Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10831_122ª Ata de Defesa - Paola Fernandes Pansini.PDF: 76 bytes, checksum: e777df9eb60d248d167e2edfa6e23421 (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto tipo de câncer mais comum em todo o mundo. Nos últimos anos, tem sido sugerida a participação da survivina na progressão tumoral em CECP. Este estudo teve como objetivo avaliar a survivina como potencial biomarcador de progressão tumoral em CECB. Foram utilizados no estudo dados clínicos e amostras biológicas de 115 indivíduos com carcinoma epidermóide da cavidade bucal. Lâminas contendo tecidos tumorais coradas pelo método hematoxilina e eosina foram usadas para as análises histopatológicas para avaliar o infiltrado linfocitário tumoral, padrão de invasão tumoral, gradação tumoral, invasão vascular, linfática e perineural. Tissue Microarrays foram construídos para realizar a análise imunohistoquímica da expressão da proteína survivina utilizando o anticorpo primário monoclonal de coelho anti-survivina. Para avaliar as associações entre as variáveis estudadas foram utilizados os testes Qui-Quadrado e o Exato de Fisher. A comparação das médias dos segmentos foi obtida pelo teste T de amostras independentes. As curvas de sobrevida foram calculadas pelo modelo de Kaplan-Meier e confirmadas pelo modelo multivariado de Cox. Nossos resultados mostraram existir correlação entre o infiltrado linfocitário tumoral alto, tamanho do tumor primário T1/T2 (p = 0,001) e estadiamento clínico I e II (p = 0,005). O padrão de invasão tumoral tipo IV foi correlacionado com o tamanho do tumor primário T3/T4 (p = 0,006) e estadiamento clínico avançado (estádio III e IV) (p = 0,028). Invasão perineural foi associada com o tamanho do tumor primário T1/T2 (p = 0,035). A expressão nuclear da survivina na porção mediana do tumor mostrou associação com a metástase em linfonodos regionais (p = 0,004) e o estadiamento clínico (p = 0,041). A análise regressiva multivariada confirmou que as variáveis tamanho do tumor primário (p = 0,004) e acometimento linfonodal (p= 0,06) são fatores prognósticos independentes para sobrevida global, enquanto o etilismo influencia na sobrevida livre de doença (p = 0,048). Com este estudo pode-se concluir que a elevada expressão da survivina está correlacionada com o comportamento tumoral mais agressivo, estadiamento clínico avançado, presença de mestástase linfonodal, podendo ser considerada como indicador de prognóstico em pacientes com CECB. A variável histopatológica padrão de invasão tumoral mostrou que sua correlação com tamanho do tumor primário e estadiamento clínico avançado podendo estar relacionada ao pior prognóstico dos pacientes em CECB.

O Glioblastoma é um dos tumores mais agressivos do sistema nervoso central e entre as diversas neoplasias possui um dos piores prognósticos. Mesmo com as novas estratégias de tratamento, a sobrevida de pacientes portadores de glioblastoma continua sendo muito baixa, sendo a temozolomida (TMZ) o agente mais comum usado no seu tratamento. O ácido tetra-o-metil nordihidroguaiarético (M4N), é um novo agente terapêutico que funciona como um repressor transcricional global de genes dependentes do fator de transcrição Sp1, tais como Survivina e Cdk1. No presente estudo, foram investigados os níveis de expressão do gene Survivina, suas variantes gênicas por splicing alternativo e Cdk1 em amostras tumorais e linhagens celulares de GBM. Adicionalmente, foram investigados os efeitos do M4N em combinação ou não com TMZ e/ou radiação em culturas primárias e linhagens celulares de GBM. Ensaios de qRT-PCR foram realizados para determiner a expressão de mRNA das variantes gênicas de Survivina e Cdk1. A proliferação celular foi analisada pelo ensaio XTT e os niveis de apoptose e variações do ciclo celular foram determinados por citometría de fluxo. Analises de combinação de drogas utilizando diferentes estratégias de administração (simultânea e seqüencial) foram realizados baseados no método de Chou-Talalay em linhagens celulares e culturas primárias de GBM. Para os ensaios de sobrevivência clonogênica, foram utilizadas as doses de 2, 4 e 6 Gy de radiação gamma. Todas as variantes por splicing alternativo de Survivina e o gene Cdk1 foram expressos em amostras (n=16) e linhagens celulares (n=6) de GBM, exceto a variante Survivina-2B que apenas foi expressa nas linhagens celulares de GBM. O tratamento com M4N diminuiu a expressão de Cdk1, Survivina e a variante Survivina-Ex3, enquanto que houve um aumento da expressão da variante Survivina-2B. O M4N diminuiu a proliferação celular de forma isolada e sinérgicamente quando combinada com TMZ. Além disso, o M4N aumentou os efeitos da radiação, principalmente quando associado com TMZ. O M4N causou morte celular apoptótica, diminuição do índice mitótico e parada do ciclo celular principalmente na fase x G2/M. Os resultados do presente estudo sugerem a potencial aplicação clínica de M4N em combinação com TMZ e radiação no tratamento do GBM. / Glioblastoma (GBM), one of the most human malignant neoplasia, responds poorly to current treatment modalities, being temozolomide (TMZ) the most used drug in its treatment. TetraO-methyl Nordihydroguaiaretic Acid (M4N) is a global transcriptional repressor of genes dependents of Sp1 transcription factor, such as Survivin and Cdk1. In this study was evaluated the gene expression of Survivin, their spliced-variants and Cdk1 in GBM samples and cell lines. Moreover, it was investigated the effects of M4N combined or not with TMZ and/or radiation on primary cultures and cell lines of GBM. qRT-PCR assays were performed to determine the Survivin-spliced variants and Cdk1 gene mRNA expression in GBM tumor samples and cell lines. Cell proliferation was measured by XTT assay and cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry. Drug combination analyzes using different schedules of administration (simultaneous and sequential) were performed based in ChouTalalay method on GBM cell lines and primary cultures. For clonogenic survival, it was used the doses of 2, 4, and 6 Gy of gamma radiation. All Survivin-spliced variants and Cdk1 gene were expressed in GBM samples (n=16) and cell lines (n=6), except the Survivin-2B variant that was only expressed in GBM cell lines. M4N treatment down regulated the expression of Cdk1, Survivin and Survivin-Ex3 variant, while the Survivin-2B variant was up-regulated. M4N decreased the cell proliferation separately and synergistically with TMZ, moreover it enhanced the radiation effects, mainly when associated with TMZ. M4N also induced apoptotic cell death, decreased mitotic index and arrested the cell cycle mainly in G2/M phase. Our results suggest a potential clinical application of M4N in combination with TMZ and radiation in GB treatment.

O câncer colorretal (CCR) é importante causa de morte no Brasil, representando a segunda causa de morbimortalidade por câncer nas regiões Sudeste e Sul. Foi uma das primeiras neoplasias malignas a ter modelo de carcinogênese identificado. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão do NF-KB e da survivina na progressão do CCR, sua relação com alvos moleculares envolvidos na sobrevivência celular [proibitina, fator de necrose tumoral (TNFR1), p53, B- catenina]; invasão (metaloproteinases 2 e 9 - MMP), angiogênese (fator de crescimento endotelial vascular VEGF) e apoptose (caspase 3 e método do Túnel). Trata-se de estudo retrospectivo baseado na análise histopatológica de dezoito casos de adenomas com displasia de alto (AG) e baixo grau (BG), respectivamente; dez casos de adenocarcinoma bem, moderado e pouco diferenciado, respectivamente, nove casos de lesões serrilhadas e nove biópsias colorretais (controle) selecionados aleatoriamente no Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, no período de 2000 a 2009. Foram construídos arranjos de matriz tecidual para representar os casos de adenocarcinomas e cinco casos de adenomas >1 cm de diâmetro. A detecção do NF-KB foi realizada pelo método de Southwestern imunoistoquímica. Avaliou-se a expressão imunoistoquímica da survivina, proibitina, TNFR1, p53, B-catenina, MMPs 2 e 9, VEGF, caspase 3 e Túnel. Não observamos expressão imunoistoquímica do NF-KB em 70% dos casos de adenocarcinomas, em 72% dos adenomas AG e em 89% das lesões serrilhadas; a marcação foi positiva em 66% e 56% dos casos de adenoma do BG e controle, respectivamente. Expressões da survivina, proibitina citoplasmática, TNFR1, p53, MMP 2 e 9 foram crescentes na seqüência adenoma-carcinoma, sem aparente modulação pelo NF-KB. A survivina suprimiu ação da caspase 3, exceto nos adenomas BG e controle, com baixos níveis de apoptose ao túnel. Lesões serrilhadas e controle apresentaram baixa expressão do TNFR1 e da proibitina citoplasmática, ausência de marcação da p53 e MMPs 2 e 9, exceto um caso controle. Identificou-se marcação nuclear da proibitina nos adenocarcinomas pouco diferenciados, adenomas AG e BG. A expressão da p53 relacionou-se ao grau de displasia nos adenomas e à desregulação da survivina. Observou-se expressão citoplasmática e nuclear da B- catenina nos adenocarcinomas, adenomas AG e BG. As lesões serrilhadas exibiram expressão citoplasmática em 44% dos casos. O grupo controle exibiu expressão preservada da B-catenina. Identificou-se expressão do VEGF nos adenocarcinomas, relacionada à perda de diferenciação celular, presença de metástases, não correlacionada ao NF-KB. Com base nos nossos resultados, sugerimos a desregulação da B- catenina como possível responsável pela inibição do NF-KB; além de sua participação na desregulação da survivina juntamente com a p53. As lesões serrilhadas não exibiram indícios sugestivos de inibição do NF- KB pela B-catenina.A survivina, devido propriedades anti-apoptóticas, emerge como potencial alvo terapêutico no tratamento do CCR, confirmando estudos anteriores. / Colorectal cancer (CRC) is an important cause of death in Brazil, representing the second leading cause of cancer mortality in the Southeast and South. It was among the first malignancies that have the carcinogenesis model identified.The aim of this study was to evaluate the expression of NF-KB and survivin in the progression of CRC, its relationship with molecular targets involved in cell survival [prohibitin, tumor necrosis factor (TNFR1), p53,B-catenina], invasion (metalloproteinases 2 and 9 - MMP), angiogenesis (vascular endothelial growth factor VEGF) and apoptosis (caspase 3 and method Tunnel). This is a retrospective study based on the histopathological analyses of eighteen cases of high- (HG) and low- grade dysplastic (LG) adenomas, respectively; ten cases of adenocarcinoma well, moderately and poorly differentiated, respectively, nine cases of serrated lesions e nine biopsies (control); randomly selected in the Pathology Service of the University Hospital of the Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo from 2000 to 2009. Tissue microarray were constructed to represent the cases of adenocarcinomas and five cases of adenomas > 1cm in diameter. Detection of NF-KB was performed by the Southwestern immunohistochemistry method. We evaluated immunohistochemical expression of survivin, prohibitin, TNFR1, p53, B- catenin, MMPs 2 and 9, VEGF, caspase 3 and method Tunnel. We did not observe immunohistochemical expression of NF-KB in 70% of cases of adenocarcinomas, in 72% of HG adenomas and 89% of lesions serrated; staining was positive in 66% and 56% of cases of LG adenoma and control, respectively. Expressions of survivin, cytoplasmic prohibitin, TNFR1, p53, MMPs 2 and 9 were increasing in adenoma-carcinoma sequence, without apparent modulation by NF-KB. Survivin suppressed action of caspase 3, except in BG adenomas and control, with low levels of apoptosis to the tunnel. Serrated lesions and control showed low expression of TNFR1 and cytoplasmic prohibitin, the absence of staining of p53 and MMPs2 and 9, except for one control. We identified nuclear staining of prohibitin in poorly differentiated adenocarcinomas, HG and LG adenomas. Expression of p53 was related to the grade of dysplasia in adenomas and deregulation of survivin.The expression of the cytoplasmic and nuclear B-catenin was observed in adenocarcinoma, HG and LG adenoma. Serrated lesions exhibited cytoplasmic expression in 44% of cases. Control group exhibited preserved expression of B-catenin. It was identified VEGF expression in adenocarcinomas, related to the loss of cellular differentiation, metastasis, not correlated with NF-KB. According to our results, we suggest that deregulation of catenin is possible responsible for the inhibition of NF-KB besides their participation in the deregulation of survivin with p53.Serrated lesions exhibited no evidence suggestive of inhibition of NF-KB by B-catenin. Survivin emerges as a potential therapeutic target in the treatment of CRC due to their anti-apoptotic properties, confirming previous studies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-19Bitstream added on 2014-06-13T20:01:19Z : No. of bitstreams: 1 lima_cf_dr_sjc.pdf: 574864 bytes, checksum: cf6904339556fc2b74794049e1675fbe (MD5) / A survivina é uma proteína inibidora da apoptose que desempenha papel de controle no ciclo celular e no mecanismo de carcinogênese. Este trabalho teve como proposição verificar a correlação clinicopatológica da expressão da survivina nas diferentes condições relacionadas à carcinogênese intra-bucal humana, o que pode ser útil para destacar aspectos importantes das etapas da carcinogênese bucal. Foram constituídos três grupos, formados em parte por material citológico coletado de pacientes participantes do Programa Ambulatorial de Tratamento de Tabagismo do Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (INCOR-HCFMUSP); e por material que se encontra incluído em blocos de parafina no Laboratório de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos FOSJC – UNESP. O primeiro grupo foi constituído por material citológico obtido do bordo lateral lingual esquerdo e soalho bucal de 30 pacientes que fumavam mais de 20 cigarros/dia/10anos e que não apresentavam histórico de neoplasia bucal maligna, nem sinais clínicos visíveis no local avaliado; o segundo grupo foi constituído por amostras teciduais de 21 pacientes com lesões brancas clinicamente classificadas como leucoplasias. O terceiro grupo foi formado por 42 amostras teciduais de pacientes com diagnóstico de carcinoma epidermóide bucal. Os pacientes que foram submetidos à citologia esfoliativa foram examinados através de anamnese, exame clínico extra e intra -bucal. A citologia esfoliativa foi realizada com cytobrush para obtenção de duas lâminas de cada local selecionado. Após a realização da imunoistoquímica com anticorpo primário anti-survivina as lâminas foram analisadas qualitativamente através da microscopia óptica. Uma lâmina de assoalho e uma de língua foram coradas e avaliadas pelo método de Papanicolaou... / Survivin is an inhibitor of apoptosis protein that plays a role in cell cycle control and the mechanism of carcinogenesis. The aim of the present work was to study the clinicopathological correlation of survivin expression in different conditions related to intra-oral carcinogenesis. This may be useful to highlight important aspects of oral carcinogenesis steps. Three groups were analyzed. They were formed in part by cytological material collected from patients of Heart Institute’s Patient Center and the Smoking Cessation Program of the University Hospital, University of São Paulo Medical School (INCOR-HCFMUSP) and material of Laboratory of Oral Pathology, São José dos Campos Dental School. The first group consisted of cytologic material obtained from the left side of the tongue and mouth floor of 30 patients who smoked more than 20 cigarrettes/day/10years and had no history of malignant oral neoplasm or clinical signs at the site evaluated; the second group consisted of tissue samples from 21 patients with white lesions clinically classified as leukoplakia. The third group consisted of 42 tissue samples from patients diagnosed with oral squamous cell carcinoma. Patients who underwent exfoliative cytology were examined by medical history, extra and intra-oral clinical examination. The exfoliative cytology was performed using cytobrush to obtain two smears of each selected location. After performing the immunohistochemistry for anti-survivin the slides were analyzed qualitatively by light microscopy. One smear of mouth floor and tongue was stained and evaluated by the method of Papanicolaou. Statistical analysis was performed by Fisher's exact test, Mann-Whitney and X2. Survivin was positive in 100% of cytological material from the smokers, 85.7% of oral leukoplakia and 83.3% of oral squamous cell carcinoma. Fisher's exact test showed no association between the expression... (Complete abstract click electronic access below)

O câncer colorretal (CCR) é importante causa de morte no Brasil, representando a segunda causa de morbimortalidade por câncer nas regiões Sudeste e Sul. Foi uma das primeiras neoplasias malignas a ter modelo de carcinogênese identificado. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão do NF-KB e da survivina na progressão do CCR, sua relação com alvos moleculares envolvidos na sobrevivência celular [proibitina, fator de necrose tumoral (TNFR1), p53, B- catenina]; invasão (metaloproteinases 2 e 9 - MMP), angiogênese (fator de crescimento endotelial vascular VEGF) e apoptose (caspase 3 e método do Túnel). Trata-se de estudo retrospectivo baseado na análise histopatológica de dezoito casos de adenomas com displasia de alto (AG) e baixo grau (BG), respectivamente; dez casos de adenocarcinoma bem, moderado e pouco diferenciado, respectivamente, nove casos de lesões serrilhadas e nove biópsias colorretais (controle) selecionados aleatoriamente no Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, no período de 2000 a 2009. Foram construídos arranjos de matriz tecidual para representar os casos de adenocarcinomas e cinco casos de adenomas >1 cm de diâmetro. A detecção do NF-KB foi realizada pelo método de Southwestern imunoistoquímica. Avaliou-se a expressão imunoistoquímica da survivina, proibitina, TNFR1, p53, B-catenina, MMPs 2 e 9, VEGF, caspase 3 e Túnel. Não observamos expressão imunoistoquímica do NF-KB em 70% dos casos de adenocarcinomas, em 72% dos adenomas AG e em 89% das lesões serrilhadas; a marcação foi positiva em 66% e 56% dos casos de adenoma do BG e controle, respectivamente. Expressões da survivina, proibitina citoplasmática, TNFR1, p53, MMP 2 e 9 foram crescentes na seqüência adenoma-carcinoma, sem aparente modulação pelo NF-KB. A survivina suprimiu ação da caspase 3, exceto nos adenomas BG e controle, com baixos níveis de apoptose ao túnel. Lesões serrilhadas e controle apresentaram baixa expressão do TNFR1 e da proibitina citoplasmática, ausência de marcação da p53 e MMPs 2 e 9, exceto um caso controle. Identificou-se marcação nuclear da proibitina nos adenocarcinomas pouco diferenciados, adenomas AG e BG. A expressão da p53 relacionou-se ao grau de displasia nos adenomas e à desregulação da survivina. Observou-se expressão citoplasmática e nuclear da B- catenina nos adenocarcinomas, adenomas AG e BG. As lesões serrilhadas exibiram expressão citoplasmática em 44% dos casos. O grupo controle exibiu expressão preservada da B-catenina. Identificou-se expressão do VEGF nos adenocarcinomas, relacionada à perda de diferenciação celular, presença de metástases, não correlacionada ao NF-KB. Com base nos nossos resultados, sugerimos a desregulação da B- catenina como possível responsável pela inibição do NF-KB; além de sua participação na desregulação da survivina juntamente com a p53. As lesões serrilhadas não exibiram indícios sugestivos de inibição do NF- KB pela B-catenina.A survivina, devido propriedades anti-apoptóticas, emerge como potencial alvo terapêutico no tratamento do CCR, confirmando estudos anteriores. / Colorectal cancer (CRC) is an important cause of death in Brazil, representing the second leading cause of cancer mortality in the Southeast and South. It was among the first malignancies that have the carcinogenesis model identified.The aim of this study was to evaluate the expression of NF-KB and survivin in the progression of CRC, its relationship with molecular targets involved in cell survival [prohibitin, tumor necrosis factor (TNFR1), p53,B-catenina], invasion (metalloproteinases 2 and 9 - MMP), angiogenesis (vascular endothelial growth factor VEGF) and apoptosis (caspase 3 and method Tunnel). This is a retrospective study based on the histopathological analyses of eighteen cases of high- (HG) and low- grade dysplastic (LG) adenomas, respectively; ten cases of adenocarcinoma well, moderately and poorly differentiated, respectively, nine cases of serrated lesions e nine biopsies (control); randomly selected in the Pathology Service of the University Hospital of the Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo from 2000 to 2009. Tissue microarray were constructed to represent the cases of adenocarcinomas and five cases of adenomas > 1cm in diameter. Detection of NF-KB was performed by the Southwestern immunohistochemistry method. We evaluated immunohistochemical expression of survivin, prohibitin, TNFR1, p53, B- catenin, MMPs 2 and 9, VEGF, caspase 3 and method Tunnel. We did not observe immunohistochemical expression of NF-KB in 70% of cases of adenocarcinomas, in 72% of HG adenomas and 89% of lesions serrated; staining was positive in 66% and 56% of cases of LG adenoma and control, respectively. Expressions of survivin, cytoplasmic prohibitin, TNFR1, p53, MMPs 2 and 9 were increasing in adenoma-carcinoma sequence, without apparent modulation by NF-KB. Survivin suppressed action of caspase 3, except in BG adenomas and control, with low levels of apoptosis to the tunnel. Serrated lesions and control showed low expression of TNFR1 and cytoplasmic prohibitin, the absence of staining of p53 and MMPs2 and 9, except for one control. We identified nuclear staining of prohibitin in poorly differentiated adenocarcinomas, HG and LG adenomas. Expression of p53 was related to the grade of dysplasia in adenomas and deregulation of survivin.The expression of the cytoplasmic and nuclear B-catenin was observed in adenocarcinoma, HG and LG adenoma. Serrated lesions exhibited cytoplasmic expression in 44% of cases. Control group exhibited preserved expression of B-catenin. It was identified VEGF expression in adenocarcinomas, related to the loss of cellular differentiation, metastasis, not correlated with NF-KB. According to our results, we suggest that deregulation of catenin is possible responsible for the inhibition of NF-KB besides their participation in the deregulation of survivin with p53.Serrated lesions exhibited no evidence suggestive of inhibition of NF-KB by B-catenin. Survivin emerges as a potential therapeutic target in the treatment of CRC due to their anti-apoptotic properties, confirming previous studies.

O Glioblastoma é um dos tumores mais agressivos do sistema nervoso central e entre as diversas neoplasias possui um dos piores prognósticos. Mesmo com as novas estratégias de tratamento, a sobrevida de pacientes portadores de glioblastoma continua sendo muito baixa, sendo a temozolomida (TMZ) o agente mais comum usado no seu tratamento. O ácido tetra-o-metil nordihidroguaiarético (M4N), é um novo agente terapêutico que funciona como um repressor transcricional global de genes dependentes do fator de transcrição Sp1, tais como Survivina e Cdk1. No presente estudo, foram investigados os níveis de expressão do gene Survivina, suas variantes gênicas por splicing alternativo e Cdk1 em amostras tumorais e linhagens celulares de GBM. Adicionalmente, foram investigados os efeitos do M4N em combinação ou não com TMZ e/ou radiação em culturas primárias e linhagens celulares de GBM. Ensaios de qRT-PCR foram realizados para determiner a expressão de mRNA das variantes gênicas de Survivina e Cdk1. A proliferação celular foi analisada pelo ensaio XTT e os niveis de apoptose e variações do ciclo celular foram determinados por citometría de fluxo. Analises de combinação de drogas utilizando diferentes estratégias de administração (simultânea e seqüencial) foram realizados baseados no método de Chou-Talalay em linhagens celulares e culturas primárias de GBM. Para os ensaios de sobrevivência clonogênica, foram utilizadas as doses de 2, 4 e 6 Gy de radiação gamma. Todas as variantes por splicing alternativo de Survivina e o gene Cdk1 foram expressos em amostras (n=16) e linhagens celulares (n=6) de GBM, exceto a variante Survivina-2B que apenas foi expressa nas linhagens celulares de GBM. O tratamento com M4N diminuiu a expressão de Cdk1, Survivina e a variante Survivina-Ex3, enquanto que houve um aumento da expressão da variante Survivina-2B. O M4N diminuiu a proliferação celular de forma isolada e sinérgicamente quando combinada com TMZ. Além disso, o M4N aumentou os efeitos da radiação, principalmente quando associado com TMZ. O M4N causou morte celular apoptótica, diminuição do índice mitótico e parada do ciclo celular principalmente na fase x G2/M. Os resultados do presente estudo sugerem a potencial aplicação clínica de M4N em combinação com TMZ e radiação no tratamento do GBM. / Glioblastoma (GBM), one of the most human malignant neoplasia, responds poorly to current treatment modalities, being temozolomide (TMZ) the most used drug in its treatment. TetraO-methyl Nordihydroguaiaretic Acid (M4N) is a global transcriptional repressor of genes dependents of Sp1 transcription factor, such as Survivin and Cdk1. In this study was evaluated the gene expression of Survivin, their spliced-variants and Cdk1 in GBM samples and cell lines. Moreover, it was investigated the effects of M4N combined or not with TMZ and/or radiation on primary cultures and cell lines of GBM. qRT-PCR assays were performed to determine the Survivin-spliced variants and Cdk1 gene mRNA expression in GBM tumor samples and cell lines. Cell proliferation was measured by XTT assay and cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry. Drug combination analyzes using different schedules of administration (simultaneous and sequential) were performed based in ChouTalalay method on GBM cell lines and primary cultures. For clonogenic survival, it was used the doses of 2, 4, and 6 Gy of gamma radiation. All Survivin-spliced variants and Cdk1 gene were expressed in GBM samples (n=16) and cell lines (n=6), except the Survivin-2B variant that was only expressed in GBM cell lines. M4N treatment down regulated the expression of Cdk1, Survivin and Survivin-Ex3 variant, while the Survivin-2B variant was up-regulated. M4N decreased the cell proliferation separately and synergistically with TMZ, moreover it enhanced the radiation effects, mainly when associated with TMZ. M4N also induced apoptotic cell death, decreased mitotic index and arrested the cell cycle mainly in G2/M phase. Our results suggest a potential clinical application of M4N in combination with TMZ and radiation in GB treatment.

A queilite actínica é uma lesão causada pela exposição excessiva aos raios ultra-violeta (UV). Atingindo mais homens a partir da 5º década de vida e de pele clara, possuindo grande potencial de malignização, quando originará o carcinoma epidermóide de lábio, a malignidade mais comum em boca. Seu diagnóstico na maioria das vezes é tardio e quando isto ocorre sua taxa de sobrevida é de apenas 5 anos. O processo de progressão da carcinogênese está relacionado com a quebra no balanço entre os processos de proliferação/diferenciação celular e apoptose. A survivina é uma proteína com importantes funções na inibição da apoptose e progressão da mitose. Sua expressão desregulada, presente na maioria dos cânceres humanos, está relacionada a um prognóstico pobre e uma diminuição na sobrevida dos pacientes. Acredita-se que ela participe de eventos chaves na carcinogênese. Pode ser gene alvo da b-catenina, uma proteína de adesão com funções de transcrição relacionada com a via Wnt. A b-catenina presente nas junções aderentes da membrana celular junto com a caderina- E, quando livre no citoplasma é translocada para o núcleo onde faz a transcrição de gens reguladores do ciclo celular. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão imunoistoquímica da survivina e b-catenina nas lesões de queilite actínica e carcinoma epidermóide de lábio, e relacionar a expressão das duas proteínas e a participação na carcinogênese dessa lesão. Além disso, as lesões de queilite actínica foram classificadas quanto às alterações morfológicas por duas classificações: a proposta pela OMS, 2005 e por um sistema binário de graduação proposto por Kujan et al. em 2006. Foram realizadas reações de imunoistoquímica para verificação da expressão das duas proteínas. Os resultados mostraram, para b-catenina, expressão de membrana em todos os casos e marcação citoplasmática em 85% os casos de queilite actínica e marcação nuclear em 22%. A survivina foi positiva em 42% dos casos de queilite, com padrão de marcação irregular. Os carcinomas epidermóides foram positivos em 83% dos casos para b-catenina e nenhum deles teve marcação nuclear, e foram 100% positivos para survivina. Os resultados mostram alterações nas lesões de displasia, evidenciando o potencial maligno. Mais estudos são necessários para relacionar a expressão das duas proteínas e para esclarecer o papel da survivina na carcinogênese das lesões de lábio. / The actinic cheilitis is caused by excessive exposure to ultra violet (UV) radiation, most common in men after the 5º decade and fair skin, it has a great potencial of malignization, when it will become the squamous cell carcinoma of the lip, the malignancy most frequent in the mouth. The diagnosis is late in most cases which leads to a decrease of the survival to only 5 years. The progression of carcinogenesis is related to the balance between cell proliferation/ differenciation and apoptosis. Survivin is a protein with important functions on the inhibition of apoptosis and progression of mitosis. It?s desregulated expression, present in most human cancers, is related to a poor prognosis and a decrease of overall survival. Many authors believe that it participates and is key event on early carcinogenesis. Survivin might be a target gene of b-catenin, that is a adhesion protein with transcription functions related with the Wnt pathway. b-catenin is present in the adherens junctions of the cellular membrane in complex with the E-cadherin, and when free on the cytoplasm, it?s translocated to the nucleus, where it?s responsible for the transcription of cell-cycle regulators genes. The aim of the study was to evaluate the immunohystochemical expression of survivin and b-catenin in actinic cheilitis and squamous cell carcinoma lesions, and correlate the expression of the two proteins and the participation on the carcinogenesis of this lesion. Besides, the actinic cheilitis samples were classified as the epithelial changes by two methods: one proposed by the World Health Organization (WHO), in 2005 and the other, a binary system of graduation proposed by Kujan et al. in 2006. The results showed, for the b-catenin, membrane expression in all cases, and cytoplasmatic staining in 85% of the actinic cheilitis lesions, and 22% of nuclear staining. Survivin was positive in 42% of the actinic cheilitis, with an irregular pattern of staining. The squamous cell carcinomas were positives in 83% for b-catenin and none of them had nuclear staining, and were a 100% positive for survivin. The results showed alterations on the dysplasic lesions, proving their malignant potencial. More studies are needed to correlated the expression of the two proteins and to elucidate the role of survivin in the carcinogenesis of lip lesions.

A queilite actínica é uma lesão causada pela exposição excessiva aos raios ultra-violeta (UV). Atingindo mais homens a partir da 5º década de vida e de pele clara, possuindo grande potencial de malignização, quando originará o carcinoma epidermóide de lábio, a malignidade mais comum em boca. Seu diagnóstico na maioria das vezes é tardio e quando isto ocorre sua taxa de sobrevida é de apenas 5 anos. O processo de progressão da carcinogênese está relacionado com a quebra no balanço entre os processos de proliferação/diferenciação celular e apoptose. A survivina é uma proteína com importantes funções na inibição da apoptose e progressão da mitose. Sua expressão desregulada, presente na maioria dos cânceres humanos, está relacionada a um prognóstico pobre e uma diminuição na sobrevida dos pacientes. Acredita-se que ela participe de eventos chaves na carcinogênese. Pode ser gene alvo da b-catenina, uma proteína de adesão com funções de transcrição relacionada com a via Wnt. A b-catenina presente nas junções aderentes da membrana celular junto com a caderina- E, quando livre no citoplasma é translocada para o núcleo onde faz a transcrição de gens reguladores do ciclo celular. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão imunoistoquímica da survivina e b-catenina nas lesões de queilite actínica e carcinoma epidermóide de lábio, e relacionar a expressão das duas proteínas e a participação na carcinogênese dessa lesão. Além disso, as lesões de queilite actínica foram classificadas quanto às alterações morfológicas por duas classificações: a proposta pela OMS, 2005 e por um sistema binário de graduação proposto por Kujan et al. em 2006. Foram realizadas reações de imunoistoquímica para verificação da expressão das duas proteínas. Os resultados mostraram, para b-catenina, expressão de membrana em todos os casos e marcação citoplasmática em 85% os casos de queilite actínica e marcação nuclear em 22%. A survivina foi positiva em 42% dos casos de queilite, com padrão de marcação irregular. Os carcinomas epidermóides foram positivos em 83% dos casos para b-catenina e nenhum deles teve marcação nuclear, e foram 100% positivos para survivina. Os resultados mostram alterações nas lesões de displasia, evidenciando o potencial maligno. Mais estudos são necessários para relacionar a expressão das duas proteínas e para esclarecer o papel da survivina na carcinogênese das lesões de lábio. / The actinic cheilitis is caused by excessive exposure to ultra violet (UV) radiation, most common in men after the 5º decade and fair skin, it has a great potencial of malignization, when it will become the squamous cell carcinoma of the lip, the malignancy most frequent in the mouth. The diagnosis is late in most cases which leads to a decrease of the survival to only 5 years. The progression of carcinogenesis is related to the balance between cell proliferation/ differenciation and apoptosis. Survivin is a protein with important functions on the inhibition of apoptosis and progression of mitosis. It?s desregulated expression, present in most human cancers, is related to a poor prognosis and a decrease of overall survival. Many authors believe that it participates and is key event on early carcinogenesis. Survivin might be a target gene of b-catenin, that is a adhesion protein with transcription functions related with the Wnt pathway. b-catenin is present in the adherens junctions of the cellular membrane in complex with the E-cadherin, and when free on the cytoplasm, it?s translocated to the nucleus, where it?s responsible for the transcription of cell-cycle regulators genes. The aim of the study was to evaluate the immunohystochemical expression of survivin and b-catenin in actinic cheilitis and squamous cell carcinoma lesions, and correlate the expression of the two proteins and the participation on the carcinogenesis of this lesion. Besides, the actinic cheilitis samples were classified as the epithelial changes by two methods: one proposed by the World Health Organization (WHO), in 2005 and the other, a binary system of graduation proposed by Kujan et al. in 2006. The results showed, for the b-catenin, membrane expression in all cases, and cytoplasmatic staining in 85% of the actinic cheilitis lesions, and 22% of nuclear staining. Survivin was positive in 42% of the actinic cheilitis, with an irregular pattern of staining. The squamous cell carcinomas were positives in 83% for b-catenin and none of them had nuclear staining, and were a 100% positive for survivin. The results showed alterations on the dysplasic lesions, proving their malignant potencial. More studies are needed to correlated the expression of the two proteins and to elucidate the role of survivin in the carcinogenesis of lip lesions.

O desenvolvimento da imunoterapia do câncer baseada em células dendríticas (DCs) é alvo de vários estudos. Para tumores sólidos, a abordagem baseada no uso de DCs alogenêicas fundidas com células tumorais tem se mostrado relativamente eficaz. Por outro lado, esta estratégia necessita uma massa tumoral considerável de cada paciente para a geração das células híbridas. Para contornar este problema o uso de DCs transfectadas com mRNA tumoral, o qual pode ser amplificado in vitro a partir de uma pequena amostra inicial do tumor, tem sido investigado. Para isto, uma transfecção eficiente e tradução correta do mRNA tumoral nas DCs são etapas críticas. Sabendo-se que as DCs de pacientes com câncer possuem atividade aloestimuladora defeituosa, DCs derivadas de doadores saudáveis poderiam ser uma alternativa para induzir uma resposta imune mais eficiente. Assim, este trabalho pretendeu aprimorar a metodologia de transfecção de DCs alogenêicas, derivadas de monócitos de doadores saudáveis, com mRNA de antígenos tumorais (survivina e RPSA) super-expressos na leucemia linfóide crônica (LLC) e avaliar sua capacidade em estimular a resposta linfocitária. Ao mesmo tempo, foram estabelecidas as metodologias para amplificação e síntese do RNA destes antígenos tumorais específicos, assim como do RNA mensageiro total, contidos nas células tumorais de pacientes com LLC. Os resultados mostraram ser possível a amplificação do mRNA total extraído das células leucêmicas com manutenção da expressão dos antígenos tumorais. Ainda, várias condições de transfecção com mRNA da survivina, transcrito in vitro, foram testadas, encontrando-se na lipofecção, a melhor maneira de transfectar as DCs. A lipofecção mostrou-se com baixa toxicidade quando comparada à técnica de eletroporação. Observou-se uma eficiência em torno de 40% de células transfectadas num intervalo de tempo entre 12 e 48 horas. Estas células foram usadas como estimuladoras em ensaios de proliferação usando-se linfócitos T alogenêicos como células respondedoras. As células transfectadas com mRNA da survivina foram capazes de estimular resposta linfoproliferativa com maior produção de IFN-gama, avaliado por ELISA. Além disso, a transfecção não alterou o padrão de expressão dos marcadores de superfície característicos das DCs. Estes dados mostram que a transfecção das DCs com mRNA pode afetar a resposta imune induzida por estas APCs. Nossos resultados suportam o uso de DCs transfectadas com mRNA para produção de vacinas anti-tumorais e mostram a survivina como um potente antígeno indutor da resposta linfocitária. / The development of dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy has been the target of many studies. For solid tumors, a promising approach based in allogeneic DCs fused to tumor cells has been relatively effective. On the other hand, this approach needs large tumor samples to generate enough DC-tumor cell hybrids. To overcome this problem, tumor mRNA-transfected DCs can be used, since mRNA can be amplified in vitro and allow unlimited vaccine production. For this, efficient transfection and optimal translation of tumor mRNA in DCs are critical. Moreover, DC derived from cancer patients has defective alostimulatory activity. In this case, DC derived from healthy donors may be an alternative to induce immune response more efficiently. Here, we established the methodology of allogeneic DC transfection with mRNA for tumor antigens (survivin and RPSA) overexpressed in chronic lymphocytic leukemia (CLL), and evaluated their ability for T cell stimulation. At the same time, we established mRNA amplification and mRNA in vitro transcription methodology for specific tumor antigens and total messenger RNA, present in CLL tumor cells. Our results showed it to be possible to amplify total mRNA derived from leukemic cells maintaining tumor antigen expression. Moreover, several transfection conditions using survivin mRNA obtained from in vitro transcript reactions were evaluated, defining lipofection as the better way to transfect DC. We obtained nearly 40% of transfected DCs between 12 and 48 hours. Transfected DCs were used as stimulator cells in proliferation assays using allogeneic T cells as responder cells. Survivin mRNA transfected DCs were able to stimulate T cell proliferation with increased IFN-gama production, measured by ELISA. Furthermore, the transfection did not change the pattern of surface molecules expression characteristic of DC. These data show that mRNA DC transfection can affect immune responses induced by these APCs. These findings support the use of tumor mRNA transfected DCs for anti-cancer vaccine production and show survivin as a potent antigen to induce T cell responses.

O desenvolvimento da imunoterapia do câncer baseada em células dendríticas (DCs) é alvo de vários estudos. Para tumores sólidos, a abordagem baseada no uso de DCs alogenêicas fundidas com células tumorais tem se mostrado relativamente eficaz. Por outro lado, esta estratégia necessita uma massa tumoral considerável de cada paciente para a geração das células híbridas. Para contornar este problema o uso de DCs transfectadas com mRNA tumoral, o qual pode ser amplificado in vitro a partir de uma pequena amostra inicial do tumor, tem sido investigado. Para isto, uma transfecção eficiente e tradução correta do mRNA tumoral nas DCs são etapas críticas. Sabendo-se que as DCs de pacientes com câncer possuem atividade aloestimuladora defeituosa, DCs derivadas de doadores saudáveis poderiam ser uma alternativa para induzir uma resposta imune mais eficiente. Assim, este trabalho pretendeu aprimorar a metodologia de transfecção de DCs alogenêicas, derivadas de monócitos de doadores saudáveis, com mRNA de antígenos tumorais (survivina e RPSA) super-expressos na leucemia linfóide crônica (LLC) e avaliar sua capacidade em estimular a resposta linfocitária. Ao mesmo tempo, foram estabelecidas as metodologias para amplificação e síntese do RNA destes antígenos tumorais específicos, assim como do RNA mensageiro total, contidos nas células tumorais de pacientes com LLC. Os resultados mostraram ser possível a amplificação do mRNA total extraído das células leucêmicas com manutenção da expressão dos antígenos tumorais. Ainda, várias condições de transfecção com mRNA da survivina, transcrito in vitro, foram testadas, encontrando-se na lipofecção, a melhor maneira de transfectar as DCs. A lipofecção mostrou-se com baixa toxicidade quando comparada à técnica de eletroporação. Observou-se uma eficiência em torno de 40% de células transfectadas num intervalo de tempo entre 12 e 48 horas. Estas células foram usadas como estimuladoras em ensaios de proliferação usando-se linfócitos T alogenêicos como células respondedoras. As células transfectadas com mRNA da survivina foram capazes de estimular resposta linfoproliferativa com maior produção de IFN-gama, avaliado por ELISA. Além disso, a transfecção não alterou o padrão de expressão dos marcadores de superfície característicos das DCs. Estes dados mostram que a transfecção das DCs com mRNA pode afetar a resposta imune induzida por estas APCs. Nossos resultados suportam o uso de DCs transfectadas com mRNA para produção de vacinas anti-tumorais e mostram a survivina como um potente antígeno indutor da resposta linfocitária. / The development of dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy has been the target of many studies. For solid tumors, a promising approach based in allogeneic DCs fused to tumor cells has been relatively effective. On the other hand, this approach needs large tumor samples to generate enough DC-tumor cell hybrids. To overcome this problem, tumor mRNA-transfected DCs can be used, since mRNA can be amplified in vitro and allow unlimited vaccine production. For this, efficient transfection and optimal translation of tumor mRNA in DCs are critical. Moreover, DC derived from cancer patients has defective alostimulatory activity. In this case, DC derived from healthy donors may be an alternative to induce immune response more efficiently. Here, we established the methodology of allogeneic DC transfection with mRNA for tumor antigens (survivin and RPSA) overexpressed in chronic lymphocytic leukemia (CLL), and evaluated their ability for T cell stimulation. At the same time, we established mRNA amplification and mRNA in vitro transcription methodology for specific tumor antigens and total messenger RNA, present in CLL tumor cells. Our results showed it to be possible to amplify total mRNA derived from leukemic cells maintaining tumor antigen expression. Moreover, several transfection conditions using survivin mRNA obtained from in vitro transcript reactions were evaluated, defining lipofection as the better way to transfect DC. We obtained nearly 40% of transfected DCs between 12 and 48 hours. Transfected DCs were used as stimulator cells in proliferation assays using allogeneic T cells as responder cells. Survivin mRNA transfected DCs were able to stimulate T cell proliferation with increased IFN-gama production, measured by ELISA. Furthermore, the transfection did not change the pattern of surface molecules expression characteristic of DC. These data show that mRNA DC transfection can affect immune responses induced by these APCs. These findings support the use of tumor mRNA transfected DCs for anti-cancer vaccine production and show survivin as a potent antigen to induce T cell responses.