<p>The third domain of life, Archaea is one of the three main evolutionary lineages together with the Bacteria and the Eukarya domains. The archaea are, despite their prokaryotic cell organisation, more closely related to eukaryotes than to bacteria in terms of the informational pathways (DNA replication, transcription and translation). Organisms from the archaeal hyperthermophilic genus <i>Sulfolobus</i> thrives in a hot (80°C), acidic (pH 2-4) and sulphur-rich environment.</p><p>In my thesis, I have used a variety of different approaches to study the <i>Sulfolobus</i> cell cycle. After dilution of a stationary phase cell culture with fresh medium, synchronous cell cycle progression was obtained. From the synchronised cell culture experiment we could conclude that the major cell cycle events (nucleoid segregation, cell division and chromosome replication) were tightly coupled to each other and to cellular mass increase. </p><p>Inhibitors of the elongation stage of chromosome replication, and of cell division, as well as drugs arresting the cell cycle in the post-replicative phase, were found in an in vivo screening of a range of antibiotics. The cell cycle was found to be regulated such that the previous cell cycle step had to be successfully accomplished before the next could initiate, except for DNA replication which could occur without an intervening cell division event.</p><p>The replication pattern of <i>Sulfolobus solfataricus</i> was analysed using a marker frequency assay. From the results, we were able to determine that a single origin is utilized in vivo, that the replication directionality is bidirectional, and also an approximate location of the replication origin within the genome.</p><p>Intracellular virus production in vivo of SIRV2 (<i>Sulfolobus islandicus</i> rod-shaped virus2) in <i>Sulfolobus islandicus</i> was also analysed. The effects on the host cell were determined, including loss of cell viability, inhibited initiation of replication at virus infection and DNA degradation and loss of cell integrity at the time of virus release. Also, for the first time intracellular virus DNA was visualized with flow cytometry.</p>

The third domain of life, Archaea is one of the three main evolutionary lineages together with the Bacteria and the Eukarya domains. The archaea are, despite their prokaryotic cell organisation, more closely related to eukaryotes than to bacteria in terms of the informational pathways (DNA replication, transcription and translation). Organisms from the archaeal hyperthermophilic genus Sulfolobus thrives in a hot (80°C), acidic (pH 2-4) and sulphur-rich environment. In my thesis, I have used a variety of different approaches to study the Sulfolobus cell cycle. After dilution of a stationary phase cell culture with fresh medium, synchronous cell cycle progression was obtained. From the synchronised cell culture experiment we could conclude that the major cell cycle events (nucleoid segregation, cell division and chromosome replication) were tightly coupled to each other and to cellular mass increase. Inhibitors of the elongation stage of chromosome replication, and of cell division, as well as drugs arresting the cell cycle in the post-replicative phase, were found in an in vivo screening of a range of antibiotics. The cell cycle was found to be regulated such that the previous cell cycle step had to be successfully accomplished before the next could initiate, except for DNA replication which could occur without an intervening cell division event. The replication pattern of Sulfolobus solfataricus was analysed using a marker frequency assay. From the results, we were able to determine that a single origin is utilized in vivo, that the replication directionality is bidirectional, and also an approximate location of the replication origin within the genome. Intracellular virus production in vivo of SIRV2 (Sulfolobus islandicus rod-shaped virus2) in Sulfolobus islandicus was also analysed. The effects on the host cell were determined, including loss of cell viability, inhibited initiation of replication at virus infection and DNA degradation and loss of cell integrity at the time of virus release. Also, for the first time intracellular virus DNA was visualized with flow cytometry.

Chez les Archaea, tous les processus informationnels, transcription incluse, sont effectués par des protéines proches de celles des Eukarya. Alors que la machinerie transcriptionnelle des archées a été bien caractérisée structurellement et fonctionnellement, très peu d'informations sont disponibles sur la régulation de son activité. En travaillant à la fois avec des modèles cellulaires (crénarchée hyperthermophile Sulfolobus islandicus) et viraux, nous avons pu réaliser une étude approfondie de trois régulateurs transcriptionnels et mieux comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez les archées. Au cours de cette thèse, deux régulateurs viraux, SvtR et AFV1p06, et un régulateur cellulaire, Sta1, ont été étudiés. Concernant SvtR, codé par le virus SIRV1 qui infecte S. islandicus, nous avons poursuivi la recherche précédente, qui avait permis de déterminer sa structure et sa fonction, en nous focalisant sur la caractérisation de l'ensemble de ses cibles dans le génome viral et sur l'étude de son mécanisme d'action. Pour cela, la séquence du site consensus reconnu par SvtR a été établie à l'aide de la mutagénèse systématique d'un de ses sites déjà caractérisés. Ce site est présent dans les promoteurs de dix gènes de SIRV1 montrant que SvtR pourrait réguler l'activité de plus de 20% des gènes viraux. Ses cibles incluent tous les gènes codant pour les protéines de la capside virale. L'analyse fonctionnelle réalisée sur une partie des sites de liaison de SvtR a permis de démontrer qu'il s'agit d'un régulateur polyvalent agissant, selon la cible, en tant que activateur ou répresseur transcriptionnel. En prenant comme modèle le promoteur du gène gp30, nous avons pu démontrer par plusieurs approches que la régulation de ce promoteur inclut la polymérisation de la protéine depuis son site de liaison principal jusqu’à la TATA-box du promoteur. Il s’agit d’un mécanisme de régulation de transcription à distance original et inédit chez les archées. La structure de l’autre régulateur viral étudié, AFV1p06, codé par le virus AFV1 qui infecte Acidianus hospitalis, révèle la présence au sein de cette protéine d’un domaine en doigt de zinc C2H2, considéré jusqu’à présent comme spécifique des eucaryotes. Nous avons démontré la capacité d’AFV1p06 à se lier à l’ADN avec une préférence pour les régions riches en GC. AFV1p06 est la première DNA binding protéine d’archées de ce type caractérisée in vitro. Le troisième régulateur transcriptionnel, Sta1, est codé par le génome des Sulfolobales. Il est capable d’activer la transcription de gènes viraux, ainsi que du gène chromosomique radA en réponse à un dommage à l’ADN. Pour comprendre son rôle dans la cellule, nous avons tenté de réaliser, sans succès, un mutant knock-out du gène sta1 de S. islandicus RYE15A, ce qui indique que le gène sta1 serait un gène essentiel. L’étude de l’interaction hôte-virus sur le modèle S. islandicus LAL14/1 est un des sujets principaux de notre laboratoire. Le séquençage du génome de cette souche a ouvert la voie pour établir un système génétique. Plusieurs mutants KO de LAL14/1 (pyrEF-; ΔCRISPR1) ont été construits. L’impossibilité d’inactiver un autre gène candidat, topR2, codant pour une réverse gyrase, indique qu’il s’agit d’un gène essentiel. La construction du mutant ΔCRISPR1 est la première étape pour obtenir un dérivé de LAL14/1 dépourvu de système CRISPR, un mutant très utile pour mieux comprendre l’implication des CRISPRs dans le phénotype de résistance de LA14/1 au virus SIRV1 et leur rôle chez les archées en général. L’ensemble des résultats de cette thèse contribue à la meilleure compréhension du fonctionnement moléculaire chez les archées et leurs virus. / In Archaea cells all information processes, including transcription, are performed by the Eukarya-like proteins. While the transcriptional machinery of archaea has been well characterized structurally and functionally, very few information concerning the regulation of its activity is available. By working with both cell (crenarchaeota Sulfolobus islandicus) and viral models, we have performed an in-depth study of three transcriptional regulators: two viral regulators, SvtR and AFV1p06, and a cell regulator Sta1. The obtained results allow to better understand the mechanisms of transcriptional regulation in archaea. Concerning the protein SvtR encoded by the virus SIRV1 that infects S. islandicus, we continued the research project that had identified its structure and function. We were focused on identification and characterization of all of SvtR targets in the viral genome and on the study of the mechanisms of regulation. For this purpose, we established the sequence of consensus site recognized by SvtR using systematic mutagenesis of one of its previously characterized binding sites. This site is present in the promoters of 10 genes meaning that SvtR may regulate the activity of more than 20% of SIRV1 genes. Its targets include all known genes encoding proteins of the viral capsid. Functional analysis of SvtR has demonstrated that, according to the target, this protein is a versatile regulator acting as transcriptional activator or repressor. Taking as a model the gp30 gene promoter, we demonstrated by several approaches that regulation of this promoter includes the polymerization of the protein from its primary binding site towards the TATA-box. Such a mechanism of transcriptional regulation is new in archaea. Second, we performed a structural analysis of the protein AFV1p06 encoded by the virus AFV1 which infects Acidianus hospitalis. The structural analysis of AFV1p06 revealed the presence of a C2H2 zinc finger domain regarded hitherto as specific to eukaryotes. We demonstrated that AFV1p06 has ability to bind specifically to DNA sequences rich in GC. AFV1p06 is the first archaeal DNA binding protein with zinc finger domain characterized in vitro. The third transcriptional regulator, Sta1 is encoded by the genome of Sulfolobales. The protein RadA is able to activate the transcription of viral as well as chromosomal genes in response to DNA damage. To understand its role in the cell, we attempted, without success, to knockout the sta1 gene in S. islandicus RYE15A. This result indicates that the sta1 gene is probably essential. The strain S. islandicus LAL14 /1 is a model strain to study host-virus interaction in archaea. The sequencing of the genome of this strain opened the way to establish a genetic system for this model and allowed us to construct knockout mutants for several LAL14/1 genes (pyrEF-; ΔCRISPR1). Our unsuccessful attempts to inactivate topR2, another candidate gene encoding reverse gyrase indicate that topR2 function could be essential. The construction of the ΔCRISPR1 mutant opens the way to obtain a derivative of LAL14/1 entirely lacking the CRISPR system. Such a mutant will be very useful for the future studies of function and role of CRISPRs in archaea in general but also will allow to verify the hypothesis of involvement of CRISPRs in the phenotype of resistance of LA14/1 to SIRV1. All the results of this thesis contribute to an improved understanding of molecular mechanisms in archaeal cells and their viruses.

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Protein phosphorylation constitutes an important mechanism for cellular regulation in both Eucarya and Bacteria. All living organisms evolved from a common progenitor; this implies that protein phosphorylation as a means of regulation also exists in Archaea. Previously, in the sulfur-dependent archaeon Sulfolobus solfataricus a gene was cloned encoding a protein-serine/threonine phosphatase that was similar to eucaryal protein-serine/threonine phosphatases type 1, 2A, and 2B. To identify protein phosphatases in other archaeons, oligonucleotides encoding conserved regions of eucaryal protein-serine/threonine phosphatases were used in the polymerase chain reaction to amplify genomic DNA from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. From the PCR reaction a fragment of DNA was isolated that encoded a portion of a protein phosphatase. Using this DNA fragment as a probe, the entire phosphatase gene was isolated. The amino acid sequence of the phosphatase encoded by this gene displayed greater than 30% identity with eucaryal protein-serine/threonine phosphatase type 1. The gene encoding the Methanosarcina phosphatase was expressed in Escherichia coli. The expressed protein exhibited protein serine phosphatase activity that was sensitive to inhibitors of eucaryal phosphatases such as okadaic acid, microcystin, calyculin, and tautomycin. In order to identify potential endogenous substrates of archaeal protein-serine/threonine phosphatases and kinases, a study was initiated to characterize the most prominent phosphoproteins in S. solfataricus. Cell extracts were incubated with [γ-³²P] ATP, MgCl₂, and MnCl₂, and the proteins in the extracts were separated by SDS-PAGE. Autoradiography of the gels revealed four prominent phosphoproteins with apparent molecular masses of 35, 46, and 50 kDa. N-terminal sequence analysis and enzymatic assays of the 35 kDa phosphoprotein identified this phosphoprotein as the a-subunit of succinyl-CoA synthetase. N-terminal sequence analysis and enzymatic assays revealed that the 50 kDa phosphoprotein was a hexosephosphate mutase. Neither the 50 kDa nor the 35 kDa phosphoprotein appeared to be the target of protein kinases or phosphatases. Therefore, while protein-serine phosphatases exist in Archaea, the targets of these phosphatases have yet to be determined. / Ph. D.

L'objectif est de produire un antioxydant puissant, l'acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (3,4-DHPA) à partir de la L-tyrosine chez l'archée hyperthermophile et acidophile, Sulfolobus solfataricus 98/2. Les microorganismes extrêmophiles possèdent des enzymes particulièrement résistantes et intéressantes pour l'industrie.Des cultures ont donc été réalisées en fermenteur contrôlé dans 4 conditions : (i) en présence de glucose avec ou sans L-tyrosine, (ii) en présence de phénol avec ou sans L-tyrosine. Il a été montré que le 3,4-DHPA est synthétisé seulement en présence de phénol et de L-tyrosine. Les gènes codant pour les enzymes impliquées dans cette voie métabolique et potentiellement responsables de la synthèse du 3,4-DHPA ont été identifiés par homologie de séquence chez cette archée.Des études transcriptomiques et protéomiques ont donc été initiées pour confirmer ces hypothèses et tenter de caractériser les enzymes impliquées dans ces voies métaboliques. Plusieurs toluène-4-monooxygénases (T4MO) et une catéchol 2,3-dioxygénase, impliquées dans le métabolisme du phénol et potentiellement dans la voie de dégradation de la L-tyrosine ont été identifiées. Leur production est soumise à une régulation transcriptionnelle dépendant de la présence de phénol. L'analyse des régions génomiques correspondantes a permis de mettre en évidence une région consensus qui pourrait être impliquée dans la fixation d'un facteur de transcription lors de la régulation par le phénol. Ces différentes études ont permis, de déterminer d'une part dans quelles conditions le 3,4-DHPA est synthétisé, d'autre part d'identifier les enzymes qui interviendraient dans le métabolisme de la L–tyrosine. / The aim is to produce a powerful antioxidant, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHPA) from L-tyrosine in the hyperthermophilic and acidophilus archaea, Sulfolobus solfataricus 98/2. Extremophiles microorganisms have resistant enzymes and interesting for industry. Cultures have been carried out in controlled bioreactor four conditions: (i) in the presence of glucose with or without L-tyrosine, (ii) in the presence of phenol with or without L-tyrosine. It has been shown that 3,4-DHPA is synthesized only in the presence of phenol and L-tyrosine. The genes encoding enzymes involved in the metabolic and potentially responsible for the synthesis of 3,4-DHPA pathway have been identified by sequence homology in S. solfataricus.Des transcriptomic and proteomic studies have therefore been initiated to confirm these hypothesis and attempt to characterize the enzymes involved in these pathways. Several toluene-4-monooxygenase (T4MO) and catechol 2,3-dioxygenase involved in the metabolism of phenol and potentially in the degradation pathway of L-tyrosine were identified. Their production is subjected to a dependent transcriptional regulation of the presence of phenol. The analysis of the corresponding genomic regions has highlighted a consensus region that could be involved in the binding of a transcription factor in the regulation of phenol. These studies helped to determine the one hand the conditions under which 3,4-DHPA is synthesized, secondly to identify enzymes that intervene in the metabolism of L-tyrosine.

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Chez les Archaea, tous les processus informationnels, transcription incluse, sont effectués par des protéines proches de celles des Eukarya. Alors que la machinerie transcriptionnelle des archées a été bien caractérisée structurellement et fonctionnellement, très peu d'informations sont disponibles sur la régulation de son activité. En travaillant à la fois avec des modèles cellulaires (crénarchée hyperthermophile Sulfolobus islandicus) et viraux, nous avons pu réaliser une étude approfondie de trois régulateurs transcriptionnels et mieux comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez les archées. Au cours de cette thèse, deux régulateurs viraux, SvtR et AFV1p06, et un régulateur cellulaire, Sta1, ont été étudiés. Concernant SvtR, codé par le virus SIRV1 qui infecte S. islandicus, nous avons poursuivi la recherche précédente, qui avait permis de déterminer sa structure et sa fonction, en nous focalisant sur la caractérisation de l'ensemble de ses cibles dans le génome viral et sur l'étude de son mécanisme d'action. Pour cela, la séquence du site consensus reconnu par SvtR a été établie à l'aide de la mutagénèse systématique d'un de ses sites déjà caractérisés. Ce site est présent dans les promoteurs de dix gènes de SIRV1 montrant que SvtR pourrait réguler l'activité de plus de 20% des gènes viraux. Ses cibles incluent tous les gènes codant pour les protéines de la capside virale. L'analyse fonctionnelle réalisée sur une partie des sites de liaison de SvtR a permis de démontrer qu'il s'agit d'un régulateur polyvalent agissant, selon la cible, en tant que activateur ou répresseur transcriptionnel. En prenant comme modèle le promoteur du gène gp30, nous avons pu démontrer par plusieurs approches que la régulation de ce promoteur inclut la polymérisation de la protéine depuis son site de liaison principal jusqu'à la TATA-box du promoteur. Il s'agit d'un mécanisme de régulation de transcription à distance original et inédit chez les archées. La structure de l'autre régulateur viral étudié, AFV1p06, codé par le virus AFV1 qui infecte Acidianus hospitalis, révèle la présence au sein de cette protéine d'un domaine en doigt de zinc C2H2, considéré jusqu'à présent comme spécifique des eucaryotes. Nous avons démontré la capacité d'AFV1p06 à se lier à l'ADN avec une préférence pour les régions riches en GC. AFV1p06 est la première DNA binding protéine d'archées de ce type caractérisée in vitro. Le troisième régulateur transcriptionnel, Sta1, est codé par le génome des Sulfolobales. Il est capable d'activer la transcription de gènes viraux, ainsi que du gène chromosomique radA en réponse à un dommage à l'ADN. Pour comprendre son rôle dans la cellule, nous avons tenté de réaliser, sans succès, un mutant knock-out du gène sta1 de S. islandicus RYE15A, ce qui indique que le gène sta1 serait un gène essentiel. L'étude de l'interaction hôte-virus sur le modèle S. islandicus LAL14/1 est un des sujets principaux de notre laboratoire. Le séquençage du génome de cette souche a ouvert la voie pour établir un système génétique. Plusieurs mutants KO de LAL14/1 (pyrEF-; ΔCRISPR1) ont été construits. L'impossibilité d'inactiver un autre gène candidat, topR2, codant pour une réverse gyrase, indique qu'il s'agit d'un gène essentiel. La construction du mutant ΔCRISPR1 est la première étape pour obtenir un dérivé de LAL14/1 dépourvu de système CRISPR, un mutant très utile pour mieux comprendre l'implication des CRISPRs dans le phénotype de résistance de LA14/1 au virus SIRV1 et leur rôle chez les archées en général. L'ensemble des résultats de cette thèse contribue à la meilleure compréhension du fonctionnement moléculaire chez les archées et leurs virus.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and associated (Cas) proteins form the basis of a prokaryotic adaptive immune system. Acquired sections of viral DNA are stored within the host genome as ‘spacers' flanked by ‘repeat' sequences. The CRISPR arrays are transcribed and processed to release mature CRISPR RNAs (crRNAs) – containing a single, intact spacer sequence – that are used by effector complexes to base-pair with matching hostile genetic elements and silence future infections. crRNA-biogenesis is thus an essential step within the defence pathway. Within Type I and III systems, the primary processing of the CRISPR transcript at repeat sites is performed almost exclusively by the CRISPR-specific riboendonuclease, Cas6. This thesis seeks to probe the catalytic mechanism of a Cas6 enzyme from the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus (sso). Despite analogous generation of crRNA, ssoCas6 paralogues differ from previously characterised Cas6 examples in their lack of a canonical active site histidine residue. The work here builds on recent crystallographic evidence that the ssoCas6-1 paralogue unexpectedly adopts a dimeric conformation (PDB 3ZFV, 4ILR), to show that not only is the ssoCas6-1 dimer stable in solution but that this atypical arrangement is important to the activity of this particular enzyme. Furthermore, the ssoCas6-1 paralogue is shown to be the first in this family of endonucleases to employ multiple-turnover kinetics. The widespread diversity in Cas6 catalytic mechanisms reflects the plastic nature of the Cas6 active site and rapid co-evolution with substrate repeat sequences. The CRISPR/Cas environment within S. solfataricus is highly complex, containing three co-existing system types (Type I-A, III-A, III-B), five Cas6 paralogues and two families of CRISPR loci (AB and CD) that differ by repeat sequence. By probing the activity of an additional ssoCas6 paralogue (ssoCas6-3), which reveals different substrate specificities to those of ssoCas6-1, evidence emerges for functional coupling between ssoCas6 paralogues and downstream effector complexes, sufficient to regulate crRNA uptake and possibly even complex assembly.