Le récepteur X des farnésoïdes (FXR) fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires et agit comme un facteur de transcription suite à la liaison d’un ligand spécifique. Le récepteur FXR, activé par les acides biliaires, joue un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et du glucose en plus de réguler l’homéostasie des acides biliaires. Notre laboratoire a récemment mis en évidence une nouvelle voie de régulation du récepteur PPARγ en réponse au récepteur de la ghréline. En effet, la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de PPARγ via une cascade de signalisation impliquant les kinases Erk1/2 et Akt, supportant un rôle périphérique de la ghréline dans les pathologies associées au syndrome métabolique. Il est de plus en plus reconnu que la cascade métabolique impliquant PPARγ fait également intervenir un autre récepteur nucléaire, FXR. Dans ce travail, nous montrons que la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de FXR de manière dose-dépendante et induit également la phosphorylation du récepteur sur ses résidus sérine. En utilisant des constructions tronquées ABC et CDEF de FXR, nous avons démontré que la ghréline régule l’activité de FXR via les domaines d’activation AF-1 et AF-2. L’effet de la ghréline et du ligand sélectif GW4064 sur l’induction de FXR est additif. De plus, nous avons démontré que FXR est la cible d’une autre modification post-traductionnelle, soit la sumoylation. En effet, FXR est un substrat cellulaire des protéines SUMO-1 et SUMO-3 et la sumoylation du récepteur est ligand-indépendante. SUMO-1 et SUMO-3 induisent l’activation transcriptionnelle de FXR de façon dose-dépendante. Nos résultats indiquent que la lysine 122 est le site prédominant de sumoylation par SUMO-1, quoiqu’un mécanisme de coopération semble exister entre les différents sites de sumoylation de FXR. Avec son rôle émergeant dans plusieurs voies du métabolisme lipidique, l’identification de modulateurs de FXR s’avère être une approche fort prometteuse pour faire face à plusieurs pathologies associées au syndrome métabolique et au diabète de type 2. / The farnesoid X receptor (FXR) is a ligand-activated transcription factor within the nuclear receptor superfamily. FXR is activated by bile acids and plays a crucial role in the regulation of glucose and lipid metabolism and in bile acid homeostasis. Our group has recently identified the contribution of the ghrelin receptor in the regulation of the nuclear receptor PPARγ. Indeed, ghrelin triggers transcriptional activation of PPARγ through a concerted signaling cascade involving Erk1/2 and Akt kinases. These results support the peripheral actions of ghrelin in diseases associated with the metabolic syndrome. It is recognized that there is interplay between PPARγ metabolic cascade and FXR. Here, we demonstrate that ghrelin promotes FXR transcriptional activity in a dose-dependent manner and also promotes its phosphorylation on serine residues. By using truncated ABC and CDEF constructs of FXR, we found that ghrelin induces FXR activity through the AF-1 and AF-2 activation domains. The ghrelin-induced FXR activity is additive to the induction by the selective agonist GW4064. Also, we demonstrate that FXR is the target of sumoylation, another post-translational modification. In particular, FXR is modified by SUMO-1 and SUMO-3 in a ligand-independent manner. SUMO-1 and SUMO-3 promote dose-dependent transcriptional activity of FXR. Our results show that lysine 122 is the prevalent site of sumoylation by SUMO-1, though a compensation mechanism seems to exist between the various sumoylation sites of FXR. With its emerging role in several metabolic cascades, identification of FXR modulators represents a promising approach for the treatment of the metabolic syndrome and type 2 diabetes.

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant. / Approximately 70% of breast tumors express or overexpress estrogen receptor alpha (ERα) and are treated with antiestrogens (AEs), which act as competitive inhibitors of this receptor. Tamoxifen has been widely used for the treatment of ERα-positive tumors, but intrinsic or acquired resistance can lead to tumor recurrence. Full AEs such as Fulvestrant (ICI182, 780) are currently used to treat postmenopausal women with ERα-positive breast cancers with disease progression following Tamoxifen therapy. Unlike Tamoxifen and other Selective estrogen receptor modulators (SERMs), full AEs (SERDs) are devoid of any agonistic activity. It is currently thought that the capacity of full AEs to induce rapid polyubiquitination and degradation of ERα underlies their complete suppression of ERα signalling. On the one hand, we show a correlation between ICI 182, 780 induced ERα inhibition and its association with the insoluble fraction. This insolubility corresponds to an immobilization within the nuclear matrix and takes place in the absence of an accelerated turn over. The helix 12 in the ligand binding domain is important in the induction of insolubility and inactivation. On the other hand, we identify ERα as a target for Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) posttranslational modification by SUMO1 and SUMO2/3 specifically when liganded with full AEs. Induction of SUMOylation is rapid and precedes receptor degradation in ERα-positive breast cancer cells. On the other hand, the SERMs do not induce SUMOylation. The helix 12 in the ligand binding domain and the DNA binding domain play a role in the induction of SUMOylation in the presence of full AEs. Structure activity relationship experiments with full AE derivatives showed that the induction of SUMOylation is correlated with the degree of inhibition of ERα-mediated transcription. In addition, preventing SUMOylation by overexpression of a SENP1 deSUMOylase abolished the inverse agonist properties of full AEs without increasing activity in the presence of agonists or of Tamoxifen. In our attempt to screen for factors with a possible role in SUMOylation and inactivation, we show that the treatment with SERDs but not SERMs, induces a rapid interaction between ERα and the human ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor (ACF) in ERα-negative and ERα-positive cell lines. The helix 12 is important since introducing single point mutations in this helix lead to an increased solubility and abrogate ACF recruitment. Using ChIP, we find an increase of ACF1 subunit association with proximal promoter of estrogen target gene pS2 suggesting a possible role of ACF in remodeling in this promoter. ACF recruitment is SUMOylation dependant since the overexpression of DeSUMOylase SENP1 abolishes the interaction between ERα and ACF. Together, induction of insolubility, SUMOylation and ACF recruitment are characteristic properties of full antiestrogens that contribute to their specific activity profile. They can be used to screen for new compounds with an improved therapeutic potential.

In many organisms, the most fundamental event during embryogenesis is differentiating between germline cells and specialized somatic cells. In C. elegans, PIE-1 functions to protect the germline from somatic differentiation and appears to do so by blocking transcription and by preventing chromatin remodeling in the germline during early embryogenesis. Yet the molecular mechanisms by which PIE-1 specifies germline remain poorly understood. Our work shows that SUMOylation facilitates PIE-1-dependent germline maintenance and specification. In vivo SUMO purification in various CRISPR strains revealed that PIE-1 is SUMOylated at lysine 68 in the germline and that this SUMOylation is essential for forming NuRD complex and preserving HDA-1 activity. Moreover, HDA-1 SUMOylation is dependent on PIE-1 and enhanced by PIE-1 SUMOylation, which is required for protecting germline integrity. Our results suggest the importance of SUMOylation in the germline maintenance and exemplify simultaneous SUMOylation of proteins in the same functional pathway.

Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription régulant l’expression de gènes impliqués dans plusieurs processus physiologiques. En général, ces récepteurs sont activés par une interaction avec un ligand spécifique, mais leur activité peut également être modulée par des modifications post-traductionnelles comme la SUMOylation. Notre laboratoire a récemment trouvé que le récepteur des estrogènes ER est une cible de cette modification sur un site de SUMOylation atypique nommé pSuM. Ce site non-consensus se retrouve également sur Nor-1, un récepteur nucléaire impliqué dans une variété de processus physiologiques comme le métabolisme du glucose, la prolifération cellulaire ainsi que la survie neuronale. Pour l’instant, le rôle de ce motif atypique reste inconnu et aucune évidence n’indique que Nor-1 est SUMOylé dans la littérature. Nos objectifs étaient donc de déterminer le potentiel de SUMOylation de Nor-1 sur son pSuM dans un contexte neuronal et de caractériser l’effet de la SUMOylation sur l’activité transcriptionnelle de Nor-1 ainsi que l’expression de gènes cibles. Nos résultats ont démontré que Nor-1 peut effectivement être SUMOylé sur son pSuM, que cette SUMOylation est dépendante d’une phosphorylation de la sérine-139 et que la voie des MAPK augmente l’état global de SUMOylation de Nor-1 ainsi que son expression protéique. De plus, les résultats ont indiqués que Nor-1 peut conjuguer deux isoformes de SUMO, soit SUMO-1 et SUMO-2. Les résultats démontrent également que la SUMOylation augmente l’activité transcriptionnelle de Nor-1 et que la SUMOylation de son site pSuM est importante pour le maintien de son activité transcriptionnelle basale. Nos résultats préliminaires suggèrent que la SUMOylation du pSuM de Nor-1 affecte l’expression de gènes cibles comme l’énolase-3 ce qui propose un rôle de la SUMOylation de Nor-1 dans la régulation du métabolisme des neurones. En conclusion, les résultats de ce projet permettent d'identifier un nouveau processus de SUMOylation impliqué dans la régulation des récepteurs nucléaires et de Nor-1 suggérant un rôle de ce processus de SUMOylation atypique dans plusieurs réseaux géniques et processus physiologiques. / Nuclear hormone receptors are transcription factors that regulate the expression of many genes implicated in a wide variety of physiological functions. They are generally activated by an interaction with a specific ligand but their activity can also be modulated by post-translational modifications such as SUMOylation. Recently, our laboratory identified ER as a SUMOylation target on an atypical SUMOylation motif named pSuM. This non-consensus SUMOylation motif was also found on Nor-1, a nuclear receptor implicated in physiological processes such as glucose metabolism, cellular proliferation and neuronal survival. Until now, the function of this pSuM motif is still unknown and there are no evidence that Nor-1 is a target of SUMOylation. Therefore, the objectives of this work were to determine the SUMOylation potential of Nor-1 on his pSuM in a neuronal context and to characterize the effect of SUMOylation on Nor-1 transcriptional activity and target genes expression. Our results showed that Nor-1 can indeed be SUMOylated on his pSuM, that this SUMOylation was dependent on serine-139 phosphorylation, and that the MAPK pathway augmented the global SUMOylation state of Nor-1 and its protein expression levels. Furthermore, we demonstrated that Nor-1 can conjugate SUMO-1 and SUMO-2. Our results also indicated that SUMOylation activates the transcriptional activity of Nor-1 and that the pSuM site of Nor-1 was important in maintaining its basal transcriptional activity. Preliminary results suggests that Nor-1 SUMOylation on the pSuM has an impact on the expression of target genes such as enolase-3, suggesting a potential role for Nor-1 in the regulation of the metabolism of neurons. In conclusion, the results presented in this work identify a new SUMOylation process implicated in regulating Nor-1 and nuclear receptors activities, suggesting an extended role of this atypical SUMOylation process in many gene networks and physiological processes.

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T16:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_KaliandradeAlmeida_D.pdf: 14162647 bytes, checksum: a062a24283fc9889ec54663e0b624c2f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A proteína Ki-1/57 foi descoberta através da reação cruzada do anticorpo monoclonal Ki-1 em células do linfoma de Hodgkin. Estudos anteriores demonstraram que Ki-1/57 interage com a proteína RACK-1, sofre fosforilação por PKCs e metilação por PRMT1, uma arginino metiltransferase que modula diversas proteínas ligantes ao RNA. Estudos mostraram que Ki- 1/57 é capaz de controlar o splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Análises por SAXS, gel filtração analítica e ultracentrifugação analítica indicaram uma estrutura bastante alongada e flexível para a construção C-terminal 6xhis-(122-413)Ki-1/57. Ensaios de proteólise limitada também mostraram uma baixa composição de núcleos hidrofóbicos estáveis e compactos, sugerindo que a proteína é intrinsecamente desordenada, o que pode explicar o elevado número de diferentes proteínas parceiras que ela é capaz de interagir. Neste trabalho foi identificada a interação de Ki-1/57 com proteínas da Família do X frágil, e sua localização no Perfil Ribossomal, além de ser capaz de ativar a tradução quando conectada ao gene repórter da Luciferase. Outra observação importante é que Ki-1/57 é sumoilada in vitro e in vivo, sendo as lisinas alvos desta sumoilação identificadas, e a proteína não sumoilada é incapaz de atuar no splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Mais experimentos foram feitos no sentido de caracterizar a interação RACK-Ki-1/57. A interação entre as duas proteínas é forte, possuindo uma constante de dissociação de 0,7 ?M, seguindo uma estequiometria de 1:1 observada em experimentos de sedimentação em equilíbrio. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostraram que a proteína RACK1 tem propriedades hidrodinâmicas similares ao seu modelo predito por homologia, e que em solução ela é encontrada em sua forma monomérica, possuindo uma leve tendência a agregação. A superexpressão de Ki-1/57 e CGI-55 provocou a alteração de 413 e 217 genes respectivamente, que em sua grande maioria foram regulados negativamente. A maioria dos genes, que foram inibidos pela superexpressão de Ki-1/57, estão envolvidos na proliferação celular, muitos sendo expressos em diferentes tumores. Os dados obtidos no teste do MTS confirmam que houve uma diminuição na proliferação celular em células superexpressando as proteínas Ki-1/57 e CGI-55. Com base nos resultados obtidos neste trabalho, novas funções da proteína Ki-1/57 foram descritas, tais como: a influência de Ki-1/57 na proliferação celular, na tradução proteica e o papel importante que a modificação pós traducional, como a sumoilação, representa para que a proteína Ki-1/57 desempenhe sua função / Abstract: The protein Ki-1/57 was discovered through cross reactivity of the monoclonal antibody Ki-1 in cells of Hodgkin lymphoma. Previously studies demonstrated that Ki-1/57 interacts with RACK-1 protein, undergoes phosphorylation by PKCs and methylation by PRMT1, an arginine methyltransferase that modulates several RNA binding proteins. Studies have shown that Ki- 1/57 is able to control the pre-mRNA splicing of the viral E1A gene. SAXS analysis, analytical gel filtration and analytical ultracentrifugation indicate a rather elongated and flexible structure to build C-terminal 6xhis-(122-413) Ki-1/57. Limited proteolysis assays also showed a low composition of stable and compact hydrophobic cores, suggesting that the protein is intrinsically unstructured, it could explain the wide array of protein partners with which it is able to interact. In this work we identified the interaction of Ki-1/57 proteins with Family fragile X, and its location on Ribosomal profile, besides being able to increase the translation when tethered to the reporter gene Luciferase. Another important observation is that Ki-1/57 is sumoylated in vitro and in vivo, the targets of this lysine sumoylated were identified, and the not somoylated protein is unable to act in the pre-mRNA splicing of E1A. More experiments were made to characterize the interaction of RACK1 with Ki-1/57. The interaction between the two proteins is strong, possessing a dissociation constant of 0.7 ?M and follows the stoichiometry of 1:1 as observed by sedimentation equilibrium experiments. Analytical ultracentrifugation experiments showed that human RACK1 has similar hydrodynamic properties to that predicted to homology model, and that in solution it is found in its monomeric form, with a slight tendency to aggregation. Overexpression of Ki-1/57 and CGI-55 caused changes in 413 and 217 genes respectively, which were mostly negative regulated. Most genes that were inhibited by overexpression of Ki-1/57 are involved in cell proliferation, and expressed in different types tumors. The MTS data obtained confirm a decrease in cell proliferation through overexpressing of Ki-1/57 and CGI-55 protein. Based on the results of this study new functions for Ki-1/57 protein have been described such as: the influence of Ki- 1/57 in cell proliferation, in protein translation and the important role that the post translational modification, such as sumoylation, represents so that the protein Ki-1/57 performs its function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

La grande complexité des échantillons biologiques peut compliquer l'identification des protéines et compromettre la profondeur et la couverture des analyses protéomiques utilisant la spectrométrie de masse. Des techniques de séparation permettant d’améliorer l’efficacité et la sélectivité des analyses LC-MS/MS peuvent être employées pour surmonter ces limitations. La spectrométrie de mobilité ionique différentielle, utilisant un champ électrique élevé en forme d'onde asymétrique (FAIMS), a montré des avantages significatifs dans l’amélioration de la transmission d'ions peptidiques à charges multiples, et ce, en réduisant les ions interférents. Dans ce contexte, l'objectif de cette thèse était d'explorer les capacités analytiques de FAIMS afin d'élargir à la fois la gamme dynamique de détection des protéines/peptides et la précision des mesures en protéomique quantitative par spectrométrie de masse. Pour cela, nous avons systématiquement intégré FAIMS dans des approches classiques en protéomique afin de déterminer les changements dynamiques du protéome humain en réponse à l’hyperthermie. Nous avons d’abord étudié les avantages de FAIMS par rapport à la quantification par marquage isobare (tandem mass tag, TMT). Cette approche permet le marquage d'ions peptidiques avec différents groupements chimiques dont les masses nominales sont identiques mais différant par leur distribution respective d'isotopes stables. Les ions peptidiques marqués par TMT produisent des ions rapporteurs de masses distinctes une fois fragmentés en MS/MS. Malheureusement, la co-sélection d'ions précurseurs conduit souvent à des spectres MS/MS chimériques et une approche plus lente basée sur le MS3 est nécessaire pour une quantification précise. Comme FAIMS améliore l’efficacité de séparation en transmettant sélectivement des ions en fonction de leur voltage de compensation (CV), nous avons obtenu moins de co-sélection de peptides. FAIMS a amélioré la quantification des peptides TMT au niveau MS2 et a permis d’obtenir 68% plus de peptides quantifiés par rapport aux analyses LC-MS/MS classiques, fournissant ainsi un aperçu plus vaste des changements dynamiques du protéome humain en réponse au stress thermique. De plus, nous avons étudié le marquage métabolique par incorporation d’acides aminés marqués par des isotopes stables en culture cellulaire (SILAC). Si des interférences co-éluent avec les isotopes SILAC, la quantification devient imprécise et les contreparties de SILAC peuvent être assignées de manière erronée aux ions interférants du chromatogramme, faussant ainsi le rapport SILAC. Le fractionnement post-ionisation FAIMS pourrait filtrer les ions appartenant au bruit de fond qui pourraient autrement être attribués à une paire ou à un triplet SILAC pour la quantification. Dans ce projet, FAIMS a été particulièrement bénéfique pour les espèces peu abondantes et s’est montré plus performant que le fractionnement par échange de cations (SCX). En outre, FAIMS a permis la séparation des phosphoisomères fréquemment observés dans les extraits complexes de phosphoprotéomes. Le troisième objectif de ce travail de recherche était d'explorer la séparation de l'état de charge et la transmission améliorée de peptides fortement chargés avec FAIMS et son application à l'analyse de peptides SUMOylés. FAIMS pourrait ainsi améliorer la transmission des peptides SUMOylés triplement chargés par rapport aux peptides tryptiques usuels, lesquels sont principalement doublement chargés. Ceci permettait l'enrichissement en phase gazeuse des ions peptides SUMOylés. FAIMS est une approche alternative plus simple pour fractionner les peptides SUMOylés, ce qui réduit les pertes d’échantillon et permet de simplifier le traitement des échantillons, tout en augmentant l’efficacité de séparation de manière plus automatisée et en ajoutant un ordre de grandeur de sensibilité. Le dernier objectif de cette thèse était d’améliorer l’instrumentation de FAIMS en le jumelant aux instruments à la fine pointe de la technologie. Avec un nouveau dispositif FAIMS, développé par nos collaborateurs chez Thermo Fisher Scientific, nous avons montré une amélioration dans la robustesse et la transmission des ions pour la nouvelle interface. Dans des expériences simples en protéomique shotgun, FAIMS a étendu la gamme dynamique d'un ordre de grandeur pour une couverture protéomique plus profonde par rapport aux analyses LC-MS/MS classiques. En outre, le fractionnement en phase gazeuse de FAIMS a généré moins d’analyses chimériques en MS2, ce qui a permis d’obtenir plus d’identifications et une meilleure quantification. Pour ce faire, nous avons directement comparé le LC-FAIMS-MS/MS au LC-MS/MS/MS en utilisant la sélection de précurseur synchrone (SPS) avec et sans fractionnement en phase inverse basique. Des mesures quantitatives comparables ont été obtenues pour toutes les méthodes, à l'exception du fait que FAIMS a parmi d’obtenir un nombre 2,5 fois plus grand de peptides quantifiables par rapport aux expériences sans FAIMS. Globalement, cette thèse met en évidence certains des avantages que FAIMS peut offrir aux expériences en protéomique en améliorant à la fois l'identification et la quantification des peptides. / The high complexity of biological samples can confound protein identification and compromise the depth and coverage of mass spectrometry-based proteomic analyses. Separation techniques that provide improved peak capacity and selectivity of LC-MS/MS analyses are often sought to overcome these limitations. High-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS), a differential ion mobility device, has shown significant advantages by enhancing the transmission of multiple-charged peptide ions by reducing singly-charged interferences. In this context, the goal of this thesis was to explore the analytical capabilities of FAIMS to extend both the dynamic range of proteins/peptides detection and the precision of quantitative proteomic measurements by mass spectrometry. For this, we systematically integrated FAIMS in standard workflows to monitor the dynamic changes of the human proteome in response to hyperthermia. We first studied the merits of FAIMS to aid isobaric labeling quantification with tandem mass tags (TMT). This approach allows the labeling of peptide ions with different chemical groups of identical nominal masses but differing in their respective distribution of stable isotopes. TMT-labeled peptide ions produce reporter ions of distinct masses once fragmented by MS/MS. Unfortunately, the co-selection of precursor ions often leads to chimeric MS/MS spectra, and a slower MS3 centric approach is needed for precise quantification. Since FAIMS improves peak capacity by selectively transmitting ions based on their compensation voltage (CV), we obtained less peptide co-selection. FAIMS improved TMT quantification at the MS2 level and achieved 68 % more quantified peptides compared to regular LC-MS/MS, providing a deeper insight into the dynamic changes of the human proteome in response to heat stress. Further, we investigated stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) quantification. If interferences co-elute simultaneously with SILAC isotopomers, quantification becomes inaccurate and SILAC counterparts can be missassigned to interfering ions in the highly populated chromatogram, thus skewing the SILAC ratio. FAIMS post-ionization fractionation could filter out background ions that can otherwise be attributed to a SILAC pair/triplet for quantification. In this work, FAIMS was especially beneficial for low abundant species and outperformed the standard strong cation exchange (SCX) fractionation workflow. In addition, FAIMS allowed the separation of phosphoisomers that are frequently observed in complex phosphoproteome extracts. The third aim of this work explored the charge state separation and enhanced transmission of highly charged peptides with FAIMS and its application for SUMOylated peptide analysis. FAIMS could enhance the transmission of triply charged SUMOylated peptides over typical tryptic peptide that are predominantly doubly charged, by applying more negative CVs with FAIMS. This allowed for gas-phase enrichment of SUMOylated peptide ions. FAIMS is an alternate and more straightforward approach to fractionate SUMOylated peptides that reduced sample loss, avoided sample processing, while increasing peak capacity in a more automated manner and added one order of magnitude in sensitivity. The last aim of this thesis was to improve the FAIMS instrumentation by interfacing it to the latest state-of-the-art instruments. With a new FAIMS device developed by our collaborators at Thermo Fisher Scientific, we demonstrate the robustness and the improved ion transmission for the new interface. In simple shotgun proteomics, FAIMS extended the dynamic range by one order of magnitude for deeper proteome coverage compared to regular LC-MS/MS. Moreover, fewer MS2 chimeric scans were generated with FAIMS gas-phase fractionation, which garnered more identifications and better quantification. For this, we directly compared LC-FAIMS-MS/MS to LC-MS/MS/MS using synchronous precursor selection (SPS) with and without basic reverse phase fractionation. Comparable quantitative measurements were obtained for all methods, except that FAIMS provided a 2.5-fold increase in the number of quantifiable peptides compared with non-FAIMS experiments. Overall, this thesis highlights some of the advantages that FAIMS can provide for proteomics experiments by improving both peptide identification and quantification.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The voltage-gated sodium channel Nav1.7 has gained traction as a pain target with recognition that loss-of-function mutations in SCN9A, the gene encoding Nav1.7, are associated with congenital insensitivity to pain, whereas gain-of-function mutations produce distinct pain syndromes due to increased Nav1.7 activity. Selective inhibition of Nav1.7 is fundamental to modulating pain via this channel. Understanding the regulation of Nav1.7 at the cellular and molecular level is critical for advancing better therapeutics for pain. Although trafficking of Nav1.7 remains poorly understood, recent studies have begun to investigate post-translational modifications of Navs and/or auxiliary subunits as well as protein-protein interactions as Nav-trafficking mechanisms. Here, I tested if post-translational modifications of a novel Nav1.7-interacting protein, the axonal collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) by small ubiquitin-like modifier (SUMO) and phosphorylation could affect Nav trafficking and function. Expression of a CRMP2 SUMOylation incompetent mutant (CRMP2-K374A) in neuronal model CAD cells, which express predominantly Nav1.7 currents, led to a significant reduction in huwentoxin-IV-sensitive Nav1.7 currents. Increasing deSUMOylation with sentrin/SUMO-specific protease SENP1 or SENP2 in wildtype CRMP2-expressing CAD cells decreased Nav1.7 currents. Consistent with reduced current density, biotinylation revealed significant reduction in surface Nav1.7 levels of CAD cells expressing CRMP2-K374A or SENP proteins. Diminution of Nav1.7 sodium current was recapitulated in sensory neurons expressing CRMP2-K374A. Because CRMP2 functions are regulated by its phosphorylation state, I next investigated possible interplay between phosphorylation and SUMOylation of CRMP2 on Nav1.7. Phosphorylation of CRMP2 by cyclin dependent kinase 5 (Cdk5) was necessary for maintaining Nav1.7 surface expression and current density whereas phosphorylation by Fyn kinase reduced CRMP2 SUMOylation and Nav1.7 current density. Binding to Nav1.7 was decreased following (i) loss of CRMP2 SUMOylation, (ii) loss of CRMP2 phosphorylation by Cdk5, or (iii) gain of CRMP2 phosphorylation by Fyn. Altering CRMP2 modification events simultaneously was not synergistic in reducing Nav1.7 currents, suggesting that Nav1.7 co-opts multiple CRMP2 modifications for regulatory control of this channel. Loss of either CRMP2 SUMOylation or Cdk5 phosphorylation triggered Nav1.7 internalization involving E3 ubiquitin ligase Nedd4-2 as well as endocytosis adaptor proteins Numb and Eps15. Collectively, my findings identify a novel mechanism for regulation of Nav1.7.

About 70% of breast tumors express the estrogen receptor alpha (ERα). Antiestrogens (AEs) are used to treat all stages of ER+ breast cancer. There are two types of AEs: Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMs) and Selective Estrogen Receptor Downregulators (SERDs). SERMs such as Tamoxifen (Tam) have tissue-specific partial agonist activity, while SERDs such as Fulvestrant or Faslodex (ICI182, 780) fully repress estrogen target genes regardless of the tissue and cell type. Previously, it has been reported that SERDs induce ERα ubiquitination and degradation. ERα is also SUMOylated in the presence of SERDs. Abrogating SUMOylation of ERα using a deSUMOylase (SENP1) resulted in a partial de-repression of estrogen target genes in the presence of SERDs. Mapping the domains using deletion mutagenesis in the presence of ICI 182,780 showed that C-terminal domain (CDEF regions) is required of the ICI induced modification but not the N-terminal domain (AB region). Thus, a detailed dissection of the structural determinants for the selective action of SERDs on ERα SUMOylation and ubiquitination remained unknown. Our work shows that pure antiestrogens like ICI182,780 induce SUMOylation and ubiquitination of ERα but not ERβ in live cells. Utilizing the fact that domains of ERα and ERβ display sequence homology, we designed chimeras to map the minimal domain required for ERα modification in the presence of antiestrogens. Interestingly, swapping domains between ERα and ERβ showed that the Ligand Binding Domain (LBD) of ERα is sufficient to confer the induction of ERα modification in the presence of AEs such as Raloxifene (Ral) and ICI182,780. Further dissecting this region, we also found that helices 3 to 6 (H3H6) located in the LBD region is sufficient to confer the induction of SUMOylation and ubiquitination in the ICI182,780. Importantly, the lysine residues in this region between ERα and ERβ are conserved, which suggests that conformational differences in the LBD determine the capacity of ICI182, 780 bound ERα to be modified by SUMO and ubiquitin. Replacement of Leucine at position 536 in helix 12 (H12) of ERα’s LBD by a Valine residue or mutating Aspartate at position 351 abolished the increase in SUMOylation and ubiquitination observed in the presence of Ral. This suggested that Ral, a SERM, required a different set of determinants than ICI182,780 present in the LBD of ERα. vi Our work has also showed that saturating concentrations (increasing the amount of drug added will not result in a higher response) of ICI 182,780 modified and fully repressed constitutively active mutations such as Y537C, N or S and D538G. Other mutation such V534E and L536R/Q mutants exhibited some residual activity and were not modified in the presence of saturating concentrations of ICI182,780. Interestingly, the loss of SUMOylation correlated with the partial resistance to AEs. Structure function analysis of residues at position 536 indicates amino acids with a bulky hydrophobic side chain residue at this position result in preservation of ERα modifications in the presence of ICI 182,780. However, Using BRET-FECT, we have demonstrated that ERαwt/L536R heterodimerize and have intermediate levels of SUMOylation compared to ERαwt in the presence of ICI 182,780. Our results shed light onto the molecular basis for the diverse pharmacological properties of antiestrogens and should help guide the design of novel SERDs for breast cancer treatment. / Environ 70% des cancers du sein expriment le récepteur des oestrogènes alpha (ERα). Les anti-oestrogènes (AEs) sont utilisés pour traiter tous les stades de cancer du sein ER+. Il y a deux types d’AEs : les Selective ER Modulators (SERMs) et les Selective ER Downregulators (SERDs). Les SERMs, comme le Tamoxifen (Tam), ont une activité agoniste partielle tissu-spécifique, alors que les SERDs, tel Fulvestrant ou Faslodex (ICI182,780), répriment entièrement les gènes cibles d’ER, quel que soit l’organe ou le type cellulaire. Il a précédemment été montré que les SERDs induisent l’ubiquitination et la dégradation d’ERα. ERα est aussi SUMOylé en présence des SERDs. Supprimer la SUMOylation d’ERα en utilisant une déSUMOylase (SENP1) résulte en une dérépression partielle des gènes cibles d’ER en présence de SERDs. La délétion successive des différents domaines d’ERα en présence d’ICI182,780 a révélé que la région C-terminale (domaines CDEF) est requise pour la modification induite par ICI, mais pas la région N-terminale (domaines AB). Ainsi, la dissection détaillée des déterminants structuraux responsables de l’activité sélective des SERDs pour la SUMOylation et l’ubiquitination d’ERα reste à entreprendre. Nos travaux montrent que les AEs purs comme ICI182,780 induisent la SUMOylation d’ERα, mais pas d’ERβ, dans des cellules en culture. Tirant profit de l’homologie de séquences des différents domaines d’ERα et ERβ, nous avons conçu des chimères pour cartographier la région minimale requise pour la modification d’ERα en présence d’AEs. De manière intéressante, l’interversion des domaines d’ERα et ERβ a montré que le domaine de liaison au ligand (LBD) d’ERα est suffisant pour permettre l’induction de la modification d’ERα en présence d’AEs tels le Raloxifene (Ral) et ICI182,780. En décortiquant davantage ce domaine, nous avons trouvé que les hélices 3 à 6 (H3H6) du LBD sont suffisantes pour induire la SUMOylation et l’ubiquitination d’ERα en présence d’ICI182,780. De manière importante, les résidus Lysine de cette région sont conservées entre ERα et ERβ, ce qui suggère que des différences conformationnelles entre les deux LBD déterminent la capacité d’ERα lié par ICI182,780 d’être modifié par SUMO et l’ubiquitine. La mutation de la Leucine à la position 536 dans l’hélice H12 du LBD d’ERα par une Valine, ou la mutation de l’Aspartate à la position 351 abolissent l’augmentation de la SUMOylation et l’ubiquitination observée en présence de iv Ral. Cela suggère que Ral, un SERM, requière différents déterminants structuraux du LBD d’ERα qu’ICI182,780. Nos travaux ont aussi montré que des concentrations saturantes (l’augmentation de la quantité de drogue ajoutée ne mènera pas à une réponse plus élevée) d’ICI182,780 modifient et répriment entièrement des mutants constitutivement actifs d’ERα comme Y537C, N ou S et D538G. D’autres mutants, tels V534E et L536R/Q, présentent une activité résiduelle et ne sont pas modifiés sous traitement avec des concentrations saturantes d’ICI182,780. De façon intéressante, la perte de SUMOylation corrèle avec la résistance partielle aux AEs. Une analyse structure – fonction des résidus à la position 536 indique que les acides aminés avec une chaine latérale hydrophobe volumineuse à cette position permettent de préserver les modifications d’ERα en présence d’ICI182,780. Cependant, en utilisant la technique BRET-FECT, nous avons démontré que les récepteurs ERα sauvage et L536R forment un hétérodimère qui présente des niveaux intermédiaires de SUMOylation en présence d’ICI182,780. Nos résultats révèlent les bases moléculaires des diverses propriétés pharmacologiques des AEs et devraient aider à guider la conception de nouveaux SERDs pour le traitement des cancers du sein.

Afin de répondre correctement aux nombreux changements se produisant à chaque instant dans leur environnement, les cellules utilisent une panoplie de messagers moléculaires dont la synchronisation est essentielle à la signalisation cellulaire appropriée. La superfamille des récepteurs nucléaires compte quarante-huit membres impliqués dans ces processus de signalisation et influence ainsi plusieurs fonctions physiologiques. Les récepteurs nucléaires de la sous-famille NR4A composée de Nur77/NR4A1, Nurr1/NR4A2 et Nor1/NR4A3 sont des facteurs critiques du développement et de la maintenance du système nerveux. Nor1/NR4A3 en particulier est essentiel aux processus de guidage axonal et de survie neuronale au niveau de l’hippocampe. Les NR4A se démarquent des autres récepteurs nucléaires puisqu’ils sont considérés comme des récepteurs orphelins constitutivement actifs, ce qui veut dire qu’ils ne nécessitent pas d’interaction avec un ligand afin d’être activés. Il devient ainsi important d’identifier de nouveaux mécanismes de régulation pour cette sous-famille de récepteur afin d’améliorer notre compréhension et potentiellement contrôler leurs activités dans un contexte neuronal. L’activité des récepteurs nucléaires peut être régulée de plusieurs façons, indépendamment de leur association avec un ligand endogène. Les modifications post-traductionnelles représentent un aspect crucial de la signalisation cellulaire permettant de réguler la fonction des protéines cibles de manière spécifique au contexte. La SUMOylation et la phosphorylation sont des exemples de modifications post-traductionnelles avec le potentiel de réguler l’activité transcriptionnelle, la stabilité et l’expression des gènes cibles des récepteurs nucléaires. Dans cette thèse, l’impact de la SUMOylation retrouvée sur un motif consensus ainsi que sur un motif non-consensus de SUMOylation phosphorylé du récepteur Nor1 est étudié. Dans la première étude, un motif de SUMOylation non-consensus nouvellement découvert sur Nor1 est décrit. Ce nouveau motif nommé pSuM a été identifié pour la première fois sur le récepteur nucléaire des estrogènes ERβ et sur le récepteur farnésoÏde FXR. Nous avons identifié un motif pSuM situé à la lysine 137 de Nor1 qui sert de cible fonctionnelle de SUMO2. Le pSuM se démarque du motif de SUMOylation consensus puisqu’il nécessite une phosphorylation afin d’être SUMOylé. Dans le cas de Nor1, nos résultats démontrent que la sérine 139 est phosphorylée par la voie des MAPK. La SUMOylation sur ce site mène à une réduction de l’activité transcriptionnelle et du recrutement à la chromatine de Nor1 ainsi que de l’expression des gènes sensibles à Nor1. Une particularité intéressante du pSuM de Nor1 est qu’il possède également une extension phosphorylable par la kinase CK2 qui est essentielle au processus de SUMOylation. Cette extension a également un effet sur la stabilité et la compétence transcriptionnelle de Nor1. En utilisant des lignées SH-SY5Y exprimant de manière stable différents mutants SUMO de Nor1, il est démontré que la SUMOylation du pSuM diminue la prolifération et la survie cellulaire en réponse au stress oxydant. Dans la seconde étude, la SUMOylation de Nor1 sur un motif de SUMOylation canonique situé sur la Lysine 89 est caractérisée. Il est démontré que ce site de SUMOylation est ciblé principalement par SUMO1 et qu’il est important afin de maintenir une compétence transcriptionnelle et une stabilité optimale du récepteur. Cette SUMOylation régule également la prolifération et la survie en réponse à un traitement au nocodazole des lignées stables ainsi que la stabilité des microtubules. En conclusion, ces études identifient de nouveaux mécanismes de SUMOylation et phosphorylation utilisés dans la régulation de l'activité du récepteur nucléaire Nor1. Elles permettent également d’approfondir nos connaissances des rôles joués par Nor1 dans la neuroprotection en réponse au stress oxydant ainsi que dans la régulation de la stabilité du réseau de microtubules, ce qui apporte une nouvelle fonction de Nor1. Puisque Nor1 et les autres NR4A sont fortement impliqués dans la formation et maintenance du système nerveux et que les modifications post-traductionnelles peuvent réguler ces fonctions, la découverte et la caractérisation de nouveaux mécanismes de régulation de ces récepteurs ont le potentiel de nous fournir des nouvelles connaissances utiles dans le cadre des maladies neurodégénératives et autres conditions pathologiques. / To answer the many changes happening every instant in its surroundings, cells require a fine-tuned array of molecular messengers to carry on proper signal transduction and homeostasis. The superfamily of nuclear receptors contains forty-eight members implicated in a wide variety of cellular and physiological functions. The nuclear receptors of the NR4A subfamily containing Nur77/NR4A1, Nurr1/NR4A2 and Nor1/NR4A3 are heavily implicated in the development and maintenance of the nervous system. In particular, Nor1/NR4A3 has been shown to be essential for axonal guidance and neuronal survival in the hippocampus. This subfamily also operates differently from other nuclear receptors as they are considered constitutively active orphan nuclear receptors without known endogenous ligand. Therefore, there is an increasing need to identify critical mechanisms that regulate NR4A nuclear receptors and to better understand the control of their activities in a neuronal context. Nuclear receptor activity can be regulated in various ways independently of their interaction with an endogenous ligand. One is through post-translational modifications which allow the regulation of protein function depending on the cellular context. SUMOylation and phosphorylation are post-translational modifications with the potential to regulate nuclear receptor activity, stability and target gene expression. In this thesis, the impact of a canonical SUMOylation site and a phosphorylation dependant SUMOylation motif on the orphan nuclear receptor Nor1 are studied. In the first study, a newly identified non-canonical SUMOylation motif on Nor1 was described. This new motif named pSuM was first identified on the nuclear estrogen receptor ERβ and farnesoid X receptor FXR. We report that this pSuM is located at Lys-137 on Nor1 and is a target of SUMO2. The pSuM differs from traditional SUMOylation motif since it requires to be phosphorylated for SUMOylation to occur. For Nor1, our evidence showed that the obligate phosphorylation of the pSuM on Ser-139 occurred through the MAPK pathway. SUMOylation of Nor1 pSuM reduced Nor1 transcriptional competence, responsive gene expression and chromatin binding. Interestingly, the pSuM of Nor1 also possesses an extension phosphorylated by the CK2 kinase, which is essential to achieve the SUMOylation process. This extension also affected Nor1 protein stability and transcriptional activity. Using stable SH-SY5Y cell lines expressing different SUMO mutants of Nor1, we also showed that Nor1 pSuM SUMOylation reduced cell proliferation and survival to oxidative stress. In the second study, the SUMOylation of Nor1 on a canonical SUMOylation site found at Lys-89 was characterized. This SUMOylation site was found to be targeted mainly by SUMO1 and to be important in maintaining optimal transcriptional competency and stability of the receptor. This SUMOylation also regulated proliferation and survival to a nocodazole treatment of stable cell lines, as well as microtubule network stability. In conclusion, these studies provide novel mechanisms in the regulation of Nor1 activity by SUMOylation and phosphorylation. They also helped to expand our knowledge on the role played by Nor1 in neuroprotection in response to oxidative stress, as well as in the regulation of microtubule stability, which identified a new function of Nor1. Since Nor1 and other NR4A receptors are implicated in the formation and maintenance of the nervous system, the identification of post-translational modifications as a regulatory mechanism uncovers novel opportunities in our understanding of these receptors and provide new insights for neurodegenerative diseases and other neuropathological conditions.

Les récepteurs nucléaires font partie d’une famille de protéine multigénique agissant comme facteurs de transcription qui, en réponse à la liaison d’un ligand, régulent l’expression de gènes cibles impliqués dans une variété de fonctions physiologiques. Cependant, les récepteurs nucléaires orphelins, qui n’ont pas de ligand connu, peuvent également être régulées par des modifications post-traductionnelles (PTMs) comme la SUMOylation et la phosphorylation. La famille des NR4A, incluant Nurr1, Nur77 et Nor1, sont des récepteurs orphelins dépendant grandement des PTMs au niveau de l’AF-1 afin de moduler leurs activités essentielles dans la différenciation, le développement et le métabolisme des fonctions neurologiques. En particulier, il est connu que les PTMs permettent le recrutement de cofacteurs comme l’isomérase Pin-1, une enzyme recrutée par des motifs phospho-sérine/thréonine-proline qui catalyse l’isomérisation cis/trans du lien avec la proline. Notre laboratoire a récemment identifié un site de SUMOylation atypique nommé pSuM (phosphorylation-dependent Sumoylation Motif) possédant une extension phosphorylable de motif sérine/thréonine-proline au niveau du domaine AF-1 (Activation Function-1) de certains récepteurs nucléaires, soutenant un processus de régulation transcriptionnelle des récepteurs via la SUMOylation et la phosphorylation. Le récepteur Nor1 possède un motif pSuM dont le rôle exact de la SUMOylation et l'implication de Pin-1 comme régulateurs de l’activité de Nor1 dans les mécanismes de neuroprotection reste inconnu. Ainsi nos objectifs sont de déterminer et caractériser le mécanisme de recrutement et l'impact de Pin-1 sur la régulation de Nor1 ainsi que de déterminer le rôle de Pin-1 sur l’expression des gènes cibles impliqués dans la neuroprotection. Nos résultats démontrent que l’isomérase Pin-1 favorise l’expression de gène impliquées dans la neuroprotection comme Eno3, Nrip1 et Atf3 via un mécanisme dépendant de la SUMOylation et de la phosphorylation qui permet la régulation positive de l’activité transcriptionnelle de Nor1 dans un modèle de cellules neuronales de souris. En conclusion, les résultats de ce travail permettent d’identifier l’isomérase Pin-1 comme un nouveau cofacteur de Nor1 impliqué dans le contrôle de l’expression génique associé à la neuroprotection et démontre un mécanisme de régulation de Nor1 par la SUMOylation et la phosphorylation de l’extension du pSuM. / Nuclear receptors are part of a family of multigene proteins acting as transcription factors that, in response to ligand binding, regulate the expression of target genes involved in various physiological functions. However, orphan nuclear receptors, which have no known ligand, can also be controlled by post-translational changes (PTMs) such as SUMOylation and phosphorylation. The NR4A family, including Nurr1, Nur77, and Nor1, are orphan receptors highly dependent on PTMs at the AF-1 domain to modulate their essential activities in the differentiation, development, and metabolism of neurological functions. The PTMs of nuclear receptors allow the recruitment of cofactors such as the Pin-1 isomerase, an enzyme recruited by phospho-serine/threonine-proline motifs that catalyzes the cis/trans isomerization of the proline. Our laboratory has recently identified an atypical SUMOylation site named pSuM (phosphorylation-dependent Sumoylation Motif) characterized by a phosphorylation-sensitive extension of serine/threonine-proline pattern usually present in the AF-1 (Activation Function-1) domain of receptors and providing transcriptional regulation via SUMOylation and phosphorylation. As of now, the role of SUMOylation and Pin-1 as regulators of Nor1 activity in neuroprotection mechanisms remains unknown. Thus, our objectives were to determine and characterize the recruitment mechanism of Pin-1 and its impact on the transcriptional regulation of Nor1 as well as to determine the role of Pin-1 on the expression of target genes involved in neuronal integrity. Our results have shown that Pin-1 isomerase enhances the expression of genes involved in neuroprotection such as Eno3, Nrip1, and Atf3 through a SUMOylation and phosphorylation mechanism that upregulates the transcriptional activity of Nor1 in neuronal cells. In conclusion, this project identifies Pin-1 as a novel cofactor of Nor1 that is regulated by SUMOylation and phosphorylation of the pSuM extension, thus allowing a tight control over the transcription of genes involved in neuroprotection processes.