CNPMS – EMBRAPA in field cages (5 x 4 x 2 m) with corn plants (25% of these plants were infested with S. frugiperda). Zero (control), 15 or 30 pairs of C. flavicincta were released per cage. Release of this biological control agent reduced the number of S. frugiperda larvae on plants and their damage after 21 days of infestation with this pest. Field and laboratory results show a high potential of C. flavicincta to control S. frugiperda.

>Magister Scientiae - MSc / Insect-derived baculoviruses have been used extensively as a safe and versatile research model for transgenic protein expression. Preclinical studies have revealed the promising potential of Baculoviruses as a delivery vector for a variety of therapeutic applications, including vaccination, tissue engineering and cancer treatments. Coronaviruses are enveloped viruses containing linear, non-segmented ribonucleic acid. Human coronavirus NL63 was first discovered in the Netherlands in January 2004, where a 7-month-old girl presented with an acute respiratory tract infection that was later established to predominantly infect infants, the elderly and immunocompromised individuals. In addition to the known non-structural and structural proteins of coronaviruses, an accessory protein known as open reading frame 3 which is conserved in the Coronaviridae family has not been extensively researched. Open reading frame 3 encodes a putative membrane-bound protein. This study cloned the open reading frame 3 viral gene of 741 base pairs into the baculovirus expression construct via competent bacterial cell lines. Open reading frame 3-Baculovirus particles were generated in Spodoptera frugiperda insect cells. Recombinant cells containing the viral protein gene were used to infect healthy Spodoptera frugiperda 9 cells at varying ratios of multiplicity of infection over a fixed time-course. The open reading frame 3 viral protein was not detected by quantification methods at a molecular weight of 26 kilo Dalton, due to polyclonal antibody degradation.

Dimorphandra mollis Benth. (Fabaceae - Caesalpinioideae), popularmente conhecida como faveiro, fava d\'anta ou faveleiro, é uma espécie nativa do Cerrado brasileiro, que apresenta registros de ocorrência por todo o Brasil Central. Sua principal importância econômica está associada às elevadas concentrações de rutina, um flavonóide alvo de muitos estudos farmacológicos e de largo emprego na indústria farmacêutica, sendo esta a segunda espécie mais utilizada como fonte de rutina no mercado mundial. Apesar do amplo uso econômico, sua exploração não apresenta características agrícolas, sendo realizada por vias extrativistas. Além disso, há carência de informações sobre sua biologia, o que torna a exploração um fator de risco à conservação. Há poucos estudos relacionados à sua composição química de seus órgãos e tecidos, além disso, estudos de germinação in vitro para obtenção de calos, suspensões celulares e clones não apresentaram sucesso. Este trabalho teve por objetivo desenvolver uma detalhada investigação da composição flavonoídica de folhas, flores, frutos, madeira, cascas, plântulas, embriões, exsudados radiculares de plântulas, e calos originados da desdiferenciação de diversos explantes pelo emprego da técnica de cromatografia de alta eficiência com detector de arranjo de diodos acoplado ao espectrômetro de massas, com o intuito de contribuir para uma maior compreensão da composição química de seus órgãos e tecidos, e assim, subsidiar novos estudos sobre a biossíntese de flavonoides, assim como, contribuir para a própria exploração racional dos recursos econômicos inerentes a essa espécie. Os resultados obtidos levam à conclusão de que nos diversos órgãos e tecidos de D. mollis investigados, predominam estereoisômeros de astilbina, rutina e quercitrina. Os calos apresentaram perfil flavonoídico muito simples, contendo apenas pequenas quantidades de apigenina, não sendo viáveis à obtenção de flavonoides de interesse por meio de seu cultivo. Dimorphandra mollis Benth. (Fabaceae - Caesalpinioideae), popularmente conhecida como faveiro, fava d\'anta ou faveleiro, é uma espécie nativa do Cerrado brasileiro, que apresenta registros de ocorrência por todo o Brasil Central. Sua principal importância econômica está associada às elevadas concentrações de rutina, um flavonóide alvo de muitos estudos farmacológicos e de largo emprego na indústria farmacêutica, sendo esta a segunda espécie mais utilizada como fonte de rutina no mercado mundial. Alguns artigos acadêmicos reportam a detecção de propriedades tóxicas de extratos metanólicos de D. mollis sobre operárias de Apis mellifera, e atribuem a toxicidade ao flavonóide astilbina (3-&beta;-&Omicron;/-rhamnosideo de 5,7,3&rsquo;,4&rsquo;-tetraidroxi-2,3-diidroflavonol) isolado dos pedúnculos e flores. Seus resultados indicam que a astilbina reduziu a sobrevivência média das abelhas tratadas. Também é atribuída a astilbina a atividade inibidora sobre o desenvolvimento de larvas de Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepdoptera: Noctuidae) e Spodoptera frugiperda Smith (Lepdoptara: Noctuidae), relatando redução do peso corporal durante a fase larval e, prolongamento, tanto da fase larval quanto da fase pupal, para as duas espécies de lepidópteros, consideram a possibilidade de uso deste flavonóide como um biopesticida. Neste estudo, foram testadas as interferências de extratos flavonoídicos de diversos órgãos de D. mollis sobre o forrageio e o ciclo de vida de lagartas de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) e de adultos de Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae). Nenhum resultado negativo estatisticamente significativo foi observado no forrageio das duas espécies em questão. Tal resultado pode ser devido a uma tolerância desses animais aos flavonoides majoritários encontrados nos extratos, astilbina, rutina e quercitrina, ou ainda a mecanismos de detoxificação. / Dimorphandra mollis Benth. (Fabaceae - Caesalpinioideae), popularly known as faveiro, fava d\'anta or faveleiro, is a native species of the Brazilian Cerrado, which has records of occurrence throughout the Central Brazil. Its main economic importance is associated with high concentrations of rutin, a flavonoid target of many pharmacological studies and widespread use in the pharmaceutical industry. D. mollis is the second most commonly used plant species as a source of rutin in the global market. Despite their broad economic use, their exploitation occurs in a very primitive way. In addition, there is no subsidiary information about their biology, which makes exploring this species a risk factor for its conservation. There are few studies that deals with the chemical composition of D. mollis organs and tissues, in addition, in vitro germination studies to obtain calluses, cell suspensions and clones showed no success. This work aimed to develop a detailed research flavonoid composition of leaves, flowers, fruits, wood, bark, seedlings, embryos, seedlings root exudates, callus using high performance liquid chromatography with diode array detector coupled to a mass spectrometer in order to contribute to a greater understanding of the chemical composition of their organs and tissues, and thus support new studies on flavonoid biosynthesis, as well as contribute to the very rational exploitation the financial resources inherent in this species. The principal constituents found were stereoisomers of astilbin, rutin and quercitrin. The callus culture presented a very simple flavonoid profile containing only small amounts of apigenin. Dimorphandra mollis Benth. (Fabaceae - Caesalpinioideae), popularly known as faveiro, fava d\'anta or faveleiro, is a native species of the Brazilian Cerrado, which has occurrence records throughout the Central Brazil. Its main economic importance is associated with high concentrations of rutin, a flavonoid target of many pharmacological studies and widespread use in the pharmaceutical industry, which is the second species most commonly used as a source of rutin in the world market. Some scientific papers report toxic activities of methanol extracts of D. mollis on Apis mellifera of workers, and attribute the toxicity astilbin flavonoid (3-&beta;-&Omicron;-rhamnoside of 5,7,3&rsquo;,4&rsquo;-tetraidroxi- 2,3-diidroflavonol) isolated from the stems and flowers of this species. These results suggest that astilbin reduced the mean survival of the treated bees. Also is attributed to astilbin the inhibitory activity against the development of Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepdoptera: Noctuidae) larvae and Spodoptera frugiperda Smith (Lepdoptara: Noctuidae), reporting body weight loss during the larval stage and extending both larval and pupal stage for the two Lepidopterans. These results suggests the use of astilbin as a biopesticide. In the present study, was tested the interference of the flavonoid extracts from several D. mollis parts on the foraging and life cycle of both Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) larvae and adults of Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae). No statistically significant negative result was observed in foraging of both species concerned. This result may be due to a tolerance of these species to flavonoids majorly found in D. mollis extracts, astilbin, rutin and quercitrin, or due detoxification mechanisms.

A velocidade específica de respiração (QO2) é um parâmetro fundamental para entender-se o metabolismo e o estado fisiológico celular, fornecendo informações úteis para o processo e controle em biorreatores. Neste trabalho, cultivou-se diferentes células de insetos em ambiente controlado medindo-se o QO2 e concentração crítica de oxigênio (Ccrít). Foram utilizadas nos ensaios células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) não infectadas e células de Drosophila melanogaster (S2) selvagem e recombinantes, utilizadas na expressão de diferentes proteínas. Todas as experiências foram realizadas em biorreator Inceltech com volume de trabalho de 1L, mantido a temperatura de 28ºC, agitação de 100 rpm e oxigênio dissolvido (OD) a 40% da saturação de ar, com difusão por membrana de silicone com mistura gasosa (O2 e N2) e vazão gasosa constante. Foi utilizado meio de cultura Sf900II sem soro fetal bovino. O QO2 foi medido pelo método dinâmico e pelo balanço de oxigênio na fase líquida. Neste trabalho foi implementado um novo processo durante o método dinâmico para interromper completamente a transferência gasosa durante a execução deste método. Implementou-se também uma metodologia para medição de Ccrít. Chegou-se a concentrações máximas celulares (Xm), velocidades máximas específicas de respiração (QO2) na fase exponencial e Ccrít, conforme segue: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfectadas para expressão de GPV): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfectadas para expressão de EGFP): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfectadas para expressão de HBsAg): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. Conclui-se que as linhagens selvagens e transfectadas de S2 possuem entre si uma atividade respiratória diferente e também que as novas metodologias implantadas verificaram-se satisfatoriamente. / Specific respiration rate (QO2) is a key parameter to understand cell metabolism and physiological state, providing useful information for process supervision and control. In this work, we cultivated different insect cells in a very controlled environment, being able to measure QO2 and critical oxygen concentration (Ccrit). Wild Spodoptera frugiperda (Sf9) and wild and transfected Drosophila melanogaster S2 cells (able to produce different proteins) were used. All experiments were performed in 1-liter working volume Inceltech bioreactor, maintaining temperature controlled at 28ºC, agitation rate at 100 rpm, and dissolved oxygen (DO) at 40% of air saturation, through membrane diffusion of mixed gases (O2 and N2) at constant total flow rate. SF900II serum free medium was used. QO2 was measured through dynamic method and oxygen mass balance in the liquid phase. In this work a new process was implemented during the dynamic method to interrupt completely the oxygen transfer during the execution of this method. It was also implemented a methodology for measurement of Ccrít (determined when DO reduces its decay rate, without oxygen transfer). Maximum cell concentration (Xm), maximum specific respiration rate (QO2) in the exponential phase and Ccrít were reached, as follows: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfected for GPV expression): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfected for EGFP expression): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfected for HbsAg expression): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. From these results, it can be concluded that the studied cell lines have different respiration activity and the new developed methodologies behave satisfactorily.

Dentre as substâncias químicas secretadas pelas plantas, contra os insetos herbívoros, os inibidores de peptidases são de grande interesse. A atenção dada a esses inibidores deve-se ao fato, de eles serem uma boa alternativa no controle de insetos praga, uma vez que não causam danos ao meio ambiente. Contudo, muitas espécies de insetos são capazes de escapar dos efeitos negativos dos inibidores de peptidases das plantas, via diferentes mecanismos adaptativos. Devido a esse fato, é importante compreender os mecanismos desenvolvidos pelos insetos para burlar os efeitos dos inibidores de peptidases das plantas. Diante desse panorama, este trabalho teve como objetivo estudar o mecanismo adaptativo das serina endopeptidases de Spodoptera frugiperda aos inibidores de endopeptidases de soja. Foram realizadas análises do transcriptoma dos intestinos das lagartas mantidas em exposição crônica ao inibidor. Para averiguar os efeitos causados devido à exposição crônica ao inibidor, foram realizadas comparações da expressão relativa, dos genes de tripsinas e quimotripsinas, de intestinos de lagartas de sexto instar. Contudo, para entender o efeito da exposição aguda ao inibidor, lagartas de S. frugiperda foram criadas em dieta artificial controle até o primeiro dia do sexto instar, após esse período elas foram transferidas para dieta artificial acrescida com 0,5 % dos inibidores de endopeptidases de soja, durante 48 horas. Para verificar a ocorrência de um possível controle epigenético na expressão dos genes, as lagartas foram conduzidas até a fase adulta e os adultos, de cada tratamento, foram acasalados entre si, constituindo uma segunda geração. Dados de expressão relativa foram obtidos, de indivíduos da primeira e segunda geração, e foram então comparados. Foram identificados 14 possíveis genes de quimotripsinas e nove possíveis genes de tripsinas. Os genes de tripsina foram divididos em dois grupos distintos em relação a sua sensibilidade aos inibidores de endopepetidases de soja e expressão relativa. Houve uma resposta diferenciada na ativação dos genes de serina endopeptidases de S. frugiperda, a qual dividiu os genes em dois grupos, os responsivos e os não responsivos ao inibidor. A exposição aguda ao inibidor ativou um pequeno grupo de genes, enquanto que a exposição crônica promoveu uma maior amplitude de expressão gênica, sugerindo mecanismos temporalmente regulados. Por último, evidências indicam, pela primeira vez, a possível ocorrência de um mecanismo epigenético, na resposta das enzimas digestivas aos inibidores de serina endopeptidases de soja. / Among the chemicals secreted by plants against insect herbivores, peptidase inhibitors (PIs) are of great interest. The attention given to PIs is due to the fact that they are a good alternative to control insect pests since they do not cause damage to human health and the environment. However, many species of insects are able to escape the negative effects of PIs plants via different adaptive mechanisms. Because of this, it is important to understand the mechanisms developed by insects to circumvent the effects of PIs plants. Against this background, this research aimed to study the adaptive mechanism of serine endopeptidases Spodoptera frugiperda to soybean endopeptidase inhibitors. For this purpose, larvae of S. frugiperda were reared on artificial diet and control artificial diet plus 0.5% of endopeptidase inhibitors of soybean. We conducted a transcriptome midgut of worms maintained in chronic ingestion of the inhibitor. The relative expression of the genes, trypsin and chymotrypsin, was also compared the midgut of sixth instar larvae kept in these diets. In another experiment, the larvae were conducted to moth, then the treatments were mated forming a second generation. Relative expression data were obtained for individuals of the first and second generation, and then compared. Identified 14 genes with potential of chymotrypsin and 9 trypsin like genes. The trypsin gene were divided into two groups for both their sensitivity to PI soybean endopeptidase, and for their relative expression pattern. There was a differentiated response on the genes activation of S. frugiperda serina endopeptidases. The genes were clustered in 2 groups, the responsive ones and the non responsive to the inhibitor. The acute exposition to the inhibitor activated a small group of genes and the chronic exposition affected several genes, indicating the existence of temporal regulated mechanism. Besides, there is a possible occurance of an epigenetic mechanism, which is related to the digestive serina endopeptidases inhibitors of soybean.