La motilité cellulaire est un processus intégré essentiel à de nombreux phénomènes physiologiques tels que la formation du cône de croissance et la plasticité synaptique. Des dérégulations de la motilité cellulaire peuvent être à l’origine de la formation de métastases ou de pathologies neuropsychiatriques comme la schizophrénie et l'autisme. La compréhension des mécanismes régulant la migration cellulaire est donc un enjeu majeur. La motilité cellulaire repose sur la formation de diverses structures constituées de réseaux d’actine branchés telles que le lamellipode. La formation du lamellipode nécessite l’intervention de protéines régulatrices de l’actine telles que Rac1 et les complexes Wave et Arp2/3. Grâce à l’utilisation de suivi de protéine unique, nous avons pu comprendre comment la coordination spatio-temporelle de ces régulateurs contrôle la formation et la morphologie des lamellipodes de cellules migrantes. Nous avons ainsi découvert que l’activation et la localisation du complexe Wave étaient régulées de manière enzymatique mais également mécanique. Dans une première étude, nous avons montré que la RhoGTPase Rac1 active le complexe Wave spécifiquement à l’extrémité du lamellipode. Dans une seconde étude, nous avons révélé que la localisation du complexe Wave est régulée par la dynamique des filaments des réseaux branchés d’actine. Ces données soulignent l’importance du complexe Wave dans la formation du lamellipode et révèlent l’existence d’une régulation mécanique de la localisation du complexe Wave. / Cell motility is an integrated process involved in critical phenomena such as axonal pathfinding and synaptic plasticity. Dysregulation of cell motility can induce metastasis and abnormal spine shapes observed in neuropsychiatric disorders like autism and schizophrenia. Therefore it is essential to understand how cell motility is regulated. Cell motility requires the formation of branched actin networks propelled by actin polymerization that lead to the formation of membrane protrusions such as the lamellipodium. Several actin regulatory proteins are involved in this process, such as Rac1 and the WAVE and ARP2/3 complexes. Using single protein tracking, we revealed key phenomena concerning the spatio-temporal regulation of lamellipodium formation by actin regulatory proteins. We found that the localization and activation of the WAVE complex was enzymatically regulated, but also mechanically. First, we showed that the Rac1 RhoGTPase activates the WAVE complex specifically at the tip of the lamellipodium. We also showed that WAVE complex localization is regulated by the dynamics of branched-network actin filaments. This study confirms the crucial role of the WAVE complex in lamellipodium formation and reveals the existence of a mechanical regulation of the localization of this complex in the cell.

Les adhérences focales (AF), structures adhésives reliant la cellule à la matrice extra-cellulaire (MEC), constituent de véritables plateformes de signalisation biochimique et mécanique qui contrôlent l'adhérence, la migration, la différenciation et la survie cellulaire. Les récepteurs transmembranaires intégrines sont au coeur des AF, où elles connectent la MEC au cytosquelette d'actine. Au début des années 2000, la protéine intracellulaire taline, qui se lie aux parties cytoplasmiques bêta des intégrines, était considérée comme le principal activateur des intégrines. Néanmoins, il a depuis été montré que la kindline, autre protéine intracellulaire se liant aux parties bêta cytoplasmiques, jouait également un rôle essentiel dans l'activation des intégrines. Ainsi,plusieurs études ont mis en évidence que la kindline et la taline étaient complémentaires et avaient une action synergique durant l'activation des intégrines. Les bases moléculaires de ces phénomènes restent à déterminer. De plus, la plupart des données sur lerôle de la kindline dans l'adhérence et l'activation des intégrines provient d'expériences menées sur des cellules en suspension et/ou avec l'intégrine plaquettaire αIIbβ3. Ainsi, la régulation de ces processus par la kindline dans les cellules adhérentes est encore peu comprise. Dans cette étude, nous combinons la microscopie PALM et le suivi de protéines individuelles pour révéler le rôle et le comportement de la kindline à l'intérieur et à l'extérieur des AF au cours des événements moléculaires clés se déroulant au niveau de la membrane plasmique, et qui mènent à l'activation des intégrines. Nous avons observé que les intégrines bêta1 etbêta3 portant une mutation ponctuelle inhibant l'interaction avec la kindline montrent un défaut d'immobilisation dans les AF. Nous avons également observé que la kindline-2, qui est enrichie dans les AF, diffusait librement au niveau de la membrane plasmique,à l'intérieur et à l'extérieur des AF. Ceci constitue une distinction majeure par rapport à la taline, qui, au niveau de la membrane plasmique, est essentiellement observée dans les AF où elle est immobile, montrant qu'elle est recrutée dans les AF directement depuis le cytosol sans diffusion latérale membranaire (Rossier et al. 2012). Afin d'identifier les bases moléculaires du recrutement et de la diffusion membranaire de la kindline, nous avons utilisé différents variants mutés de kindline précédemment décrits. Le mutant kindline-2-QW614/615AA (liaison aux intégrines inhibée) montre une diffusion membranaire accrue, ce qui suggère que la kindline peut diffuser au niveau de la membrane plasmique sans être associée aux intégrines. Par ailleurs, la baisse d'immobilisation au niveau des AF observée avec ce mutant montre qu'une partie de l'immobilisation de la kindline est due aux intégrines, suggérant l'existence d'un complexe intégrine-kindline immobile dans les AF. La délétion du domaine PleckstrinHomology (PH) de la kindline diminue considérablement son recrutement et sa diffusion membranaire. Nous avons évalué le rôle fonctionnel du recrutement et de la diffusion membranaire de la kindline en réexprimant ces mutants dans des cellules déplétéesen kindline-1 et -2 (cellules KO kindline-1 -/-, kindline-2 -/-). Ces expériences montrent que le recrutement et la diffusion membranaire de la kindline sont cruciaux pour l'activation des intégrines durant l'étalement cellulaire et favorisent la formation d’adhérences. Cela suggère que la kindline utilise un chemin différent de celui de la taline pour atteindre et activer les intégrines,ce qui pourrait expliquer au niveau moléculaire comment la kindline complémente la taline durant l'activation des intégrines. / Focal adhesions (FAs) are adhesive structures linking the cell to the extracellular matrix (ECM) and constitute molecular platforms for biochemical and mechanical signals controlling cell adhesion, migration, differentiation and survival. Integrin transmembrane receptors are core components of FAs, connecting the ECM to the actin cytoskeleton. During the early 2000s, the intracellular protein talin, which directly binds to the cytoplasmic tail of β-integrins, was considered as the main integrin activator. Nevertheless, it has been shown that kindlin, another intracellular protein that bind to β-integrin, is also a critical integrin activator. In fact, several studies have shown that kindlin and talin play complementary and synergistic roles during integrin activation. The molecular basis of these phenomena remains to determine. Moreover, most studies focusing on the role of kindlin during integrin activation and cell adhesion have been performed with suspended cells and/or with the platelet integrin αIIbβ3. Here we combined PALM microscopy with single protein tracking to decipher the role and behavior of kindlin during key molecular events occurring outside and inside FAs at the plasma membrane and leading to integrin activation, as we have done previously for talin (Rossier et al., 2012). We found that beta1 and beta3-integrins with a point mutation inhibiting binding to kindlin show reduced immobilization inside FAs. We also found that kindlin-2, which is enriched inside FAs, displayed free diffusion at the plasma membrane outside and inside FAs. This constitutes a major difference with talin, which, at the plasma membrane level, is observed almost exclusively in FAs, where it is immobile, which shows that talin is recruited into FAs directly from the cytosol without lateral diffusion along the plasma membrane (Rossier et al. 2012). To determine the molecular basis of kindlin membrane recruitment and diffusion, we used a kindlin variant known to decrease binding to integrins (kindlin-2- QW614/615AA). This mutant displayed increased membrane diffusion, suggesting that kindlin-2 can freely diffuse at the plasma membrane without interacting with integrins. Moreover, the kindlin-2-QW mutant showed decreased immobilization inside FA, showing that part of kindlin immobilization depends on interaction with integrins. This suggests that kindlin can form an immobile complex with integrins inside focal adhesions. Deletion of the kindlin pleckstrin homology (PH) domain strongly reduced the membrane recruitment and diffusion of kindlin. We assessed the functional role of kindlin membrane recruitment and diffusion by re-expressing different kindlin-2 mutants in kindlin-1/kindlin-2 double KO cells. Those experiments demonstrated that kindlin-2 membrane recruitment and diffusion are crucial for integrin activation during cell spreading and favor adhesion formation. This suggests that kindlin uses a different route from talin to reach integrins and trigger their activation, providing a possible molecular basis for their complementarity during integrin activation.

LFA-1 (Lymphocyte Function Associated antigen-1) est une intégrine centrale dans la fonction cytotoxique des lymphocytes T CD8+ car elle permet la formation de la synapse immunologique avec les cellules cibles. La régulation de cette interaction cellulaire est contrôlée par la qualité de l'engagement de LFA-1 avec son ligand ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule-1). Un support clef au contrôle spatio-temporel de l'activation de LFA-1 est le cytosquelette d'actine corticale dans lequel est ancré LFA-1 par son domaine intracellulaire. Comment LFA-1 est organisée à la synapse immunologique et comment la coordination entre LFA-1 et cytosquelette d'actine s'opère de manière précise au sein des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques sont des questions non résolues. Le but de ce projet de thèse a été d'étudier l'organisation précise de la distribution de LFA-1 à la synapse immunologique en relation avec l'actine corticale sous-jacente au contact entre lymphocytes T cytotoxiques et les cellules présentatrices d'antigènes. Pour ce faire, des approches de microscopies de super-résolution SIM (Structured Illumination Microscopy), dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) et TIRF (Total Internal Reflexion Fluorescence microscopy) ont été développées. Elles ont été appliquées à des lymphocytes T humains non transformés dérivés de contrôles sains et de patients atteints d'une immunodéficience congénitale, le Syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), caractérisé par un défaut de remodelage du cytosquelette d'actine à la synapse immunologique. L'emploi de l'approche de dSTORM en mode TIRF nous a permis de révéler que dans sa conformation activée, LFA-1 forme à la synapse une ceinture radiale composée de centaines de nano-clusters. L'intégrité du cytosquelette d'actine et notamment la protéine WASP s'avèrent importantes pour la formation de la ceinture de nano-clusters de LFA-1, comme le montre le défaut de formation de cette ceinture dans les lymphocytes de patients WAS. L'approche de SIM multi-couleur nous a permis de révéler le rôle de la ceinture de LFA-1 dans le confinement des granules lytiques. Par comparaison de marquages avec des anticorps spécifiques de différentes conformations de LFA-1, notre travail montre également que l'activation de LFA-1 s'opère de manière digitale, dans le sens où les nano-clusters fonctionnent comme des unités au sein desquelles l'activation de LFA-1 suit une loi du tout ou rien. En conclusion, ce travail de thèse démontre l'intérêt des approches de microscopie de super-résolution pour révéler des mécanismes clefs de l'activation des lymphocytes T et pour appréhender la nature des défauts à l'origine de dérèglements pathologiques de la fonction de ces cellules. / LFA-1 (Lymphocyte Function Associated antigen-1) is a central integrin in the function of cytotoxic CD8+ T lymphocytes since it allows the formation of the immunological synapse with target cells. The regulation of this cellular interaction is controlled by the quality of the engagement of LFA-1 with its ligand, ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule- 1). A key support for the spatio-temporal control of LFA-1 activation is the cortical actin cytoskeleton in which LFA-1 is anchored by its intracellular domain. How LFA-1 is organized at the immunological synapse and how the coordination between LFA-1 and actin cytoskeleton operates accurately within cytotoxic CD8+ T lymphocytes are unresolved issues. The aim of this thesis project was to study the precise organization of the LFA-1 distribution at the immunological synapse in relation to the cortical actin underlying the contact between cytotoxic T lymphocytes and target cells. For this purpose, super-resolution microscopy approaches, including SIM (Structured Illumination Microscopy), dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) and TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy) were developed. They were applied to untransformed human T lymphocytes derived from healthy donors and patients with a congenital immunodeficiency, the Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS), characterized by actin cytoskeleton remodeling defects at the synapse. The use of the dSTORM approach revealed that activated LFA-1 forms a radial belt composed of hundreds of nanoclusters. The assembly of this belt depends on the integrity of the actin cytoskeleton, as shown by the impairment of this structure in the T lymphocytes derived from the WAS patients. The multi-color SIM approach allowed us to investigate the role of the LFA-1 belt in the confinement of lytic granules. Furthermore, the combination of staining with antibodies specific of LFA-1 conformation states shows that LFA-1 activation is a digital process, whereby nanoclusters operate as units in which LFA-1 activation follows an on / off rule. In conclusion, this PhD work exemplifies the great asset of super-resolution microscopy approaches to reveal key activation mechanisms in T lymphocytes and explore the nature of the defects causing pathological dysregulation of the function of these cells.

Computational methods in single molecule localization microscopy Abstract Fluorescence microscopy is one of the chief tools used in biomedical research as it is a non invasive, non destructive, and highly specific imaging method. Unfortunately, an optical microscope is a diffraction limited system. Maximum achievable spatial resolution is approximately 250 nm laterally and 500 nm axially. Since most of the structures in cells researchers are interested in are smaller than that, increasing resolution is of prime importance. In recent years, several methods for imaging beyond the diffraction barrier have been developed. One of them is single molecule localization microscopy, a powerful method reported to resolve details as small as 5 nm. This approach to fluorescence microscopy is very computationally intensive. Developing methods to analyze single molecule data and to obtain super-resolution images are the topics of this thesis. In localization microscopy, a super-resolution image is reconstructed from a long sequence of conventional images of sparsely distributed single photoswitchable molecules that need to be sys- tematically localized with sub-diffraction precision. We designed, implemented, and experimentally verified a set of methods for automated processing, analysis and visualization of data acquired...

Les méthodes de microscopie de super-résolution (SRM) telles que la microscopie PALM (photoactivated localization microscopy), STORM (stochastic optical reconstruction microscopy), BALM (binding-activated localization microscopy) et le DNA-PAINT, représentent un nouvel ensemble de techniques de microscopie optique qui permettent de surpasser la limite de diffraction ( > 200 nm dans le spectre visible). Ces méthodes sont basées sur la localisation de la fluorescence de molécules uniques, et peuvent atteindre des résolutions de l'ordre du nanomètres (~20 nm latéralement et 50 nm axialement). Les techniques SRM ont un large spectre d'applications dans les domaines de la biologie et de la biophysique, rendant possible l'accès à l'information tant dynamique que structurale de structures connues ou non, in vivo et in vitro. Beaucoup d'efforts ont été fournis durant la dernière décennie afin d'élargir le potentiel de ces méthodes en développant des méthodes de localisation à la fois plus précise et plus rapide, d'améliorer la photophysique des fluorophores, de développer des algorithmes pour obtenir une information quantitative et augmenter la précision de localisation, etc. Cependant, très peu de méthodes ont été développées pour examiner l'hétérogénéité des images et extraire les informations statistiquement pertinent à partir de plusieurs milliers d'images individuelles super-résolues. Dans mon travail de thèse, je me suis spécifiquement attaquée à ces limitations en: (1) construisant des objets de dimensions nanométriques et de structures bien définies, avec la possibilité d'être adaptés aux besoins. Ces objets sont basés sur les origamis d'ADN. (2) développant des approches de marquage afin d'acquérir des images homogènes de ces objets. (3) implémentant des outils statistiques dans le but d'améliorer l'analyse et la validation d'images. Ces outils se basent sur des méthodes de reconstruction de molécules uniques communément appliquées aux reconstructions d'images de microscopie électronique. J'ai spécifiquement appliqué ces développements à la reconstruction de formes 3D de deux origamis d'ADN modèles (en une et trois dimensions). Je montre comment ces méthodes permettent la dissection de l'hétérogénéité de l'échantillon, et la combinaison d'images similaires afin d'améliorer le rapport signal sur bruit. La combinaison de différentes classes moyennes ont permis la reconstruction des formes tridimensionnelles des origamis d'ADN. Particulièrement, car cette méthode utilise la projection 2D de différentes vues d'une même structure, elle permet la récupération de résolutions isotropes en trois dimensions. Des fonctions spécifiques ont été adaptées à partir de méthodologies existantes afin de quantifier la fiabilité des reconstructions et de leur résolution. A l'avenir, ces développements seront utiles pour la reconstruction 3D de tous types d'objets biologiques pouvant être observés à haute résolution par des méthodologies dérivées de PALM, STORM ou PAINT. / Super resolution microscopy (SRM) methods such as photoactivated localization microscopy (PALM), stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), binding-activated localization microscopy (BALM) and DNA-PAINT represent a new collection of light microscopy techniques that allow to overpass the diffraction limit barrier ( > 200 nm in the visible spectrum). These methods are based on the localization of bursts of fluorescence from single fluorophores, and can reach nanometer resolutions (~20 nm in lateral and 50 nm in axial direction, respectively). SRM techniques have a broad spectrum of applications in the field of biology and biophysics, allowing access to structural and dynamical information of known and unknown biological structures in vivo and in vitro. Many efforts have been made over the last decade to increase the potential of these methods by developing more precise and faster localization techniques, to improve fluorophore photophysics, to develop algorithms to obtain quantitative information and increase localization precision, etc. However, very few methods have been developed to dissect image heterogeneity and to extract statistically relevant information from thousands of individual super-resolved images. In my thesis, I specifically tackled these limitations by: (1) constructing objects with nanometer dimensions and well-defined structures with the possibility of be tailored to any need. These objects are based on DNA origami. (2) developing labeling approaches to homogeneously image these objects. These approaches are based on adaptations of BALM and DNA-PAINT microscopies. (3) implemented statistical tools to improve image analysis and validation. These tools are based on single-particle reconstruction methods commonly applied to image reconstruction in electron microscopy.I specifically applied these developments to reconstruct the 3D shape of two model DNA origami (in one and three dimensions). I show how this method permits the dissection of sample heterogeneity, and the combination of similar images in order to improve the signal-to-noise ratio. The combination of different average classes permitted the reconstruction of the three dimensional shape of DNA origami. Notably, because this method uses the 2D projections of different views of the same structure, it permits the recovery of isotropic resolutions in three dimensions. Specific functions were adapted from previous methodologies to quantify the reliability of the reconstructions and their resolution.In future, these developments will be helpful for the 3D reconstruction of any biological object that can be imaged at super resolution by PALM, STORM or PAINT-derived methodologies.

Synapse is the fundamental unit of synaptic transmission. Learning, memory and neurodegenerative diseases of the brain are attributed to the maintenance and alteration in synaptic connections. The efficiency for synaptic transmission depends on how well the post synapse receives the signals from the presynapse; this in turn depends on the receptors present in the post synaptic density (PSD). PSD is present in the post synapse right opposite to the neurotransmitter release site in presynapse (active zone) is an indispensable part of the synapse. The PSD is comprised of receptors and scaffold proteins, which is ultimately supported by the actin cytoskeleton of the dendritic spines. Cytoskeletal dynamics is shown to influence the structural plasticity of spine and also PSD, but how it regulates the dynamicity of the synaptic transmission is not completely understood. Here we studied the influence of actin depolymerisation on sub synaptic organization of an excitatory synapse. In order to study the organization of the synapse at molecular resolution, the conventional microscopy cannot be employed due to the limit of diffraction. Super resolution microscopy circumvents this diffraction limitation. In this study we have used custom built fluorescence microscope with Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) modality to observe the nanometre sized structures inside spines of mouse hippocampal primary neurons. The setup was integrated with Metamorph imaging software for both operating the microscope and imaging acquisition purpose with a separate appropriate laser system. This setup was successful in achieving the lateral resolution of ~30nm and axial resolution of ~51nm. Over all we were able to observe the loss of spines and significant reduction in area of nanometer sized protein clusters in postsynaptic density with in the spines of latrunculin A treated mouse hippocampal primary neurons compared to the native neurons. Along with the morphological alterations in neurons we also observed the changes in nanoscale organization of few key molecules in the postsynaptic density.

Le cerveau est formé d’un réseau complexe de neurones responsables de nos fonctions cognitives et de nos comportements. Les neurones reçoivent via des contacts spécialisés nommés « synapses », des signaux d’autres neurones.[...] Le mécanisme par lequel les neurones reçoivent, intègrent et transmettent ces informations est très complexe et n'est toujours pas parfaitement compris. Dans les synapses excitatrices, les récepteurs AMPA (AMPARs) sont responsables de la transmission synaptique rapide. Les récents développements en microscopie de super résolution ont permis à la communauté scientifique de changer la vision de la transmission synaptique. Une première avancée fait suite à l’observation que les AMPARs ne sont pas distribués de façon homogène dans les synapses, mais sont organisés en nanodomaines de ~ 80 nm de diamètre contenant ~ 20 récepteurs. Ce contenu est un facteur important pour déterminer l'amplitude de la réponse synaptique. En raison de la basse affinité des AMPARs pour le glutamate, un AMPAR ne peut être activé que lorsqu'il est situé dans une zone de ~ 150 nm en face du site de libération des neurotransmetteurs. Récemment, il a été montré que les nanodomaines d’AMPARs sont situés en face de ces sites de libération, formant des nano-colonnes trans-synaptiques à l'état basal. Cette organisation précise à l’échelle nanométrique semble être un facteur clé dans l'efficacité de la transmission synaptique. Une autre avancée a été l'observation que les AMPARs diffusent à la surface des neurones et sont immobilisés à la synapse pour participer à la transmission synaptique. L'échange dynamique entre le pool diffusif d’AMPARs et les récepteurs immobilisés dans les nanodomaines participe au maintien de l’efficacité de la réponse synaptique lors de stimulations à hautes fréquences. L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle des paramètres indiqués ci-dessus sur les propriétés de la transmission synaptique, à l'état basal et au cours de phénomènes dits de plasticité synaptique. Tout d'abord, nous avons identifié le rôle crucial de la Neuroligine dans l'alignement des nanodomaines d’AMPARs avec les sites de libération du glutamate. En plus de cela, nous avons mis en évidence l’impact de cet alignement sur l’efficacité de la transmission synaptique en perturbant celui-ci. En parallèle, nous avons démontré que les AMPARs désensibilisés sont plus mobiles à la membrane plasmatique que les récepteurs ouverts ou fermés, et ce, en raison d'une diminution de leur affinité pour les sites d’immobilisation synaptiques. Nous avons montré que ce mécanisme permettait aux synapses de récupérer plus rapidement de la désensibilisation et d'assurer la fidélité de la transmission synaptique lors de stimulations à hautes fréquences. Enfin, les synapses peuvent moduler leurs intensités de réponse grâce à des mécanismes de plasticité synaptique à long terme, et plus particulièrement, la dépression à long terme (LTD) qui correspond à un affaiblissement durable de ce poids synaptique. [...] À la suite des découvertes précédentes concernant le rôle de la nano-organisation dynamique des AMPARs pour réguler le poids et la fiabilité de la transmission synaptique, j'ai décidé d'étudier leur rôle dans l'affaiblissement et la sélection des synapses. J'ai découvert que la quantité d’AMPAR par nanodomaine diminue rapidement et durablement. Cette première phase semble due à une augmentation de l’internalisation des AMPARs. Dans un deuxième temps, la mobilité des AMPARs augmente suite à une réorganisation moléculaire de la synapse. Ce changement de mobilité des AMPARs permet aux synapses déprimées de maintenir leur capacité à répondre aux signaux neuronaux à hautes fréquences. Ainsi, nous proposons que l'augmentation de la mobilité des AMPARs au cours de la LTD permet de transmettre une réponse fidèle dans les synapses stimulées à hautes fréquences et donc de sélectivement les maintenir tout en éliminant les synapses inactives. / The brain is a complex network of interconnected neurons responsible for all our cognitive functions and behaviors. Neurons receive inputs at specialized contact zones named synapses which convert an all or none electrical signal to a chemical one, through the release of neurotransmitters. This chemical signal is then turned back in a tunable electrical signal by receptors to neurotransmitters. However, a single neuron receives thousands of inputs coming from several neurons in a spatial- and temporal-dependent manner. The precise mechanism by which neurons receive, integrate and transmit this synaptic inputs is highly complex and is still not perfectly understood. At excitatory synapses, AMPA receptors (AMPARs) are responsible for the fast synaptic transmission. With the recent developments in super-resolution microscopy, the community has changed its vision of synaptic transmission. One breakthrough was the discovery that AMPARs are not randomly distributed at synapses but are organized in nanodomains of ~80 nm of diameter containing ~20 receptors. This content is an important factor since it will determine the intensity of the synaptic response. Due to their mM affinity for glutamate, AMPARs can only be activated when located in an area of ~150 nm in front of the neurotransmitter release site. Recently, AMPAR nanodomains have been shown to be located in front of glutamate release sites and to form trans-synaptic nanocolumns at basal state. Thus, the nanoscale organization of AMPARs regarding release sites seems to be a key parameter for the efficiency of synaptic transmission. Another breakthrough in the field was the observation that AMPARs diffuse at the cell surface and are immobilized at synapses to participate to synaptic transmission. The dynamic exchange between AMPAR diffusive pool and the receptors immobilized into the nanodomains participates to maintain the efficiency of synaptic response upon high-frequency stimulation.The overall aim of my PhD has been to determine the role of each above listed parameters on the intimate properties of synaptic transmission both at basal state and during synaptic plasticity. First, we identified the crucial role of Neuroligin in the alignment of AMPAR nanodomains with glutamate release sites. In addition, we managed to break this alignment to understand its impact on synaptic transmission properties. In parallel, we demonstrated that, due to a decrease in their affinity for synaptic traps, desensitized AMPARs diffuse more at the plasma membrane than opened or closed receptors. This mechanism allows synapses to recover faster from desensitization and ensure the fidelity of synaptic transmission upon high-frequency release of glutamate. Finally, synapses can modulate their strength through long-term synaptic plasticity, in particular, Long-Term Depression (LTD) corresponds to a long-lasting weakening of synaptic strength and is thought to be important in some cognitive processes and behavioral flexibility through synapse selective elimination. Following the previous discoveries about the impact of AMPAR dynamic nano-organization at synapses on the regulation of the synaptic transmission strength and reliability, I decided to investigate their role in the weakening of synapses. I found that AMPAR nanodomain content drops down rapidly and this depletion last several minutes to hours. The initial phase seems due to an increase of endocytosis events, but in a second phase, AMPAR mobility is increased following a reorganization of the post-synaptic density. This change in mobility allows depressed synapses to maintain their capacity to answer to high-frequency inputs. Thus, we propose that LTD-induced increase in AMPAR mobility allows to conduct a reliable response in synapses under high-frequency stimulation and thus to selectively maintain them while eliminating the inactive ones.

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a powerful approach to investigate the molecular ultrastructure of labeled cell compartments. However, quantitative CLEM studies are rare, mainly due to small sample sizes and the sensitivity of fluorescent proteins to strong fixatives and contrasting reagents for EM. Here, we show that fusion of a self-labeling protein to insulin allows for the quantification of age-distinct insulin granule pools in pancreatic beta cells by a combination of super resolution and transmission electron microscopy on Tokuyasu cryosections. In contrast to fluorescent proteins like GFP organic dyes covalently bound to self-labeling proteins retain their fluorescence also in epoxy resin following high pressure freezing and freeze substitution, or remarkably even after strong chemical fixation. This enables for the assessment of age-defined granule morphology and degradation. Finally, we demonstrate that this CLEM protocol is highly versatile, being suitable for single and dual fluorescent labeling and detection of different proteins with optimal ultrastructure preservation and contrast.

Les épines dendritiques sont de petites protrusions post-synaptiques présentant des changements morphologiques corrélés avec la plasticité synaptique. Elles ont pour origine les filopodes dendritiques qui s’élargissent lors du contact avec l’axone. Ces changements morphologiques impliquent une grande variété de molécules dont des protéines associées à l’actine et des protéines d’adhésion. Cependant, comment ces différentes protéines sont coordonnées dans le temps et l’espace est encore largement méconnu. De plus, les techniques de microscopie conventionnelle ne permettent pas d’étudier l’organisation et la dynamique de ces protéines dans les épines dont la taille est proche de la limite de resolution. L’objectif de ma thèse a donc été d’explorer le rôle des protéines associées à l’actine ainsi que celui des protéines d’adhésion N-cadhérines dans l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine des épines dendritiques. Dans une première étude, nous avons suivi la motilité des filopodes et épines dendritiques de neurones en visualisant l’actine-GFP. Nous avons couplé cette approche avec : 1) une technique de piégeage optique de microsphères recouvertes de N-cadhérines ou des substrats micro-imprimés également recouverts de N-cadhérines afin de contrôler temporellement et spatialement les adhésions cadhérine-cadhérine, 2) la stimulation pharmacologique de la myosine II afin d’induire la contraction F-actine/myosine et 3) l’expression de mutants de N-cadhérine non adhésifs. Nous avons ainsi démontré que la stabilisation des filopodes en épines était dépendante de l’engagement d’un embrayage moléculaire entre les adhésions trans-synaptiques N-cadhérine et le flux rétrograde d’actine généré par les myosines II. Dans une deuxième étude, nous avons utilisé la microscopie super-résolutive (PALM et dSTORM) et le suivi de protéines individuelles (sptPALM) pour étudier l’organisation et la dynamique à l’échelle nanométrique des protéines à l’origine des réseaux d’actine branchés dans les épines. Ainsi, nous avons caractérisé la localisation et la dynamique de l’actine, du complexe Arp2/3, du complexe WAVE, d’IRSp53, de VASP et de Rac-1. Nous avons montré que, contrairement aux structures motiles classiques comme lamellipode, le réseau d’actine branché dans les épines n’ést pas formé aux extrémités protrusives puis incorporé dans un flux rétrograde d’actine. Ce réseau est initié à la PSD puis croît vers l’extérieur afin de générer les protrusions membranaires responsablent des changements morphologiques de l’épine. Nos résultats montrent également qu’un contrôle strict de l’activité de Rac-1 est nécessaire au maintien de la morphologie des épines dendritiques et de l’architecture du réseau d’actine branché. L’ensemble de mon travail souligne l’importance du rôle de l’organisation à l’échelle nanométrique du réseau d’actine branché et des adhésions N-cadhérine dans la dynamique et la formation des épines dendritiques. Ces résultats pourraient avoir un rôle important dans la compréhension des changements morphologiques lors de la plasticité synaptique. / Dendritic spines are tiny post-synaptic protrusions exhibiting changes in morphology correlated with synaptic plasticity. They originate from motile dendritic filopodia, which enlarge after contacting axons. These morphological changes involve a wide number of molecular actors, including actin-binding proteins, and adhesion molecules. However, how these various molecular components are coordinated temporally and spatially to tune changes in spine shape remains unclear. Furthermore, conventional photonic microscopy techniques could not achieved the spatial resolution required to study the dynamic nanoscale organization of these proteins within the micron size dendritic spines. The objective of my Ph.D. was to unravel how actin-binding proteins and N-cadherin adhesion regulate the organization and dynamics of F-actin network in dendritic spines. In a first study, we measured the motility of dendritic filopodia and spines by time lapse imaging of actin-GFP in primary hippocampal neurons. We combined those measurements with: 1) manipulation of N-cadherin coated beads with optical tweezers, or micropatterns to control the timing and location of nascent N-cadherin adhesions, 2) pharmacological stimulation of myosin II to trigger contraction of the F-actin/myosin network and 3) expression of non-adhesive N-cadherin mutants to compete for the interaction between N-cadherin adhesion and F-actin. Using these different approaches we demonstrated that the stabilization of dendritic filopodia into mature spines was dependent on the engagement of a molecular clutch between trans-synaptic N-cadherin adhesions and the myosin driven F-actin flow. In a second study, we used super resolution microscopy (PALM and dSTORM) and single protein tracking (sptPALM) to study the dynamic nanoscale organizations of branched actin networks within dendritic spines. Using these technics, we characterized within dendritic spines, the localization and dynamics of actin, Arp2/3 complex, WAVE complex, IRSp53, VASP and Rac-1. We established that, opposite to classical motile structures such as the lamellipodium, branched F-actin networks in dendritic spines are not formed at the tip of membrane protrusions and incorporated in a retrograde flow. On the contrary, they are growing outwards from the PSD generating membrane protrusions responsible for spine motility. We also show that a thigh control of Rac1 activity is required to maintain dendritic spine morphology and branched actin network organization. Altogether, these studies point out the role of the nanoscale functional organization of F-actin networks and its linkage to adhesion proteins in the regulation of dendritic spine formation and dynamics. These findings may have important implications in the understanding of spine morphology changes driven by synaptic activity.

Computational methods in single molecule localization microscopy Abstract Fluorescence microscopy is one of the chief tools used in biomedical research as it is a non invasive, non destructive, and highly specific imaging method. Unfortunately, an optical microscope is a diffraction limited system. Maximum achievable spatial resolution is approximately 250 nm laterally and 500 nm axially. Since most of the structures in cells researchers are interested in are smaller than that, increasing resolution is of prime importance. In recent years, several methods for imaging beyond the diffraction barrier have been developed. One of them is single molecule localization microscopy, a powerful method reported to resolve details as small as 5 nm. This approach to fluorescence microscopy is very computationally intensive. Developing methods to analyze single molecule data and to obtain super-resolution images are the topics of this thesis. In localization microscopy, a super-resolution image is reconstructed from a long sequence of conventional images of sparsely distributed single photoswitchable molecules that need to be sys- tematically localized with sub-diffraction precision. We designed, implemented, and experimentally verified a set of methods for automated processing, analysis and visualization of data acquired...