Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2209.pdf: 3433970 bytes, checksum: f1696bf3d4dba44ef3cb8eb1b129cdf5 (MD5) Previous issue date: 2008-10-11 / Financiadora de Estudos e Projetos / This work describes the investigation of part of the secondary metabolism of actinomicete Streptomyces clavuligerus and endophytic filamentous fungus Penicillium sp isolated from Murraya paniculata; Penicillium brasilianum and Aspergillus aculeatus isolated from Melia azedarach and Penicillium griseoroseum isolated from the grains of Coffea arabica. Preliminary tests were realized to define the best composition of medium culture and the best condition of cultivation Streptomyces clavuligerus. On the other hand, the endophytic fungus were cultivated in rice and Czapec´k (medium liquid). The anthranilic acid and the 7-hydroxy-2- methyl-chromone were identified from the extracts of S. clavuligerus by spectroscopic methods 1D e 2D NMR and mass spectrometry. Methodologies of analysis for detection of β-lactam antibiotics were developed by liquid chromatography combined with mass spectrometry. The identification was based on studies of standard compounds and comparison with literature data. These methodologies were efficient in the analysis of this type of substances and they allowed the detection and identification of β-lactam antibiotics such as the penicillin N, the cephamycin C, deacetoxy-cephalosporin C and the clavulanic acid in small amounts in S. clavuligerus the extracts. In the endophytic fungus extracts were possible to identify the 6-aminopenicillanic acid, precursor of the penicillin G and metabolites no β-lactams as nucleotides thymine and adenine. / Este trabalho descreve a investigação química de uma parte do metabolismo secundário do actinomiceto Streptomyces clavuligerus e dos fungos endofíticos filamentosos Penicillium s.p isolado de Murraya paniculata; Penicillium brasilianum e Aspergillus aculeatus isolados de Melia azedarach e Penicillium griseoroseum isolado dos grãos de Coffea arabica. Inicialmente, foram realizados testes preliminares para definir a melhor composição do meio de cultura e as melhores condições de cultivo para Streptomyces clavuligerus, já os fungos endofíticos foram cultivados em arroz e em meio líquido Czapec k. Dos extratos de S. clavuligerus foram identificados, por métodos espectroscópicos de RMN 1D e 2D e espectrometria de massas, o ácido antranílico e a 7-hidroxi-2-metilcromona. Com o objetivo de determinar a presença de antibióticos β-lactâmicos e outros metabólitos nos extratos foram desenvolvidas metodologias de detecção por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas. A identificação das substâncias foi feita com base no estudo de padrões comerciais e levantamento bibliográfico. Estas metodologias se mostraram eficientes na análise deste tipo de substâncias e permitiu a detecção de antibióticos β-lactâmicos como a penicilina N, a cefamicina C, a deacetoxicefalosporina C e o ácido clavulânico nos extratos de S. clavuligerus. Estas metodologias foram aplicadas nas análises dos extratos fúngicos onde foi identificado o ácido 6-aminopenicilânico, precursor da penicilina G e metabólitos não β-lactâmicos como os nucleotídeos timina e adenosina.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-12Bitstream added on 2014-06-13T19:08:57Z : No. of bitstreams: 1 antonio_t_me_araiq.pdf: 609701 bytes, checksum: da17caf99f88297148973c0dd3d64e83 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os grupos de antibióticos mais importantes clinicamente são os dos b-lactâmicos, aminoglicosídeos e tetraciclinas. Streptomyces clavuligerus produz vários compostos b- lactâmicos, com destaque para os antibióticos envolvidos na rota biossintética da cefalosporina C (penicilina N, deacetoxicefalosporina C e cefamicina C) e o ácido clavulânico (AC) que, embora não tenha atividade biológica significativa, é um potente inibidor de b-lactamases (penicilinases e cefalosporinases). A cefamicina C (CefC) é uma 7-metoxi-cefalosporina que apresenta maior atividade que a cefalosporina C (CPC), produzida somente por fungos, por ser resistente a b-lactamases. Apesar das rotas biossintéticas de AC e CefC serem completamente independentes em S. clavuligerus, são controladas pelo mesmo elemento multifuncional (ccaR), o que dificulta a indução da produção de um ou outro composto durante o processo fermentativo. No presente trabalho, procurou-se obter maiores concentrações de CefC manipulando-se componentes em meio solúvel de cultivo de S. clavuligerus, selecionados dentre compostos que, segundo a literatura, atuam como agentes reguladores da síntese daquele antibiótico. As fermentações foram realizadas em frascos agitados (28ºC, 260 rpm) para selecionar fontes de C e de N e, então, avaliar o processo no melhor meio-padrão, variando-se concentrações combinadas de L-lisina (10 a 108 mM) e -cetoglutarato (3 a 110 mM) através de metodologia de planejamento experimental. A presença de -cetoglutarato acarretou em aumento indesejável de pH, afetando negativamente o processo e os melhores resultados (entre 300 e 400 mg CPC totais/L após 72 horas de fermentação) foram obtidos no meio adotado como meio-controle, contendo amido e extrato protéico de semente de algodão como principais fontes de C e N, respectivamente, e L-lisina. / The most important groups of antibiotics, from a clinical standpoint, are -lactams, aminoglycosides and tetracyclines. Streptomyces clavuligerus produces several -lactam compounds, primarily the antibiotics involved in the biosynthetic route of cephalosporin C (penicillin N, deacetoxycephalosporin C and cephamycin C) and clavulanic acid (CA), which, despite its slight biological activity, is a potent inhibitor of -lactamases (penicillinases and cephalosporinases). Cephamycin C (CMC) is a 7-methoxycephalosporin with higher bioactivity than cephalosporin C (CPC) because it is more resistant to -lactamases. Although the biosynthetic routes of CA and CMC are completely independent in S. clavuligerus, they are controlled by a common multi-functional element (ccaR), which hinders induction of the production of one or the other compound during the fermentation process. In this work, we sought to obtain higher concentrations of CMC by handling compounds in a soluble medium of S. clavuligerus, which were selected from compounds that, according to the literature, act as regulating agents in the synthesis of that antibiotic. Fermentation was carried out in flasks under shaking (28ºC, 260 rpm), in order to select sources of C and N. The process was then evaluated in the best standard medium, by varying combined concentrations of lysine (10 to 108 mM) and -ketoglutarate (3 to 110 mM) using an experimental planning methodology. The presence of -ketoglutarate caused an undesirable increase in pH, negatively affecting the process. The best results (between 300 and 400 mg/L of total CPC after 72 h of fermentation) were obtained in the medium used as the control, which contained starch and cottonseed protein extract as main sources, respectively, of C and N, and L-lysine.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2477.pdf: 853103 bytes, checksum: cf8d502909db7590755b118f3a0c49b5 (MD5) Previous issue date: 2008-08-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / A great deal of microbiological and genetic research in the pharmaceutical industry is directed towards the development of effective strategies in the handling of microorganisms seeking the production of antibiotics that already known. In the process of obtaining clavulanic acid (CA) from Streptomyces clavuligerus, it is necessary to implement a system of strain conservation to maintain the capacity of microorganisms. Therefore, the purpose of this study was to test different preservation strategies of spores and vegetative cells of S. clavuligerus ATCC 27064 in order to ensure optimum conditions for the production of CA. Eight sets of vegetative cells stored in cryotubes were prepared, and they were evaluated for 12 months according to the number of growth stages (one or two 24-hour stages), the influence of the mycelium washing stage (washed or not), and the concentration of the cryoprotective agents (glycerol 10 or 20% v/v). Two sets of spores stored in cryotubes were also evaluated according to the concentration of cryoprotective agents. All cultures were performed in a rotating table incubator using the culture medium ISP1 for reactivation and complex medium for the production of CA. Morphology, cell growth, and the production of CA were evaluated in all cultures. The major findings were that the conservation of spores with 10% glycerol (E-10) allowed a more viable condition that the E-20 during the 360 days of storage, and the loss of CA production after 360 days was 18% but the condition E-20 was 50%. CL1-20 and CL2-20 were the best preservation conditions (more stable) for vegetative cells stored in cryotubes. Regarding the production of CA obtained, the maximum value was 1300 mg.L-1 at 144 h in the CNL 2-20 preservation condition. / Muitas pesquisas microbiológicas e genéticas na indústria farmacêutica são direcionadas para o desenvolvimento de estratégias eficazes na manipulação de microrganismos, visando à produção de antibióticos conhecidos. No processo de obtenção de ácido clavulânico (AC) a partir de Streptomyces clavuligerus faz necessário à implementação de um sistema de conservação da linhagem para manter a capacidade do microrganismo em questão. Baseado neste propósito o objetivo deste trabalho foi testar diferentes estratégias de preservação nas formas de esporos e células vegetativas de S. clavuligerus ATCC 27064 para garantir condições ótimas de produção de AC. Foram preparados 8 conjuntos de criotubos de células vegetativas e avaliados durante 12 meses em relação ao número de etapas de crescimento (uma ou duas etapas de 24 horas), à influência da etapa de lavagem do micélio (lavados ou não) e a concentração do agente crioprotetor (glicerol 10 ou 20% v/v). Dois conjuntos de criotubos de esporos também foram avaliados em relação à concentração do agente crioprotetor. Todos os cultivos foram realizados em mesa incubadora rotativa utilizando-se o meio de cultura ISP1 para reativação e, meio complexo para produção de AC. Avaliou-se em todos os cultivos a morfologia, o crescimento celular, e a produção de AC. Como resultados principais obteve-se que à conservação de esporos com 10% de glicerol permitiu uma viabilidade maior que a condição E-20 durante os 360 dias de armazenamento, sendo que a perda de produção de AC após 360 dias foi de 18% em comparação com a condição E-20 que foi de 50%. As formas de preservação CL1-20 e CL2-20 foram as melhores condições de preservação (mais estável) entre os criotubos preservados na forma de células vegetativas. Em relação às produções de AC obtidas, o valor máximo alcançado foi de 1300 mg.L-1 em 144 h, no modo de preservação CNL 2-20.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2376.pdf: 4470220 bytes, checksum: 644c37c19e76d1210fdcb9459057052a (MD5) Previous issue date: 2008-12-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / The clavulanic acid is a powerful inhibitor of the beta-lactamases produced by bacterias resistants to penicillin and cefalosporin. This acid is produced industrially by strains of Streptomyces clavuligerus in complex medium whose carbon and nitrogen source are supplied by inexpensive substances that provide high production. The clavulanic acid has a high affinity for enzymes that attach to penicillin derivatives, what enable to be used with semi-synthetic penicillin, being the combination with amoxilin the best exemple of substances inhibitor of beta-lactamases. The genetic improvement using physical and chemical agents is a necessary strategy in programs of production of bioactive metabolit whereas the industrial strains lost its productivity due phenomenon of genetic instability. In this work it appraised morphologic and biochemistry characteristic of some mutant strains obtained by treatment with UV light and with MMS, always comparing the caracteristics of the mutants with the wild type (Streptomyces clavuligerus ATCC 27064). The results indicated that the mutations originated strains with differents phenotypes, and the larger changes were demonstrated through mutants strains AC116, MMS 150 and MMS 54, that exhibited absence of pigmentation in its mature spores. The strains MMS 150 presented a larger production of AC when cultured in semisynthetics mediums. Among the others mediums the wild type strain obtained a larger production, however when used the modifed complex medium, the MMS 150 strain showed changes in its lipolitic activity and a larger production of AC. / O ácido clavulânico é um poderoso inibidor de enzimas -lactamases produzidas por bactérias resistentes a penicilinas e cefalosporinas. Esse ácido é produzido industrialmente através de cultivos submersos de Streptomyces clavuligerus, em meios complexos cujas fontes de carbono e de nitrogênio são supridas por matérias primas de baixo custo que propiciam altas produtividades. O ácido clavulânico mostra uma grande afinidade por enzimas que se ligam a derivados da penicilina, facilitando a sua utilização frequente com penicilinas semi-sintéticas, sendo a combinação com a amoxicilina o melhor exemplo do uso de substâncias inibidoras de beta-lactamases. O melhoramento genético utilizando agentes físicos e químicos é uma estratégia necessária em programas de produção de metabólitos bioativos já que as linhagens de porte industrial perdem sua produtividade devido a fenômenos de instabilidade genética. Neste trabalho foram avaliadas características morfológicas e bioquímicas de algumas linhagens mutantes obtidas por tratamento com luz UV e com metil metano sulfonato, comparando sempre as características dos mutantes com as da linhagem selvagem (Streptomyces clavuligerus ATCC 27064). Os resultados indicaram que as mutações deram origem a linhagens fenotipicamente diferentes, sendo que as maiores mudanças foram demonstradas pelas linhagens mutantes AC116, MMS 150 e MMS 54, que apresentaram ausência de pigmentação dos seus esporos maduros. A linhagem MMS 150 apresentou uma maior produção de AC diante os cultivos realizados com os meios de cultura semi-sintéticos. Perante os outros meios de cultura a linhagem selvagem obteve uma maior produção, porém quando utilizado o meio de cultura complexo modificado, a linhagem MMS 150 apresentou mudanças na sua atividade lipolítica e uma maior produção de AC.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseABN.pdf: 1445725 bytes, checksum: 38e5e0b190be727b51de40dfdf21ac01 (MD5) Previous issue date: 2004-11-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The use of β-lactamase inhibitor in conjunction with β-lactam antibiotics was proposed to improve the efficiency of these antibiotics. The clavulanic acid is an important inhibitor of β-lactamase due its ability to inhibit several classes of β-lactamases. The clavulanic acid is a product from the secondary metabolism of Streptomyces clavuligerus and its production rate is higher after the fast growing phase. Higher productivities can be achieved in cultivations with high cell density. Therefore, the objective of this work was to study the continuous clavulanic acid production process with high cell density, possible with the recycle of cells. Initially, experiments to determine the proper pH and medium compositions to improve clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus were performed. Experiments to examine the effect of inhibition and/or repression by glycerol were also carried out. Continuous culture without cell recycling was performed to develop a kinetic model, including parameter determination, to simulate the process of clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus. Classic models failed to describe the process and a kinetic model which takes into account the simultaneous consumption of glycerol and nitrogen source, as energy sources, was proposed. To obtain high cell density, continuous cultivation with cell recycling was carried out. Among the methods examine to concentrate the cell mass, microfiltration was chosen because it is easily operated and allows the obtention of a limpid broth, as it is able to separate the totality of the cells from cultivation broth. This process eliminates the separation of cells in downstream processes. Concerning the problems such as oxygen transfer limitation and increase in the viscosity of culture broth, it has been observed that it does not hinder the applicability of continuous culture with cell recycling. The present work shows that continuous culture with cell recycling maximizes the productivity, suggesting its utilization for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus. / O ácido clavulânico é um potente inibidor de β-lactamase, sendo utilizado em associação com antibióticos β-lactâmicos para combater bactérias patogênicas resistentes a ação de antibióticos. É um produto oriundo do metabolismo secundário do Streptomyces clavuligerus produzido à maior velocidade após a fase de crescimento célula. Assim, cultivos com concentrações maiores de células podem resultar em maiores produtividades do processo. Por essa razão o objetivo principal do trabalho foi o estudar o processo contínuo de produção de ácido clavulâncio obtida através de reciclo de células. Inicialmente, foram realizados testes preliminares para determinar o melhor valor de pH bem como a melhor composição de meio de cultivo. Também, foram realizados experimentos para verificar efeitos de inibição de glicerol na produção de ácido clavulânico. Após essa etapa, foram realizados experimentos contínuos sem reciclo celular para determinar os parâmetros cinéticos do modelo, descrevendo o processo de produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus. Para a modelagem matemática, foi proposto um modelo cinético de crescimento celular que considerava o consumo simultâneo do glicerol e da fonte de nitrogênio. Com o objetivo de obter altas concentrações celulares, foram realizados cultivos contínuos com reciclo celular. O processo de microfiltração foi escolhido devido a sua facilidade de operação e por apresentar separação celular de 100%, fato importante, pois elimina a separação celular na etapa de purificação do ácido clavulânico. Problemas relativos à transferência de massa e aumento da viscosidade também foram investigados, verificando-se que limitações decorrentes destes fenômenos são contornáveis através de modificações de condições operacionais. O presente trabalho mostra que a produtividade obtida nos cultivos contínuos com reciclou (25,2mg.L-1.h-1) celular é maior que aquela em batelada (11,7mg.L-1.h-1) e em processos contínuos sem reciclo celular (18,3 mg.L-1.h-1), sugerindo a utilização do sistema com reciclo celular para a produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JCT.pdf: 1491888 bytes, checksum: 4d9ca7cdf5589d00d6842774413d3761 (MD5) Previous issue date: 2004-03-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / The clavulanic acid (CA) is an important inhibitor of β-lactamases, enzymes that clives the β-lactam ring of penicillins and cephalosporins, inativating these compounds. CA is traditionally produced by Streptomyces clavuligerus in batch (B) or feed batch (FB) cultivations. Considering that the products of easily assimilable catabolic carbon source catabolism repress the biosynthesis of secondary metabolite, including CA, production in FB is preferable because control of nutrient level can be performed. In the present work the effect of supplementing medium (composition, concentration of glycerol and feed flow rate) on the production of CA was evaluated in fed batch cultivations in 4L stirred-tank bioreactor. Aeration was set at 0.5 vvm, the agitation rate was controlled at 800 rpm and pH at 6.8. Initially, a batch cultivation was carried out with glycerol (15 g.L-1) and Samprosoy (20 g.L-1), a soy protein hydrolyzate, as carbon and nitrogen sources, respectively. The results obtained from this experimental, concerning CA production, were considered as standart for comparasion with furter experimental results. Also, the observed glycerol consuption rate was used to define the glycerol feed rate infurter experiments. The kinetic model considering non-associated production with CA degradation was fitted to the experimental results and cultivation in FB were simulated under different conditions of volumetric flow rate (F) and glycerol concentration on supplementary medium (Cse). The experimental results showed that the rate of production of CA and glycerol consumption, were directly related, condition not predicted by model, besides, its negative effect on the AC production after the feeding indicate a possible inhibition/repression effect of glycerol. The possible negative effect of glycerol not confirmed by the results of a batch cultivation with pulse of glycerol at 24 hours cultivation, indicating that this effects caused by others compounds in the culture medium or due to dilution of the medium. The subsequent results with different feeding conditions and glycerol concentration utilizing complete supplementary medium, with only glycerol, indicate that CA production is increased in process with high Cse and low volumetric flow rate (F) that guarantee sufficient carbon source and minimize the dilution effects. / O ácido clavulânico (AC) é um importante inibidor das enzimas β-lactamases que clivam o anel β-lactâmico de antibióticos como penicilinas e cefalosporinas, tornando esses compostos inativos. O AC é tradicionalmente produzido por Streptomyces clavuligerus em cultivos operados em batelada (B) e em batelada alimentada (BA). Pelo fato dos produtos do catabolismo de fontes de carbono facilmente assimiláveis acabarem por reprimir as enzimas responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários, entre os quais inclui-se o AC, a produção em BA é preferível, uma vez que torna possível controlar os níveis de nutrientes no caldo. No presente trabalho foram avaliados os efeitos da alimentação de meio de cultura suplementar (composição, concentração de glicerol e vazão) na produção de AC em batelada alimentada em biorreator de bancada de 4L em cultivos operados a 800 rpm, 0,5 vvm e pH = 6,8. Inicialmente, realizou-se um cultivo em batelada em meio de cultura contendo de glicerol (15 g.L-1) e Samprosoy 90 NB (20 g.L-1), uma proteína isolada de soja. Os resultados desse cultivo em termos de produção de AC serviram de padrão de comparação e a velocidade de consumo de glicerol como base para definir a velocidade de alimentação de glicerol nos cultivos em BA. Um modelo cinético para produto não associado ao crescimento considerando degradação do AC foi ajustado aos resultados experimentais e simulações foram realizadas para cultivos em BA, definindo as condições que deveria conduzir tais cultivos com o intuito de se obter os resultados esperados. Foram realizados cultivos em diferentes condições de vazão volumétrica de alimentação (F) e concentração de glicerol no meio suplementar (Cse). Os resultados experimentais mostraram uma relação linear entre as velocidades de AC e de consumo de glicerol, condição não prevista pelo modelo, além de um efeito negativo na produção de AC num período após o início de alimentação, indicando uma possível inibição ou repressão pelo glicerol, o que foi descartado pelos resultados de um cultivo em batelada com pulso de glicerol em 24 horas, indicando que tal influência poderia ser devido a outro (s) constituinte (s) do meio ou a diluição. Os resultados de cultivos subseqüentes, em diferentes condições de vazão e de concentração de glicerol e com meio de cultura suplementar completo e com apenas glicerol, indicaram que a produção de AC é melhorada operando o processo com alta Cse e baixas vazões (F), condições que asseguram suficiência em fonte de carbono e minimizam os efeitos de diluição

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:08:57Z : No. of bitstreams: 1 cavallieri_ap_me_araiq.pdf: 708556 bytes, checksum: 7e6135c09f6e81026381b8ad167bf086 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / β-lactâmicos são compostos de elevada importância clínica. Streptomyces clavuligerus produz vários destes compostos, como penicilina N (PenN), deacetilcefalosporina C, deacetoxicefalosporina C, cefamicina C (CefC) e ácido clavulânico (AC). Particularmente, CefC é um antibiótico de grande interesse por suas características de resistência a β-lactamases. A biossíntese deste antibiótico envolve uma série complexa de reações enzimáticas, iniciando-se com a etapa limitante de conversão de L-lisina em ácido L-α-aminoadípico (AAA) que, então, condensa-se com cisteína e valina para formar L-α-aminoadipil-L-cisteinil-D-valina (ACV), o precursor dos antibióticos β-lactâmicos. A formulação de meios utilizando-se estratégias racionais tem sido de fundamental importância para incrementar a produção de antibióticos β - lactâmicos em S. clavuligerus. No presente trabalho, visando contornar a etapa de conversão de L-lisina, investigou-se o efeito da adição de AAA e/ou L-lisina no processo de produção de CefC por S. clavuligerus ATCC 27064 em meio de produção complexo solúvel contendo amido e farinha de semente de algodão (ProfloTM) como principais fontes de C e energia e de N, respectivamente. Inicialmente, foram realizadas fermentações adicionando-se ao meio um ou outro aminoácido. Os resultados destes experimentos subsidiaram, então, a seleção de faixas de concentração dos aminoácidos, através de métodos de planejamento experimental, para investigar o efeito combinado destes compostos no processo. Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por meio de metodologia de superfície de resposta, relacionando-se concentração inicial e consumo de AAA e L-lisina com a produção de CefC. Nos experimentos com os meios contendo somente L-lisina ou AAA, como também naqueles estabelecidos através de metodologia de planejamento experimental... / β-lactams are compounds of high clinical importance. Streptomyces clavuligerus produces various of these compounds, such as penicillin N (PenN), deacetiylcephalosporin C, deacetoxycephalosporin C, cephamycin C (CefC), and clavulanic acid (AC). Particularly, CefC is an antibiotic of great interest for its characteristics of β-lactamases resistance. The biosynthesis pathway of CefC involves a complex series of enzymatic reactions, starting with the rate-limiting step of the lysine conversion to α-aminoadipic acid (AAA), followed of this compound condensation with cysteine and valine to form L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine (ACV), the precursor of β-lactam antibiotics. In this work, the effect of the addition of AAA and / or lysine on CefC production by S. clavuligerus ATCC 27064 was investigated. It was used a complex medium containing soluble starch and cottonseed flour (ProfloTM) as main sources of C and energy, and N, respectively. Initially, fermentations were carried out by adding to the medium one or other amino acid. The results of these experiments were used to select the concentration ranges of amino acids by using methods of experimental design. A three-level full-factorial design was applied to investigate the combined effects of lysine and AAA concentrations on CefC production. Response surface methodology was used to determine statistically the optimum amino acids concentration values in order to obtain the maximum concentration of antibiotic. Positive effects of these amino acids on the production of antibiotics were observed in the experiments using media containing lysine or AAA, as well in the designed experiments. The effect of adding phosphate ions in the production medium was investigated too. It was found that there was a maximum production with the addition of 15 mM, within the range studied (0 to 25 mM phosphate). To confirm the results, a fermentation run was... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6193.pdf: 1697828 bytes, checksum: 4cc53ac247e8d63c069aaa864a656b3a (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Clavulanic acid (CA) produced by Streptomyces clavuligerus, is a potent inhibitor of beta-lactamases used in combination with conventional beta-lactam antibiotics in the treatment of infections caused by resistant bacteria to these antibiotics. The biosynthesis of CA is limited by high concentrations of carbon source and like other beta-lactam compounds, it is highly unstable in acidic or basic pHs even at moderate temperatures. In this work, it was investigated different strategies to improve the production of AC. Batch and batch cultivations with glycerol pulses were carried out in shaker at 250 rpm and pH 6.8 at constant temperatures of 20, 25 and 30°C (run control), as well as with temperature reduction after cell growth phase from 30 to 25°C, 30 to 20°C and 25 to 20 C. It was also investigated the effects of temperature and pH on the AC degradation at various cultivation times in the presence of different concentration of ammonium ion. It was observed that the use of low temperatures (20°C) during cultivation reduced the substrate uptake rate and provides a higher accumulation of AC, in the broth by reducing the effects of CA degradation and inhibition effects caused by carbon source. Batch cultivations with higher glycerol concentration (30 and 60 g/L) were also performed at low temperature (20 and 25°C). The results confirmed that glycerol inhibits or even represses the biosynthesis of CA, depending of the temperature condition employed. The highest CA concentration value (1543 mg/L) were obtained for the cultivation at 20°C and 30 g/L glycerol, 9.2 fold-higher than run control at 30°C. The kinetics of CA degradation at pHs 6.5 and 7.5 and at different concentrations of ammonium ion (0 to 1000 mg/L) were also evaluated. It observed that the degradation was highest at pH 7.5 and higher concentration of ammonium ion. For all proposals of cultivations for CA production, it was obtained a maximum CA concentration in fermentation broth of about 1.5 g/L, indicating that CA acts as an inhibitor of its own biosynthesis. Then, the potential CA removal from broth culture was evaluated by using of alternative adsorbents such as activated carbon, clinoptilolite calcined hydrotalcite, and an ion exchange resin Amberlite IRA 400, for application in extractive fermentation process. The use of resin IRA 400 as an adsorbent to remove CA during cultivation resulted in an increase of 48% in maximum CA concentration if compared with cultivation at the same temperature condition (20°C) and glycerol concentration (15 g/L) conducted without product removal, confirming the hypothesis of inhibition by product in the CA production process. In cultivation at 20°C with glycerol concentration of 30 g/L and product removal, it was obtained a highest CA production of 2841 mg/L. The results indicate that the use of low temperature combined with the removal of product during the production process of AC represent a new and effective strategies to greatly increase the yield of CA. / O ácido clavulânico (AC), produzido pela bactéria Streptomyces clavuligerus, é um potente inibidor de beta-lactamases utilizado em combinação com antibióticos betalactâmicos convencionais no tratamento de infecções causadas por bactérias resistentes a estes antibióticos. A biossíntese de AC é limitada por altas concentrações de fonte de carbono e assim como outros compostos beta-lactâmicos, é altamente instável em pH s básicos ou ácidos, mesmo em temperaturas moderadas. No presente trabalho, foram investigadas diferentes estratégias de melhoria da produção de AC. Foram realizados cultivos em batelada e batelada com pulsos de glicerol em mesa incubadora rotativa a 250 rpm e pH 6,8 em temperaturas constantes de 20, 25 e 30ºC (controle), bem como cultivos com redução de temperatura após a fase de crescimento celular de 30 para 25ºC, 30 para 20ºC e 25 para 20ºC. Foram também investigados os efeitos da temperatura e do pH na degradação de AC em diferentes tempos de cultivo e na presença de íons amônio. Observou-se que o uso de baixas temperaturas (20ºC) durante o cultivo reduz a velocidade de consumo de substrato e proporciona um maior acúmulo de AC, ao reduzir os efeitos de degradação e os efeitos de inibição pela fonte de carbono. Foram também realizados cultivos em batelada com alta concentração de glicerol (30 e 60 g/L) a baixa temperatura (20 e 25ºC). Os resultados confirmaram que o glicerol inibe ou até reprime a biossíntese de AC, dependendo da condição de temperatura empregada. Os maiores valores de concentração de AC foram obtidos para o cultivo a 20ºC e 30 g/L de glicerol (1543 mg/L), valor 9,2 vezes maior que o cultivo controle em batelada a 30ºC. As cinéticas de degradação de AC em pH s 6,5 e 7,5 e em diferentes concentrações de íons amônio (0 a 1000 mg/L) também foram avaliadas. Verificou-se que a degradação foi acentuada em pH 7,5 e com maiores concentrações de íons amônio. Para todas as propostas de cultivos de produção de AC, obteve-se uma concentração máxima de AC no caldo de cerca de 1,5 g/L, indicando ser o AC inibidor da sua própria biossíntese. Foram então avaliados os potenciais de remoção de AC do caldo de cultivo por adsorventes alternativos como carvão ativado, clinoptilolita e hidrotalcita calcinada, e por uma resina de troca iônica, Amberlite IRA 400, para aplicação no processo de fermentação extrativa. O uso de resina IRA 400 como adsorvente para remover AC durante o cultivo resultou num aumento de 48% na concentração máxima de AC em comparação com o cultivo na mesma condição de temperatura (20ºC) e concentração de glicerol inicial (15 g/L) realizadas sem a remoção do produto, comprovando a hipótese de inibição pelo produto no processo de produção de AC. Em cultivo a 20ºC com concentração de glicerol de 30 g/L e remoção de produto, obteve-se uma alta produção de AC de 2841 mg/L. Os resultados indicam que o uso de baixa temperatura aliado à remoção de produto durante a produção de AC representam novas e eficientes estratégias que elevam sobremaneira o rendimento da produção de AC.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3016.pdf: 1439858 bytes, checksum: d2fb7acefaebdedc5e74fca49ca5195d (MD5) Previous issue date: 2010-03-31 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cephamycin C (CephC) is a natural antibiotic produced by Streptomyces clavuligerus that presents β-lactamases resistance, enzymes that clives β-lactam of antibiotics. The aim of present work was study cephamycin production by Streptomyces clavuligerus in batch and fed-batch cultivations, in order to define important parameters as culture medium and carbon source feeding conditions for the purpose of maximize the CefC production. First the methodology of analysis of CefC was tested. Due to standard unavailability for analysis of CefC in the fermentative broths, it was evaluated the sensibility of microorganism test (Escherichia coli ESS) face other standards. It was verified that E. coli ESS strain presents super sensibility to penicillin G and cephalosporin C. Due to the presence of clavulanic acid (CA) in the both, a β-lactamase inhibitor, it was evaluated the influence of the sample treatment (acid and basic hydrolisis) on penicillin N hydrolysis by penicillinase. For an adequate CephC analysis, the results showed that both clavulanic acid and cephamycin C were degraded in acid and alkaline medium, with higher degradation was in alkaline pH. The results show that the samples should be treated only with penicillinase for the correct CephC analysis by elimination of intermediates compounds the CephC biosynthetic pathway. For the evaluation of the CephC production, firstly different culture media proposed in the literature were tested with S. clavuligerus ATCC 27064 strain in bench scale bioreactor. The best result in terms of cellular growth and CephC production (374.8 mg.L-1 em 66 h) was obtained in batch cultivation that utilized starch and cottonseed meal as carbon and nitrogen sources. The influence of carbon and nitrogen sources on CephC production was then evaluated utilizing two Streptomyces clavuligerus strains, ATCC 27064 and DSM 41826, a natural mutant indicated as higher CephC producing by literature. Glycerol and soy bean meal have showed more suitable as carbon and nitrogen sources for CephC production due probably to slow and gradual availability of nitrogen from protein hydrolysis of soy bean meal (insoluble nitrogen source). In the fed-batch cultivation utilizing glycerol or starch as carbon source, the best result in terms of CephC production (566.5 mg.L-1 in 108 h) was obtained in the fed-batch cultivation with glycerol feeding at volumetric flow rate of 0,01 L.h-1 and concentration of 177 g.L-1. In the experimental conditions tested in the fed-batch cultivations, ranging carbon source and feeding conditions, it was not possible visualize the dissociation between clavulanic acid and cephamycin productions. The higher CephC in medium with glycerol is probably associated to its favorable energetic balance and metabolization rate in relation to starch. / A cefamicina C (CefC) é um antibiótico natural produzido por Streptomyces clavuligerus que apresenta resistência à ação de β-lactamases, enzimas que degradam o anel β -lactâmico de antibióticos. O presente trabalho teve como objetivo estudar a produção de CefC por Streptomyces clavuligerus em batelada e batelada alimentada, no sentido de se definir parâmetros importantes como composição do meio de cultura e condições de alimentação de meio suplementar de forma a maximizar a produção de CefC. Primeiramente, a metodologia de análise de CefC foi testada. Devido à indisponibilidade de um padrão para a análise da concentração de CefC obtida nos caldos fermentados, avaliou-se a sensibilidade do microrganismo teste, Escherichia coli ESS, frente a outros padrões. Verificou-se que a linhagem de E. coli ESS é supersensível à penicilina G e à cefalosporina C. Devido à presença de ácido clavulânico (AC) no caldo, um inibidor de β-lactamases, foi avaliada a influência do tratamento das amostras (hidrólises ácida ou alcalina) na hidrólise de penicilina N por penicilinase. Tanto AC quanto a CefC foram degradados em meios ácidos e alcalinos, sendo a degradação maior em pH básico. Os resultados demonstraram que a inativação do ácido clavulânico não é necessária para a inativação de penicilina N pela penicilinase. Para a avaliação da produção de CefC, primeiramente foram testados diferentes meios de cultura propostos na literatura com a linhagem de S. clavuligerus ATCC 27064. O melhor resultado foi alcançado no cultivo utilizando meio de cultura composto por amido como fonte de carbono e farinha de semente de algodão como fonte de nitrogênio que forneceu boa produção de cefamicina (374,8 mg.L-1 em 66 h) associada a bom crescimento celular. Foi também estudada a influência de diferentes fontes de carbono e de nitrogênio na produção de CefC, utilizando duas linhagens de Streptomyces clavuligerus, ATCC 27064 e DSM 41826. O glicerol e farinha de soja mostram-se como mais favoráveis, mostrando que a produção de CefC é melhorada com a lenta e gradual disponibilidade de nitrogênio a partir da hidrólise de proteínas da farinha de soja (fonte insolúvel de nitrogênio). Nos cultivos em batelada alimentada, a maior produção de CefC (566,5 mg.L-1 em 108 h) foi alcançada no cultivo alimentado com glicerol à vazão volumétrica de 0,010 L.h-1 e concentração de glicerol na alimentação de 177 g.L-1. Nas condições experimentais testadas variando fonte de C e condições de alimentação não foi possível visualizar a dissociação entre as produções de ácido clavulânico e de cefamicina C. A maior produção de CefC com glicerol em relação ao amido está associada provavelmente ao balanço energético e velocidade de metabolização favoráveis ao glicerol.

Streptomyces clavuligerus is a Gram-positive, filamentous bacterium which produces several important secondary metabolites, including isopenicillin N, cephamycin C and the &beta / -lactamase inhibitor clavulanic acid. Among these compounds, clavulanic acid is being used in combination with commonly used &beta / -lactam antibiotics in order to fight against bacterial infections that are resistant to such antibiotics. Among these combinations, Augmentin, composed of amoxicillin and clavulanic acid, is the most widely prescribed drug and has a market value of more than one billion dollars per year. There are two genes that act in regulation of clavulanic acid biosynthesis: ccaR located in cephamycin C gene cluster and claR located in clavulanic acid gene cluster. The goal of this study is to improve clavulanic acid production capacities of both wild type and industrial S. clavuligerus strains by integrating extra copies of claR gene into S.clavuligerus genome and its overexpression via a multicopy plasmid. Although previously has shown to be quite effective on wild type S. clavuligerus strains, claR overexpression in the industrial strain used in this study yielded only 1.4-fold increase in volumetric and 1.7-fold increase in specific CA production by the recombinant strains MA28 and MA16, respectively.