No / Streptococcus mutans is frequently identified on the basis of phenotypic characteristics such as the ability to ferment carbohydrates. The usefulness of some of these identification tests may be limited in the case of isolates which are atypical with regard to their fermentation properties. We previously identified isolates of S. mutans which were unable to ferment melibiose, a characteristic which is included in some typing schemes. In all of these isolates there was a large chromosomal deletion which included the multiple sugar metabolism (msm) operon which encodes several genes involved in the uptake and metabolism of a number of sugars including melibiose. In the present study, sugar fermentation tests, ribotyping, colony hybridisation with DNA probes and polymerase chain reaction (PCR) were used to investigate the relatedness of these atypical isolates. The PCR and colony hybridisation procedures were based on amplification and detection of two genes: the wapA gene which encodes a surface protein found in all S. mutans strains and the gtfA gene which lies within the msm operon. The colony hybridisation and PCR results confirmed loss of the gtfA gene in the melibiose-negative isolates. Three new melibiose-negative isolates were also identified, but in only 2 of these was the gtfA gene absent, the third did not appear to have lost this region of the chromosome. Biotyping, as well as ribotyping based on an EcoRl digest of chromosomal DNA, revealed that the melibiose-negative isolates fell into a number of distinct groups. The identification of an isolate which is unable to ferment melibiose but does not appear to have lost the msm operon indicates that the melibiose-negative phenotype can arise from more than one type of genetic event.

Les cas d'infections à Streptococcus suis sont très répandus dans tous les pays producteurs de porcs. Cet organisme est également reconnu comme un agent de zoonose pour les personnes en contact étroit avec les porcs ou leurs produits dérivés. De nombreux rapports indiquent que depuis le début des années soixante-dix, le nombre de cas d'infections ainsi que la gravité des infections à S. suis ont considérablement augmenté. Un temps d'incubation plus court, une progression plus rapide de la maladie, un taux plus élevé de mortalité soulignent la nécessité urgente de mieux comprendre les facteurs associés à la pathogenèse de l'infection par S. suis. Des 35 serotypes décrits, le serotype 2 demeure le plus fréquemment associé à un phénomène de septicémie et à des cas de maladies telles que les méningites, endocardites et pneumonies. C'est également le serotype le plus souvent retrouvé chez l'humain et le porc. La pathogenèse de l'infection causée par S. suis est encore relativement mal connue. La présence d'une capsule riche en acide sialique est classiquement considérée comme un facteur de virulence essentiel, mais récemment d'autres facteurs ont également été cités. Cette étude avait pour but d'identifier et de caractériser de nouveaux déterminants de virulence chez S. suis. Dans un premier temps, la capacité de S. suis à former un biofilm a été étudiée. Il a été démontré que la présence de fibrinogène pouvait induire la formation d'un biofilm chez S. suis. Un mutant déficient pour l'expression de la capsule de même que des souches non-sérotypables de S. suis dépourvues de capsule ont montré une capacité de former un biofilm sans apport de fibrinogène. Il a été suggéré que la capsule chez S. suis pourait cacher des adhésines de surface et ainsi interférer avec la formation du biofilm et les capacités d'adhésion. Dans un second temps, l'utilisation d'un mutant de S. suis déficient pour une pseudo-subtilisine a permis de démontrer le rôle critique de cette protease pour le développement d'une infection dans un modèle de souris. La pseudo-subtilisine de S. suis a été clonée, purifiée et caractérisée. Certaines protéines de l'hôte comme le fibrinogène se sont révélées susceptibles à la protease. Une stimulation de macrophages par la pseudo-subtilisine recombinante a induit à une forte sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Lors d'infections expérimentales à S. suis chez le porc, les animaux ont développé des anticorps dirigés contre la pseudo-subtilisine, suggérant ainsi que cette protease représente un immunogène d'intérêt pour la vaccination. Enfin, un nouveau modèle pour l'analyse de la virulence de S. suis a été mis au point utilisant l'amibe Dictyostelium discoideum. Ce modèle a mis en évidence des différences majeures entre des souches sauvages virulentes de S. suis et des mutants ayant une virulence atténuée dans des modèles animaux classiques. En conclusion, ce projet a permis d'améliorer nos connaissances des mécanismes étiopathogéniques des infections à S. suis et a ouvert de nouvelles perspectives de prévention et traitement de ces infections.

Afin de comprendre la biogénèse et l'assemblage des fimbriae de Streptococcus salivarius, les gènes inactivés de deux mutants ayant une production réduite de fimbriae ont été analysés. Chez le mutant C34, le transposon est inséré entre les gènes cysD et ssaO988, codant respectivement pour une O-acetylhomosérine sulfhydrylase et une hydrolase des haloacides déhalogénases. Les analyses de la transcription ont montré que les transcrits ne sont pas perturbés. Chez le mutant DU, le transposon est inséré dans le gène dagA codant pour une D-alanine/glycine/Na perméase et les analyses de la transcription ont montré l'absence du transcrit. La complémentation en trans a été effectuée, mais la méthode d'immunoempreinte n'a pas permis de détecter le retour à une expression normale de fimbriae. L'absence du transporteur de la D-alanine, stéréoisomère retrouvé exclusivement dans la paroi, pourrait perturber l'ancrage des fimbriae par une modification de la composition et/ou de la stabilité de la paroi bactérienne.

Streptococcus thermophilus {St) est une bactérie utilisée pour la transformation du lait en yogourts et en fromages. Le lactose constitue sa principale source d'énergie. Cette espèce bactérienne est incapable de croître sur galactose et rejette, au cours d'une croissance sur milieu lactose, la partie galactose du lactose malgré le fait qu'elle possède les gènes codant pour les en2ymes du métabolisme du galactose. Ce travail visait à éclairer le rôle de GalM, une mutarotase, dans le phénomène du rejet de galactose par St. Le gène galM de Streptococcus salivarius a été introduit dans quatre souches de St. L'expression du gène galM chez les transformants a été confirmée par des expériences de type Western et Northern. Les résultats indiquent qu'une augmentation de GalM chez les souches Gal+ cause un rejet moins important de galactose.

Les progrès technologiques dans l'industrie de la viande ont des répercussions considérables sur les agents pathogènes de ces environnements. Parmi ceux-ci, Streptococcus suis occupe une place prédominante dans l’industrie porcine. En effet, S. suis, colonisateur naturel des voies respiratoires et digestives du porc, peut infecter son hôte en provoquant des méningites, septicémies, endocardites, arthrites ou pneumonies. De surcroît, S. suis peut également infecter l’humain en provoquant majoritairement des méningites et septicémies, et a notamment été la cause de deux épidémies en Chine en 1998 et 2005. La pathogenèse des infections à S. suis demeure partiellement connue à l’heure actuelle, rendant difficile le contrôle des infections. Il est par conséquent essentiel de caractériser les facteurs de virulence chez S. suis puisqu'ils pourraient représenter des cibles d’intérêt pour des applications préventives ou thérapeutiques. Ce projet de doctorat consiste donc en la caractérisation fonctionnelle de facteurs de virulence chez S. suis. Dans un premier temps, la capacité de S. suis à moduler son potentiel pro-inflammatoire en présence de concentrations sous-inhibitrices d'amoxicilline a été mise en évidence. Dans un second temps, la caractérisation plus avancée de la hyaluronate lyase de S. suis a permis de démontrer que son activité ne contribue pas à la virulence de la bactérie étant donné son absence au sein de souches les plus virulentes, mais que les interactions avec l'acide hyaluronique pourraient moduler la virulence de S. suis. Par la suite, l'étude fonctionnelle d’une DNase de S. suis a permis de démontrer son implication comme facteur de virulence et suggère son intérêt dans le développement de vaccins. Finalement, le dernier objectif du projet a permis la mise en évidence de la production de microvésicules fortement immunogéniques par S. suis. La présence de facteurs de virulence dans leur contenu protéique représente un élément encourageant dans le développement de vaccins contre l'agent pathogène. Ce projet a donc permis d'élargir les connaissances sur le potentiel néfaste de l'utilisation des antibiotiques à faible concentration dans l'industrie porcine, sur le rôle des activités hyaluronate lyase et DNase dans la virulence de S. suis, et de découvrir un nouveau mécanisme impliqué dans la virulence de la bactérie par le biais des microvésicules. / Technological progress in the meat industry has a substantial impact on pathogens within these environments. Among these pathogens, Streptococcus suis is of utmost importance in the swine industry. S. suis, natural colonizer of the respiratory and digestive tracts of porks, can infect its host causing mainly meningitis and septicemia as well as endocarditis, arthritis and pneumonia. Furthermore, S. suis can infect humans causing mainly meningitis and septicemia, and was the cause of two major outbreaks in China in 1998 and 2005. The pathogenesis of S. suis infections remains partially understood, making the control of infections challenging. Consequently, it is of utmost importance to characterize virulence factors that could represent targets of interest for preventive or therapeutic applications. This project focused on the functional charaterization of virulence factors produced by S. suis. First, the ability of S. suis to modulate its pro-inflammatory potential in the presence of sub-inhibitory concentrations of amoxicillin was demonstrated. Then, a further characterization of S. suis hyaluronate lyase brought evidence that this activity does not contribute to the bacterium's virulence since it is absent in most virulent strains. However, interactions with hyaluronic acid could modulate S. suis virulence. The functional study of S. suis DNase showed its implication as a virulence factor and suggested its interest in vaccine development. Finally, the last objective of this project lead to the discovery of the production of highly immunogenic microvesicles by S. suis. The presence of major virulence factors associated with these structures also represents an exciting fact for the development of vaccines against S. suis. This project allowed to expand the knowledge on the noxious potential of the use of low concentrations of antibiotics in the swine industry, on the role of hyaluronate lyase and DNase activities in S. suis virulence as well as on the production of microvesicles by S. suis that represents a new virulence mechanism.

Le phénomène croissant d'acquisition de résistances aux antibiotiques par les bactéries demeure une des préoccupations majeures de santé publique. Notre laboratoire s'investit dans le développement de nouveaux moyens envisagés pour freiner cette résistance, par l'étude des mutacines. Ces mutacines sont des peptides antimicrobiens de la famille des bactériocines démontrant une activité inhibitrice sur un certain nombre de bactéries pathogènes résistantes aux antibiotiques conventionnels. Les objectifs de ma maîtrise étaient de produire en milieu liquide, purifier et caractériser les mutacines D-123.1, P-136.1 et U-F respectivement produites par trois souches différentes de Streptococcus mutans : 123.1, 136.1 et F. Ainsi, après plusieurs tentatives de production, seule la mutacine D-123.1 issue d'un milieu de perméat de lactosérum enrichi à l'extrait de levure a montré une légère activité. Ce surnageant actif s'est montré sensible à 70°C/ 15min, mais résistant à 50°C/ 15 min. Elle est active à pH 4,5. Les essais de purification par chromatographies hydrophobes et d'échanges d'ions n'ont pas permis la purification de la mutacine D-123.1. / The increasing bacterial antibiotic resistance is of major concern in public health. In our laboratory we search for new natural antimicrobial substances to replace antibiotics to which bacteria are becoming more and more resistant. Mutacins are antimicrobial substances of the bacteriocin family showing inhibitory activity against antibiotic-resistant pathogenic bacteria. The objectives of my research were to produce in liquid medium, to purify and characterize mutacins D-123.1, P-136.1, and U-F. These mutacins are respectively produced by strains of Streptococcus mutans 123.1, 136.1, and F. After several attempts of production, only mutacin D-123.1 was detected in liquid medium made of cheese whey permeate enriched with yeast extract. The activity was thermosensitive (70°C/15 min) but resisted a treatment at 5O°C/15 min. It is active at pH 4.5. Attempts at purification of mutacin D123.1 using hydrophobic and ion exchange chromatographies did not succeed.

Streptococcus suis est un agent pathogène porcin causant des pneumonies, des septicémies et des méningites. Il est aussi un agent de zoonose responsable de plusieurs éclosions en Asie. Les souches de S. suis sont classifiées en 35 sérotypes basés sur la composition de leur capsule polysaccharidique. S. suis sérotype 2 cause la majorité des infections sévères et est sous-divisé en séquence types (ST). Le ST1 est associé avec des souches hautement virulentes. En Amérique du Nord, les souches communément isolées appartiennent aux ST25 et ST28, respectivement modérément et faiblement virulentes dans un modèle animal. La présence de S. suis sous forme de bioaérosols dans l’air des bâtiments porcins a été démontré. Le but de ce projet est d’étudier l’aérosolisation préférentielle de différentes souches de S. suis en utilisant une chambre expérimentale et un nébuliseur développés pour ce projet. Bien qu’un nombre supérieur de souches doivent être étudiées, les résultats du projet suggèrent que les souches hautement virulentes du sérotype 2 de ST1 semblent être préférentiellement aérosolisées et que l’aérosolisation préférentielle de S. suis semble être un processus souche dépendant. Cette étude est une preuve de concept et améliore nos connaissances sur la potentielle transmission de S. suis via les bioaérosols. / Streptococcus suis is a swine pathogen that causes pneumonia, septicaemia and meningitis. It is also a zoonotic agent responsible for outbreaks in Asia. S. suis strains are classified into 35 serotypes based on the composition of their polysaccharide capsule. S. suis serotype 2 causes the majority of severe infections and it is subdivided into sequence types (STs). The ST1 is associated with highly virulent strains. In North America, the strains most commonly isolated belong to ST25 and ST28, which are respectively moderately and weakly virulent in animal model. The presence of S. suis bioaerosols in the air of swine confinement buildings has been demonstrated. The aim of this study was to better understand the aerosolization behaviour of S. suis by investigating preferential aerosolization of different S. suis strains using in-house developed environmental chamber and nebulizer. Although more strains should be studied, the results suggest that the highly virulent serotype 2 ST1 strains seem to be preferentially aerosolized and that the S. suis preferential aerosolization is a strain-dependant process. This study is a proof of concept and increases our knowledge on the potential aerosol transmission of S. suis.

Face au développement incessant de la résistance aux antibiotiques, la découverte de nouvelles substances antibactériennes devient urgente. Les bactériocines, peptides bactériens à activité antibiotique synthétisés par les ribosomes, représentent une alternative. Les mutacines sont des bactériocines produites par Streptococcus mutans, une espèce bactérienne indigène de la cavité buccale. Quatre types de mutacines ont été caractérisés à ce jour: les lantibiotiques et non-lantibiotiques, monopeptidiques ou dipeptidiques. Des analyses bio-informatiques des génomes de S. mutans UA159 et NN2025 ont révélé la diversité des gènes codant potentiellement pour des bactériocines. L'étude des mutacines s'est toujours confrontée à la difficulté de les produire en milieu liquide. Deux mutacines (F-59.1 et I-T9) ont été produites et isolées d'un surnageant de culture d'un milieu élaboré à partir de perméat de lactosérum. La mutacine D-123.1 a été isolée à partir d'un milieu de culture de nature semi-solide. Les analyses biochimiques et moléculaires des mutacines révèlent que la mutacine F-59.1 est apparentée aux bactériocines de la famille des pédiocines alors que la mutacine D-123.1 appartient aux lantibiotiques. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et bactéricides (CMB) des mutacines D-123.1 et F-59.1 ont été déterminées contre plusieurs pathogènes humains. La mutacine D-123.1 a montré son efficacité contre les pathogènes du domaine médical et alimentaire avec des CMI comprises entre 0.25 et 4 ug/mL. La mutacine F-59.1 inhibe les pathogènes alimentaires avec des CMI comprises entre 3.2 et 12.8 ug/mL. De façon à détecter simplement et rapidement des mutacines apparentées aux pédiocines, les 24 souches type productrices de mutacines ont été testées par un test d'antagonisme différé, pour leur capacité à produire une mutacine capable de cibler le complexe IIC des transporteurs membranaires du mannose pour exercer leur activité inihibitrice. Streptococcus salivarius et des mutants défectueux dans leur transporteur du mannose ont été utilisés comme souches indicatrices. Deux souches de S. mutans (T9 et 3B) ont démontré une activité différente contre la souche mère et ces mutants, indiquant potentiellement la production de mutacine ciblant le transporteur du mannose par ces deux souches.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / BactÃrias e fungos sÃo encontrados juntos em uma infinidade de ambientes e, particularmente, na forma de biofilme, onde as espÃcies aderentes interagem atravÃs de diversos mecanismos de sinalizaÃÃo. Na cavidade oral, espÃcies de Candida coexistem com inÃmeras espÃcies bacterianas, e evidÃncias sugerem que bactÃrias podem modular a formaÃÃo de biofilme, bem como induzir a formaÃÃo de hifas e pseudo-hifas. Assim, caracterizar tais interaÃÃes à essencial para o entendimento da patogÃnese das doenÃas e, possivelmente, a descoberta de novas estratÃgias terapÃuticas. Nesse sentido, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar, in vitro, os mecanismos envolvidos na interaÃÃo entre as bactÃrias Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus parasanguinis e a levedura Candida tropicalis. No estudo foi analisado o efeito dos metabÃlitos extracelulares presentes no sobrenadante de C. tropicalis (SCT) sobre o biofilme prÃ-formado (6h) de S. oralis, S. sanguinis e S. parasanguinis. TambÃm foi avaliado o efeito dos metabÃlitos extracelulares de S. oralis (SSO), S. sanguinis (SSS) e S. parasanguinis (SSP) sobre o crescimento planctÃnico, formaÃÃo de biofilme e capacidade de filamentaÃÃo de C. tropicalis, utilizando apenas o sobrenadante da cultura de cada um dos estreptococos em diferentes concentraÃÃes (100, 50 e 25%). AlÃm disso, foi analisado o efeito dos metabÃlitos extracelulares dos estreptococos sobre o biofilme prÃ-formado (6h) de C. tropicalis. Para verificar o efeito dos metabÃlitos extracelulares foram utilizados dois mÃtodos: o mÃtodo turbidimÃtrico que se baseia na leitura da densidade Ãptica (OD) das suspensÃes celulares e a coloraÃÃo cristal violeta (CV) que permite a quantificaÃÃo indireta da formaÃÃo de biofilme atravÃs da coloraÃÃo com cristal violeta. Em seguida, foram examinadas as caracterÃsticas dos biofilmes, formados por 24 horas, atravÃs da anÃlise por microscopia Ãptica comum. Os resultados referentes ao biofilme foram submetidos ao ANOVA com pÃs-teste Bonferroni, com diferenÃa estatÃstica de p<0,01. Nossos resultados sugerem que substÃncias solÃveis produzidas por S. oralis, S. sanguinis e S. parasanguinis induzem a formaÃÃo de hifas de C. tropicalis sem interferir no crescimento planctÃnico. AlÃm de diminuir drasticamente o desenvolvimento do biofilme dessa levedura quando em contato com SSS e SSP. Tal fato reforÃa a ideia de que existe grande heterogeneidade dentro de biofilmes polimicrobianos, especialmente entre leveduras e bactÃrias. E que o resultado dessa interaÃÃo depende das condiÃÃes as quais estes micro-organismos serÃo submetidos. / Bacteria and fungi are found together in a multitude of environments, and particularly in the form of biofilm adherent species which interact through various signaling mechanisms. In the oral cavity, Candida species coexist with numerous bacterial species, and evidence suggests that bacteria can modulate biofilm formation as well as induce the formation of hyphae. Thus, to characterize such interactions are essential to the understanding of pathogenesis of diseases and possibly the discovery of new therapeutic strategies. In this sense, the main objective of this study was to evaluate, in vitro, the mechanisms involved in the interaction between bacteria Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, and Streptococcus parasanguinis yeast Candida tropicalis. In the study the effect of extracellular metabolites present in the supernatant of C. tropicalis (SCT) on the pre-formed biofilm (6H) S. oralis, S. sanguinis and S. parasanguinis was analyzed. The effect of extracellular metabolites of S. oralis (SSO), S. sanguinis (SSS) and S. parasanguinis (SSP) on planktonic growth and biofilm formation capacity filamentation of C. tropicalis was also evaluated using only the supernatant culturing each of streptococci in different concentrations (100, 50 and 25%). Furthermore, the effect of extracellular metabolites of streptococci on the pre-formed biofilm (6h) of C. tropicalis were analyzed. To verify the effect of extracellular metabolites two methods were used: The turbidimetric method based on the reading of the optical density (OD) of cell suspension and coloring crystal violet (CV) which permits indirect quantification of the biofilm formation by staining with crystal violet. Then were examined characteristics of biofilms formed by 24 hours, through the analysis simple optical microscope. The results for the biofilm were subjected to ANOVA with Bonferroni post-test, with a statistical difference of p<0.01.Our results suggest that soluble substances produced by S. oralis, S. sanguinis and S. parasanguinis induce the formation of hyphae of C. tropicalis without interfering with planktonic growth.In addition to dramatically decrease biofilm development of oral yeast when in contact with SSP and SSS. This reinforces the idea that there is great heterogeneity within polymicrobial biofilms, especially between yeasts and bacteria. And the result of this interaction depends on the conditions which these micro-organisms will be subjected.

Streptococcus Agalactiae est depuis les années 1990, responsable d'infections invasives émergentes chez l'adulte. Nous montrons queles souches responsables de ces infections appartiennent majoritairement aux sérotypes V et Ia et aux deux clones phylogénétiquement éloignés, CC1 et CC23. L'étude du contenu prophagique montre une lysogénie fréquente suggérant l'importance de la lysogénie dans la spécialisation de ces souches particulièrement aptes à infecter l'adulte. Dans un deuxième temps, nous avons isolé sept phages tempérés de souches associées à des infections cutanées et ostéo-articulaires. Ces phages appartiennent à la famille des SIPHOVIRIDAE. L’analyse par restriction enzymatique de l’ADN phagique et l’amplification par PCR de fragments d’ADN prophagique a montré la diversité de ces phages et leurdifférence des phages isolés de souches associées aux infections materno-foetales. Les phagesisolés de souches lysogènes de CC1 ont présenté un spectre lytique étendu aux souches de tous les clones intra-species. / Streptococcus agalactiae has emerged since 1990 in infections in nonpregnant adults, We showed that the strains isolated from adult infections were mainly of serotypes V and Ia., and mainly belonged to the two phylogenetically distant clones, CC1 and CC23. The prophagic content study showed a frequent lysogeny, suggesting a role of lysegeny in the specialization of these strains able to infect adult. Also, we isolated seven phages from strains associated with cutaneous and osteoarticular infections in adult. Ces phages classified among SIPHOVIRIDAE. Restriction analysis of phagic DNA and PCR for prophagic DNA showed genetiacally diverse phages, distinct from the phages isolated from strains responsible for materno-foetal infections. Phages isolated from lysogenic strains of CC1 had a wide lytic spectrum and were able to lyse strains belonging to all clones intra-species.