La leucémie aiguë promyélocytaire (APL) est un cancer des globules blancs qui se caractérise par l’accumulation de granulocytes immatures appelés promyélocytes. Dans la majorité des cas, la maladie est causée par la translocation réciproque des gènes RARα et PML, menant à l’expression de la protéine de fusion PML/RARα qui compromet à la fois les fonctions assurées normalement par RARα et par PML. Ainsi, la répression de la transcription des gènes cibles de RARα et la perturbation de la formation des corps nucléaires PML seraient la cause de la non-différenciation et de la survie par inhibition de l’apoptose des promyélocytes. Un des agents thérapeutiques utilisés dans le traitement de la maladie est le trioxyde d’arsenic (ATO) et malgré le fait que son efficacité soit prouvée, les mécanismes moléculaires par lesquels il exerce son action ne sont pas entièrement caractérisés. PML étant SUMOylée en réponse à l’ATO, nous avons émis l’hypothèse que d’autres protéines pourraient être régulées dans leurs modifications post-traductionnelles (PTMs) en réponse à l’agent thérapeutique et pourraient occuper un rôle dans le processus de guérison. Une analyse par protéomique quantitative de cellules HEK293 traitées à l’ATO a permis d’identifier 92 protéines significativement régulées en SUMOylation, incluant certains substrats connus de la caspase-3. Suite à cette observation, nous avons supposé que la SUMOylation pourrait protéger les substrats de la caspase-3 de leur clivage protéolytique. À l’aide d’essais in vitro et d’immunobuvardages, nous avons confirmé que la SUMOylation de PARP1 empêche son clivage par la caspase-3, ce qui pourrait jouer un rôle dans le destin cellulaire. / Acute promyelocytic leukemia (APL) is a cancer of white blood cells characterized by the accumulation of immature granulocytes called promyelocytes. In most cases, the disease is caused by the reciprocal translocation of the RARα and PML genes, leading to the expression of the PML/RARα fusion protein that compromises both the functions normally provided by RARα and by PML. Thus, repression of the transcription of RARα target genes and disruption of the formation of PML nuclear bodies may cause the non-differentiation of promyelocytes and the promotion of their survival by inhibition of apoptosis. One of the therapeutic agents used to treat the disease is arsenic trioxide (ATO) and despite the fact that its effectiveness is proven, the molecular mechanisms through which it exerts its action are not fully characterized. Since PML is SUMOylated in response to ATO, it is likely that other proteins may also exhibit changes in their post-translational modifications (PTMs) and play a role in the response. By using large-scale proteomic workflows on HEK293 cells following ATO treatment, we identified 92 proteins that shown significant changes in SUMOylation, including some known capase-3 substrates. Following this observation, we surmised that SUMOylation may protect these substrates from caspase-3 cleavage. Using in vitro assays and immunoblots, we confirmed that SUMOylation of PARP1 prevents its cleavage by caspase-3, an event that could mediate cell fate.

Protein SUMOylation is a highly dynamic and reversible post-translational modification that targets lysine residues on a wide range of proteins involved in several essential cellular events, including protein translocation and degradation, mitotic chromosome segregation, DNA damage response, cell cycle progression, cell proliferation, and migration. Protein SUMOylation is an ATP-dependent enzymatic process that involves an E1 activating enzyme SAE1/2, a E2 conjugase UBC9, and usually facilitated by SUMO E3 ligases. The SP-RING family is the largest family of SUMO E3 ligases, encompassing seven mammalian protein inhibitor of activated STAT (PIAS) proteins. PIAS family was originally identified as specific inhibitors for signal transducer and activator of transcription (STAT), which involves gene transcriptional regulation. Recent studies showed that PIAS proteins also play important roles in the regulation of protein stability and signal transduction through the SUMOylation of target substrates. In addition, PIAS-mediated protein SUMOylation is also involved in several cellular processes, including DNA damage repair, immune response, cellular proliferation, and motility. Most notably, PIAS proteins are highly expressed in different cancer types and have been implicated in tumorigenesis. Several reports suggest that PIAS proteins could promote cancer cell growth and progression by regulating the SUMOylation of different substrates. To date, a number of substrates of PIAS ligases have been identified from several individual studies, and hundreds of specific SUMO E3 ligase substrates were identified from a human proteome microarray-based activity screen. However, how these substrates are selected, and which SUMOylation sites are targeted by these PIAS are still unknown. To answer these questions, I started my investigation with PIAS1, one of the most well studied SUMO E3 ligases. By changing the expression level of PIAS1 in HeLa cells using gene overexpression or CRISPR/Cas9 gene knockout, I found PIAS1 had a physiological impact on cell proliferation and migration. I took advantage of the previously developed SUMO proteomics workflow to quantitatively profile global SUMOylome changes upon PIAS1 overexpression in a site-specific manner. I identified 983 SUMO sites on 544 proteins, of which 62 proteins were assigned as putative PIAS1 substrates. In particular, Vimentin (VIM), a type III intermediate filament protein involved in cytoskeleton organization and cell motility, was identified as PIAS1 substrates. Two SUMOylation sites mediated by PIAS1 at Lys-439 and Lys-445 residues were further evaluated and found to be necessary for dynamic disassembly and assembly of vimentin intermediate filaments, which further regulates cell migration and motility. In the second study, I extended my investigation to all PIAS ligases and further found that all PIAS proteins impact cell proliferation and migration of breast cancer cell MDA-MB-231 after CRISPR/Cas9 gene knockout. I further optimized my SILAC-based quantitative SUMO proteomics approach and combined it with transcriptomics to gain a system-level understanding of the functional components involved in PIAS regulatory networks. A large subset of proteins/ genes involved in cell proliferation and migration were commonly regulated by all PIAS proteins, suggesting a redundancy of regulation within the PIAS family. In addition, each PIAS regulated a unique pool of substrates/genes involved in different cellular processes, such as DNA damage repair, chromatin remodeling, and SUMO chain formation, suggesting that each PIAS specifically regulates cellular functions. The trans-scale analyses between proteomics and transcriptomics shed light on the comprehensive pictures of the regulation networks by PIAS proteins beyond their direct enzymatic activity. Overall, the quantitative SUMO proteomics approach provided a robust method for identifying substrates of PIAS SUMO E3 ligases. The combination of proteomic and transcriptomic analyzes made it possible to draw up a global portrait of the regulatory mechanisms governed by the PIAS proteins. / La SUMOylation des protéines est une modification post-traductionnelle se produisant sur des lysines d’un large éventail de protéines cellulaires. Cette modification est dynamique et régit plusieurs évènement cellulaires essentiels, dont la translocation et la dégradation des protéines, la ségrégation chromosomique mitotique, la réparation de l'ADN, la progression du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la migration. La conjugaison de la protéine SUMO sur son substrat se produit grâce à une triade enzymatique regroupant l’enzyme d’activation E1 SAE 1/2, la conjugase E2 UBC9 et dans la plupart des cas une ligase SUMO E3. Cette cascade enzymatique nécessite une source d’ATP pour son initiation. Parmi la famille des ligases SUMO E3, on retrouve un domaine spécifique nommé SP-RING présent chez une sous population de celles-ci. Parmi ces ligases on retrouve 7 protéines inhibitrices des protéines STAT activées regroupees sous le nom de PIAS. Les ligases PIAS ont été identifiées à l'origine comme des inhibiteurs spécifiques des protéines STAT responsable du signal de transduction et de l’activation de la transcription génique. Des études récentes ont montré que les protéines PIAS jouent également un rôle important sur la stabilité de leurs substrats et la transduction de leur signal. De plus, les substrats SUMOylés par les PIAS sont impliqués dans plusieurs processus cellulaires, notamment la réparation des dommages à l'ADN, la réponse immunitaire, la prolifération et la motilité cellulaire. Ces divers processus cellulaires peuvent être déréglés et entrainer le développement du cancer. Il s’avère que les protéines PIAS sont fortement exprimées dans divers types de cancer et sont impliquées dans la tumorigenèse. Plusieurs rapports suggèrent que les protéines PIAS pourraient favoriser la croissance et la progression des cellules cancéreuses en régulant le niveau de SUMOylation de plusieurs substrats. Initialement, les substrats des ligases PIAS ont été identifiés à partir de plusieurs études individuelles et plus récemment, des centaines de substrats spécifiques de la SUMO E3 ligase ont été identifiés à partir de criblage de micropuces à protéines interrogeant le protéome humain. Cependant, la manière dont ces substrats sont sélectionnés et quels sont les sites de SUMOylation ciblés par ces PIAS demeurent encore méconnus. Afin d’aborder ces questions, j’ai commencé mon étude avec PIAS1, l'une des ligases SUMO E3 les plus étudiées. Pour ce faire, j’ai varié le niveau d'expression de PIAS1 dans des cellules iv HeLa selon l’approche CRISPR/Cas9. Ainsi, deux modèles ont été construit, soit via une surexpression du gène ou via un knockout du gène. Ces mutants ont permis de constater que PIAS1 avait un impact physiologique sur la prolifération et la migration des cellules. J’ai tiré avantage d’une méthode protéomique précédemment développé sur les peptides SUMO pour déterminer les changements de SUMOylation lors de la surexpression de PIAS1. J’ai identifié 983 sites SUMO sur 544 protéines, dont 62 protéines ont été identifiées comme substrats potentiels de PIAS1. Parmi celles-ci, la vimentine (VIM), une protéine de la famille des filaments intermédiaire de type III impliquée dans l'organisation du cytosquelette et la motilité cellulaire, a été reconnu comme un substrat de PIAS1. Afin de valider le rôle de la SUMOylation des lysines Lys-439 et Lys-445 de VIM j’ai effectué des études fonctionelles de motilité cellulaire avec les mutants où ces sites ont été substitués en arginine. Ces expériences m’ont permis de constater que la SUMOylation de VIM aux sites Lys-439 et Lys-445 est nécessaire à l’assemblage et désassemblage dynamique des filaments intermédiaires de VIM, lesquels regulent la migration et la motilité cellulaire. Dans la deuxième étude, j’ai élargi mon recherche sur toutes les ligases PIAS et avons découvert que ces dernières avaient toutes un impact sur la prolifération cellulaire et la migration des cellules du cancer du sein MDA-MB-231 suite à un knockout de ces gènes par CRISPR / Cas9. De plus, j’ai optimisé mon approche de protéomique quantitative SUMO via SILAC et l'avons complémenté d’une analyse transcriptomique. Cette combinaison a permis d’acquérir une compréhension des composants fonctionnels impliqués dans les réseaux de régulation PIAS. Il s’avère qu’un grand sous-ensemble de gènes / protéines impliqués dans la migration et la prolifération des cellules sont régulés par tous les membres de la famille PIAS, et suggère une certaine redondance fonctionnelle parmi ces ligases. De plus, chaque PIAS régule un ensemble unique de substrats / gènes impliqués dans plusieurs processus cellulaires différents, tels que la réparation des dommages de l'ADN, le remodelage de la chromatine et la formation de la chaîne SUMO. Ces résultats suggèrent que chacune des PIASs régule de façon spécifique les fonctions cellulaires. La combinaison des analyses protéomiques et transcriptomiques ont permi de dresser un portrait global des mécanismes de régulation régit par les protéines PIAS et ce au-delà de leur activité enzymatique directe.

NUR77 est un récepteur nucléaire (RN) orphelin impliqué dans la régulation de processus biologiques dont la mort cellulaire, notamment dans la maladie de Parkinson (MP), découlant de la perte de neurones dopaminergiques, et dans le cancer du sein, résultant de la prolifération de cellules mammaires. NUR77 est impliqué dans le déclenchement et la protection de la mort cellulaire et son activité serait indépendante de la liaison d’un ligand. Nous avons émis l’hypothèse que l’activité de NUR77 est influencée par ses modifications post-traductionnelles (MPTs) et ses partenaires d’interactions. L’objectif général de cette thèse était de caractériser les MPTs et les partenaires d’interaction modulant l’activité de NUR77, dans des modèles de cellules en culture, afin de mieux comprendre ses fonctions biologiques - notamment dans la mort cellulaire. Le premier objectif de ce doctorat était de caractériser le rôle de la SUMOylation, une modification modulant l’activité des RN, chez NUR77, par des essais rapporteurs dans les cellules Human Embryonic Kidney 293 (HEK293). La surexpression de la E3 SUMO ligase PIASγ et/ou de l’isoforme 2 de la SUMO, protéines importantes dans la régulation de la SUMOylation chez les RN, a engendré un effet répresseur sur l’activité transcriptionnelle de NUR77. L’effet de PIASγ sur l’activité de NUR77 est modulé par la Sentrin SUMO-specific protease 1, qui hydrolyse la liaison des SUMO. Les mutations des résidus lysine dans des sites consensus de SUMOylation, de NUR77 (K102 et K577), empêchant cette MPT, ont causé des effets opposés sur son activité transcriptionnelle, suggérant le recrutement différent de corégulateurs de la transcription. Ces résultats combinés indiquent que la SUMOylation et les PIASγ et SUMO2 sont, respectivement, une MPT et des corégulateurs importants dans l’activité de NUR77. Le deuxième objectif de cette thèse était de caractériser l’interactome de NUR77 dans des HEK293 vivantes afin d’identifier les interacteurs pouvant moduler son activité, à l’aide d’une méthode de marquage des protéines proximales avec la biotine basée sur la peroxydase APEX2, combinée à la spectrométrie de masse. Ce procédé a identifié 336 potentiels interacteurs de NUR77, dont plusieurs connus. Des essais de coimmunoprécipitation et de coimmunofluorescence menés dans les HEK293 et dans les cellules du cancer du sein MCF-7 ont montré, respectivement, que la protéine régulatrice de l’apoptose Apoptosis Inhibitor 5 (API5), interagissait et colocalisait avec NUR77. La privation de sérum dans le milieu de culture des cellules et la diminution de l’expression de API5 a conduit à une augmentation des niveaux protéiques et de l’activité de NUR77 et à une diminution de la survie cellulaire. Ces données suggèrent que API5 constitue un régulateur de NUR77 dans les voies de signalisation associées à la mort cellulaire et que cette interaction pourrait constituer une cible pour moduler l’apoptose. Elles valident également l’approche d’identification d’interacteurs de NUR77. Les travaux de cette thèse ont donc permis de générer des outils pour caractériser l’activité de NUR77 et ont révélé des corégulateurs de cette activité. La poursuite de ces projets pourrait révéler le caractère opportun de cibler NUR77 comme modulateur de la mort cellulaire, notamment dans la MP et le cancer du sein. / NUR77 is an orphan nuclear receptor (NR) involved in the regulation of multiple cell biology processes including cell death, in particular in Parkinson's disease (PD), which results of the loss of dopaminergic neurons, and in breast cancer (BC), which is caused by the proliferation of mammary epithelial cells. NUR77 is involved in triggering and inhibiting cell death and its activity is believed to be independent of a ligand binding. We hypothesized that the regulation of NUR77 activity does not occur through a ligand, but through the influence of its post-translational modifications (PTMs) and its interaction partners. The general objective of this PhD project was to characterize the PTMs and the interacting partners that modulate the activity of NUR77 in cultured cell models, to better understand its physiological roles, in particular in the regulation of cell death. The first objective of this thesis was to characterize the role of SUMOylation, a modification that regulates NR activity, in regulating NUR77 transcriptional activity in reporter assays in Human Embryonic Kidney (HEK293) cells. Overexpression of the E3 SUMO ligase PIASγ or/and the isoform 2 of SUMO, both important regulators in SUMOylation of the NUR77 homolog NURR1, produced a repressive effect on the transcriptional activity of NUR77. The effect of PIASγ on the activity of NUR77 was shown to be modulated by the Sentrin SUMO-specific protease 1 protein, which removes SUMO tags on target proteins. In addition, mutations of lysine residues in SUMO consensus sites in NUR77 (K102 and K577) had opposite effects on its transcriptional activity, suggesting different recruitment of coregulators of transcription in the regions. The combination of these results indicates that SUMOylation is an important PTM for the regulation of NUR77 activity and that PIASγ and SUMO2 proteins are important transcriptional coregulators of NUR77. The second objective of this thesis was to evaluate NUR77 interactome in HEK293 living cells to identify the interactors that can modulate its activity, using a biotin-labelling method for proximal proteins based on the APEX2 peroxidase combined with mass spectrometry. This approach identified 336 potential interactors of NUR77, some that are consistent with the literature. Coimmunoprecipitation and coimmunofluorescence assays carried out in HEK293 cells and in MCF-7 breast cancer cell line have shown that the regulator of apoptosis Apoptosis Inhibitor 5 vi (API5), interacted and colocalized with NUR77. By depriving cells of serum and decreasing API5 expression, increased protein levels and activity of NUR77 was observed, as well as a decrease in cell viability. These data support that API5 is a regulator of NUR77 in its involvement in signalling pathways associated with cell death and that this interaction could be a target for modulating apoptosis. More generally, they validate the APEX2 tool which can be used to identify novel NUR77 interactors. In conclusion, the work of this thesis resulted in the generation of tools to better understand the activity of NUR77 and revealed important coregulators in this activity. The continued characterization of these interactors may provide opportunities to target NUR77 as a regulator of cell death, particularly in PD and in breast cancer.

Deux tiers des cancers du sein expriment le récepteur des œstrogènes alpha (ERα), un facteur de transcription ligand dépendant responsable de la prolifération oncogénique de ces cellules. Ces tumeurs, dites ER positives (ER+), bénéficient de thérapies endocrines comme les antiœstrogènes (AE). Les AE sont des ligands compétitifs de ERα qui inhibent son activité transcriptionnelle. Le tamoxifène est l’antiœstrogène le plus utilisé en première ligne de traitement chez les patientes ayant un cancer du sein ER+. Malgré un bon pronostique initial, plus du tiers d’entre elles finiront par développer une résistance, parfois après de nombreuses années. L’absence de résistance croisée avec le tamoxifène place le fulvestrant comme seul dé-régulateur sélectif de ER (SERD) autorisé en clinique contre les tumeurs mammaires avancées résistantes. Malgré son profil antagoniste pur, le fulvestrant ne s’est pas révélé supérieur au tamoxifène en première ligne de traitement, cela étant attribué à sa faible biodisponibilité. D’autres SERD oralement disponibles sont en cours d’évaluation clinique. Des mutations du gène ESR1 (ERα) sont retrouvées dans environ 20% des tumeurs avancées résistantes à l’hormonothérapie et contribuent à la résistance au fulvestrant. Les mutations sont toutes retrouvées dans le domaine de liaison au ligand. La maladie progressera éventuellement avec le développement de métastases qui sont incurables. Il est donc crucial de (1) comprendre les mécanismes moléculaires médiant l’antiestrogénicité pure et l’impact des altérations génétiques impliquées dans la résistance aux AE pour (2) développer des thérapies ciblées plus efficaces qui pourraient lutter contre les tumeurs avancées résistantes. Les résultats prometteurs de plusieurs études in vitro et en clinique combinant un AE avec un inhibiteur d’histones désacétylases (HDACi) ont mené à la création de molécules hybrides combinant les deux fonctionnalités en une seule molécule. Nos travaux montrent que ces molécules hybrides dérivées du tamoxifène démontrent des propriétés inhibitrices améliorées par l’ajout d’un groupe fonctionnel inhibiteur des HDAC sur le squelette du tamoxifène. Ces composés sont antagonistes contre ERα et plusieurs HDAC et l’un d’eux possède une activité antiproliférative accrue par rapport aux composés parentaux dans les cellules de cancer du sein ER+ MCF-7. Notre étude fournit une preuve de concept que la combinaison d’une fonction pharmacologique HDACi sur le noyau d’un AE est prometteuse. Afin de mieux comprendre les déterminants moléculaires liés à l’induction de la SUMOylation de ERα et l’inhibition de son activité transcriptionnelle par le fulvestrant, nous avons testé l’impact de différentes mutations sur l’activité de plusieurs SERD, comprenant le fulvestrant. Nos résultats valident l’importance du résidu L536 dans la SUMOylation et la répression transcriptionnelle de ERα en réponse aux SERD. Les mutations ponctuelles L536P, Q et R, trouvées en clinique, compromettent la réponse au fulvestrant et à une sélection de SERD oraux in vitro. En résumé, nos résultats participent à une meilleure compréhension des caractéristiques moléculaires liées au mécanisme d’action du fulvestrant et de plusieurs SERD oraux de nouvelle génération. L’ensemble de nos résultats devraient aider au développement de nouvelles molécules plus efficaces contre les tumeurs résistantes, y compris des composés avec une double fonction inhibitrice AE-HDACi. / Two thirds of breast tumors are classified as positive for estrogen receptor alpha (ERα), a ligand-dependent transcription factor driving breast cancer cell proliferation. ER-positive (ER+) tumors benefit from endocrine therapies such as antiestrogens (AE). AE compete with ERα natural ligands and inhibit its transcriptional activity. Tamoxifen is the gold-standard for antiestrogenic therapy in patients with primary ER+ breast cancer. Despite a good initial prognosis, more than one-third will eventually develop resistance, sometimes after long periods of latency. Fulvestrant, known as a “pure” AE, is the only selective ER deregulator (SERD) approved in advanced breast cancer even after development of resistance to tamoxifen. Despite its pure antagonistic profile, fulvestrant has not proven superior to tamoxifen in first-line treatment, which is attributed to poor pharmacological properties. New generation SERDs with orally bioavailable properties are currently tested in the clinic. Mutations of ERα are found in about 20% of hormone-resistant advanced tumors and contribute to resistance to fulvestrant. The mutations are all located in the ligand binding domain. Resistant tumors will eventually progress and develop metastases which are deadly. It is therefore crucial to (1) understand the molecular determinants of pure antiestrogenicity and the impact of genetic alterations involved in AE resistance to (2) develop treatments with improved cytotoxic activities to achieve a more efficient suppression of advanced tumors. Promising results from several in vitro and clinical studies combining an AE with a histone deacetylase inhibitor (HDACi) have led to the design of hybrid molecules combining both functionalities into a single molecule. Our work shows that tamoxifen-derived hybrids display properties by the addition of an HDAC inhibitory functional group (HDACi) on the tamoxifen backbone. These compounds have inhibitory activities against ERα and several HDACs. One hybrid exhibits an improved cytotoxic activity against ER+ MCF-7 breast cancer cells compared to parental molecules. Our study provides proof of concept that combining HDACi function to the core of an AE is promising. To better understand the molecular determinants related to the induction of ERα SUMOylation and transcriptional repression by fulvestrant, we evaluated the impact of different mutations on the activity of several SERDs, including fulvestrant. Our results validate the importance of residue L536 in SUMOylation and transcriptional repression of ERα in response to SERDs. L536P, Q, and R point mutations are found in the clinic compromise the response to fulvestrant and to several oral SERDs in vitro. In summary, our results give better insights into the mechanism of action of fulvestrant and new generation oral SERDs and on the impact of naturally occurring mutations on transcriptional responses to these AE. Taken together, our results should help in the design of more efficient molecules, including compounds with dual AE-HDACi inhibitory function.

No / Phosphorylation or SUMOylation of the kainate receptor (KAR) subunit GluK2 have both individually been shown to regulate KAR surface expression. However, it is unknown whether phosphorylation and SUMOylation of GluK2 are important for activity-dependent KAR synaptic plasticity. We found that protein kinase C-mediated phosphorylation of GluK2 at serine 868 promotes GluK2 SUMOylation at lysine 886 and that both of these events are necessary for the internalization of GluK2-containing KARs that occurs during long-term depression of KAR-mediated synaptic transmission at rat hippocampal mossy fiber synapses. Conversely, phosphorylation of GluK2 at serine 868 in the absence of SUMOylation led to an increase in KAR surface expression by facilitating receptor recycling between endosomal compartments and the plasma membrane. Our results suggest a role for the dynamic control of synaptic SUMOylation in the regulation of KAR synaptic transmission and plasticity.

No / The surface expression and regulated endocytosis of kainate (KA) receptors (KARs) plays a critical role in neuronal function. PKC can modulate KAR trafficking, but the sites of action and molecular consequences have not been fully characterized. Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification of the KAR subunit GluK2 mediates agonist-evoked internalization, but how KAR activation leads to GluK2 SUMOylation is unclear. Here we show that KA stimulation causes rapid phosphorylation of GluK2 by PKC, and that PKC activation increases GluK2 SUMOylation both in vitro and in neurons. The intracellular C-terminal domain of GluK2 contains two predicted PKC phosphorylation sites, S846 and S868, both of which are phosphorylated in response to KA. Phosphomimetic mutagenesis of S868 increased GluK2 SUMOylation, and mutation of S868 to a nonphosphorylatable alanine prevented KA-induced SUMOylation and endocytosis in neurons. Infusion of SUMO-1 dramatically reduced KAR-mediated currents in HEK293 cells expressing WT GluK2 or nonphosphorylatable S846A mutant, but had no effect on currents mediated by the S868A mutant. These data demonstrate that agonist activation of GluK2 promotes PKC-dependent phosphorylation of S846 and S868, but that only S868 phosphorylation is required to enhance GluK2 SUMOylation and promote endocytosis. Thus, direct phosphorylation by PKC and GluK2 SUMOylation are intimately linked in regulating the surface expression and function of GluK2-containing KARs.

Human cytomegalovirus (HCMV) is a widespread human herpesvirus pathogen and prototypical member of the β-herpesvirus subfamily. Like all herpesviruses, the virus establishes a lifelong latent infection following host exposure, which has the potential to reactivate periodically and contribute to recurrent disease processes. In individuals with weak or compromised immune systems, such reactivation can lead to profound pathology. Understanding how latent infections are maintained is important for uncovering how HCMV causes disease. The study of viral genes that are expressed during latent infection grants insight into how latency is regulated and how it could be therapeutically targeted. To that end, this project has sought to evaluate the functional significance of one such viral gene termed LUNA in the context of latency. In models of experimental latent infection based on primary myeloid cells, levels of viral gene transcription were found to be significantly reduced following infection with LUNA deletion mutant viruses, consistent with corresponding observable changes in post-translational histone modifications over the viral promoters of latency-associated genes. Additionally, using luciferase reporter systems, latency-associated viral gene promoters became activated in response to the expression of wild-type LUNA. Together, these findings argue for a role of LUNA in regulating viral gene expression during latent HCMV infection. One possible mechanism by which LUNA may fulfil its role is by targeting cellular ND10 structures, known intrinsic inhibitors of herpesvirus gene expression, for disruption. In support of this, latently infected cells were found to be devoid of ND10, a phenotype that was recapitulated by the direct expression of wild-type LUNA. Furthermore, mutation studies confirmed the identification of a novel deSUMOylase activity encoded by LUNA that was responsible for mediating ND10 disruption. Use of a catalytically inactive LUNA mutant in transcriptional analyses of latent infection also generated similar results as with the LUNA deletion viruses. Overall, these data support the hypothesis that LUNA serves as an important regulator of viral gene expression during latency, which is likely linked to its ability to target ND10 structures for disruption, thus raising the possibility that inhibition of deSUMOylation may serve as a novel therapeutic strategy to target latent HCMV infection.

Los cuerpos nucleares de Cajal (CBs) son estructuras nucleares implicadas en la biogénesis de ribonucleoproteínas nucleares y nucleolares de pequeño tamaño (snRNPs y snoRNPs) requeridas para el procesamiento nuclear de pre-mRNAs y pre-rRNAs, respectivamente. El CB concentra la proteína coilina, un marcador molecular de esta estructura, snRNPs, el factor de supervivencia de las neuronas motoras (SNM) y las proteínas que comparte con el nucleolo Nopp140 y fibrilarina. Los CB son estructuras dependientes de transcripción, pero los mecanismos de ensamblaje molecular de estos cuerpos nucleares son poco conocidos.En este estudio se utilizan métodos de inmunofluorescencia, expresión ectópica de proteínas del CB y métodos bioquímicos para analizar la importancia de dos modificaciones postraduccionales, la metilación de la coilina y la conjugación con SUMO1 del factor SMN para el ensamblaje molecular de los CBs. Se ha utilizado la línea celular MCF7 como un modelo de hipometilación endógena debido al déficit del gen MTAP. La hipometilación de la coilina conduce al desensamblaje de los CBs y a la relocalización nucleolar de la coilina no metilada. Este efecto revierte en células transfectadas que expresan el gen MTAPwt, indicando que el grado de metilación de la coilina marca su destino nuclear.Respecto a la importancia de la sumoilación en el ensamblaje de los CBs, hemos demostrado la existencia de un subtipo de CBs que concentran SUMO1 y la conjugasa de SUMO Ubc9. En neuronas, hemos detectado la presencia de SUMO durante la fase de reformación de CBs, en la respuesta al estrés. Los experimentos de inmunoprecipitación confirman la interacción de SUMO-1 con el factor SMN y demuestran que la lisina K119, portadora de una secuencia consenso de sumoilación, es esencial para la regulación del número de CBs. / Cajal bodies (CBs) are nuclear structures involved in the biogenesis of small nuclear and nucleolar ribonucleoproteins (snRNPs and snoRNPs) required for nuclear processing of pre-mRNAs and pre-rRNAs, respectively. CBs concentrate the protein coilin, a molecular marker of this structure, snRNPs, the survival of motor neurons factor (SMN) and proteins shared with the nucleolus Nopp140 and fibrillarin. CBs are transcription-dependent structures, but the mechanisms of molecular assembly of these structures are poorly understood.In this study we used inmunofluorescence, ectopic expresion of CB proteins and biochemical methods to analyze the importance of two posttranslational modifications, methylation of coilin and conjugation of SMN with SUMO1, for the molecular assembly of CBs. The cell line MCF7 has been used as a model of endogenous hypomethylation due to the lack of MTAP gene. Coilin hypomethylation leads to the disassembly of CBs and nucleolar relocation of unmethylated coilin. This effect reverses in transfected cells expressing the gene MTAPwt, indicating that the degree of methylation of coilin directs its nuclear destination.On the importance of sumoylation in the assembly of CBs, we have demonstrated the existence of a subset of CBs which concentrate SUMO1 and the SUMO1 conjugase Ubc9. In neurons, we detected the presence of SUMO1 during the reformation of CBs in response to stress. Immunoprecipitation experiments confirm the molecular interaction of SUMO1 with SMN and demonstrate that lysine 119, carrying the SMN sumoylation consensus sequence, is essential for regulating the number of CBs.

No description available.

No description available.