In nervous systems, synapses precisely orchestrate information transfer and memory formation. Active zones (AZ) are specialized subcellular compartments at the presynaptic mesoscale which process synaptic transmission on an ultrastructural level. The AZ cytomatrix including the essential scaffold protein Rab3 interacting molecule (RIM) enables exocytosis of synaptic vesicles. A deficiency of the locally most abundant protein isoform RIM1α diminishes long-term potentiation in a complex central mammalian synapse – the connection of hippocampal mossy fiber boutons (MFB) to cornu ammonis (CA)3 pyramidal neurons. Behaviourally, these mice present with learning impairment. The present MD thesis addresses the so far unknown three-dimensional (3D) AZ ultrastructure of MFBs in acute hippocampal slices of wild-type and RIM1α-/- mice. In a first set of experiments, a standardized protocol for near-to-native synaptic tissue preparation at MFBs using high-pressure freezing and freeze substitution and 3D modelling using electron tomography was developed and established. Based on the excellent preservation of synaptic tissue using this protocol, the AZ ultrastructure in both genotypes was quantified in detail up to an individual docked synaptic vesicle using custom-written programming scripts. The experiments demonstrate that deficiency of RIM1α leads to multidimensional alter-ation of AZ 3D ultrastructure and synaptic vesicle pools in MFBs. (Tightly) docked synaptic vesicles – ultrastructural correlates of the readily releasable pool – are reduced, decentralized, and structurally modified, whereas the more distant vesicle pool clusters more densely above larger and more heterogenous AZ surfaces with higher synaptic clefts. The present thesis contributes to a more comprehensive understanding regarding the role of RIM1α for (tight) vesicle docking and organization at MFBs. Furthermore, the precise 3D ultrastructural analysis of MFB AZs in this thesis provides the necessary mor-phological basis for further studies to correlate synaptic ultrastructure with presynaptic plasticity and memory dysfunction in RIM1α-/- mice using advanced electrophysiological and behavioral techniques. / In Nervensystemen bedürfen Informationsweitergabe und Gedächtnisformation eines präzisen Zusammenspiels von Synapsen in Zeit und Raum. Synaptische Transmission basiert strukturell auf mesoskopischen cytosolischen Kompartimenten an der präsynaptischen Membran, sogenannten Aktiven Zonen (AZ). Ihre Cytomatrix, bestehend aus zentralen Gerüstproteinen wie Rab3 interacting molecule (RIM), ermöglicht eine schnelle Freisetzung synaptischer Vesikel. Die Defizienz der lokal häufigsten Isoform RIM1α resultiert an einer komplexen zentralen Säugersynapse, die des hippocampalen Moosfaserboutons (MFB) zu im Cornu ammonis (CA)3 befindlichen Pyramidalzellen, in einer dezimierten Langzeitplastizität. Auf Verhaltensebene zeigen diese Mäuse eine reduzierte Lernfähigkeit. Die vorliegende Dissertation widmet sich grundlegend der bisher unbekannten dreidimensionalen (3D) AZ-Ultrastruktur des MFB in akuten Hippocampusschnitten der adulten Wildtyp- und RIM1α-Knock-Out-Maus (RIM1α\(^{-/-}\)). In einer methodischen Entwicklungsphase wurde ein neuartiges, anspruchsvolles Protokoll der nahezu artefaktfreien (near to native) Synapsenpräparation am MFB mittels Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution sowie der 3D-Modellierung mittels Elektronentomographie etabliert. In einer zweiten Experimentier- und Analysephase ermöglichte die hochwertige synaptische Gewebeerhaltung in beiden Genotypen eine standardisierte, auf Programmierskripten basierte Quantifizierung der AZ-Ultrastruktur bis auf die Ebene eines individuell gedockten synaptischen Vesikels. Dieser Dissertation gelingt der Nachweis, dass eine Defizienz von RIM1α zu einer multidimensionalen ultrastrukturellen Veränderung der AZ und ihres Vesikelpools am MFB führt. Neben einer Reduktion, Dezentralisierung und strukturellen Veränderung (eng) gedockter Vesikel – der ultrastrukturellen Messgrößen von unmittelbar freisetzungsfähigen Vesikeln – verdichtet sich der distaler lokalisierte Vesikelpool auf zugleich größeren, heterogenen AZ-Flächen mit erweitertem synaptischem Spalt. Vorliegende Untersuchungen tragen zum Verständnisgewinn über eine zentrale Rolle von RIM1α für das Docking und die Organisation von Vesikeln der AZ im MFB bei. Darüber hinaus stellen die präzisen ultrastrukturellen Analysen eine morphologische Grundlage für weiterführende Studien mit Hilfe modernster Techniken dar, beispielsweise über die Auswirkungen der geänderten RIM1α\(^{-/-}\) AZ-Ultrastruktur auf die präsynaptische Plastizität sowie in Korrelation zum Gedächtnis und Lernen der Tiere.

Wir haben im Hippocampus von transgenen Mäusen, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines Promotors für Nestin exprimieren, mutmaßliche Neuronale Vorläuferzellen identifiziert. Wir haben bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass Nestin-GFP exprimierende Vorläuferzellen in der subgranularen Zone des adulten Gyrus Dentatus sich in zwei Subpopulationen entsprechend ihrer morphologischen Eigenschaften einteilen lassen. Eine kleine, morphologisch unterscheidbare Population von Vorläuferzellen mit neuronalen Eigenschaften erhielt GABAergen, aber keinen glutamatergen Input, dies widerspiegelt die Situation während der Entwicklung des Gehirns. Außerdem haben wir ecto-nucleotidase NTPDase2 und functionelle P2X Rezeptoren in hippocampalen Vorläuferzellen identifiziert. Wir haben auch das Verhalten Nestin exprimierender Zellen bis zu 8 Wochen nach 30 minütiger Occlusion der mittleren cerebralen Arterie (MCAo)/reperfusion und im murinen experimentellen Glioblastom Modell untersucht. Neben den bereits publizierten Ergebnissen, die ich auch in meiner Doktorarbeit vorgestellt habe, habe ich die elektrophysiologischen Eigenschaften der Nestin-GFP-exprimierenden Zellen in der Amygdala und im CA 1 des Hippocampus untersucht. / Using transgenic mice that express green fluorescent protein (GFP) under control of the nestin promoter, the putative precursor cells were identified. We have previously shown that nestin-GFP expressing precursor cells in the adult subgranular zone of hippocampal dentate gyrus could be divided into two distinct subpopulations based on morphological criteria. A small, morphological distinct population of precursor cells with neuronal properties received GABAergic, but not glutamatergic input similar as in brain development. We identified ecto-nucleotidase NTPDase2 and functional P2X receptors at hippocampal progenitor cells. We also studied the fate of nestin-GFP-expressing cells up to 8 weeks after 30 mins occlusion of the middle cerebral artery (MCAo)/reperfusion and in murine experimental glioblastoma model. Except for the published results which was included in this PhD dissertation, I also studied the electrophysiology properties of nestin-GFP-expression cells in amygdala and in Ca1 of hippocampus.

In lokalen neokortikalen Netzwerken stellen GABAerge Interneurone die Quelle der Inhibition dar, wobei sie inhibitorische Verbindungen mit benachbarten exzitatorischen und anderen inhibitorischen Neuronen bilden. Man geht davon aus, dass synaptische Transmission in vivo als Folge spontaner Aktionspotentiale während aktiven depolarisierten Erregungszuständen des Netzwerks auftritt. Ziel dieser Studie war es monosynaptische inhibitorische Verbindungen in vivo zu detektieren um den Zusammenhang zwischen der Konnektivität kortikaler Interneurone und deren Spontanaktivität untersuchen zu können. Dafür wurden von zwei bis drei benachbarten GABAergen Interneuronen gleichzeitig gezielte elektrophysiologische Ganz-Zell-Ableitungen unter visueller Kontrolle des Zwei-Photonen-Mikroskops gemacht. Die Ableitungen wurden an Zellen in Schicht 2/3 des primären somatosensorischen Kortex der Vorderpfote von Mäusen durchgeführt, welche mit Urethan narkotisiert waren. Hierbei wurden zwei Mauslinien eingesetzt, um elektrophysiologische Ableitungen von genetisch identifizierten Interneuronen zu erhalten. GAD67-GFP Mäuse wurden genutzt, um Interneurone allgemein und unabhängig von ihrem Subtyp untersuchen zu können. Die Züchtung der dreifach transgenen Linie GIN-VIPcre-Ai9 erlaubte gezielte Ableitungen von SST und VIP Zellen. In beiden Linien konnten monosynaptische inhibitorische Verbindungen zwischen Interneuronen detektiert werden, wobei die Konnektivitätsrate zwischen ''nicht-schnell'' feuernden Interneuronen in GAD67-GFP Mäusen höher war als für SST und VIP Zellen. Die inhibitorische synaptische Transmission wurde jeweils stark vom aktuellen Erregungszustand des Kortex moduliert wobei ein Anstieg der IPSP-Amplitude während depolarisierter Zustände des Netzwerks festgestellt wurde. Es konnten subtyp-spezifische Korrelationen in der Aktivität neokortikaler Interneurone beobachtet werden, welche sich im unterschwelligen Membranpotential und auch der spontanen Feuerrate der Zellen zeigte. / GABAergic interneurons provide the source of inhibition in local neocortical networks, where they form inhibitory connections with nearby excitatory and other inhibitory neurons. In cortical circuits in vivo synaptic transmission is thought to emerge during depolarized active network states, when spontaneous spiking can occur. The aim of this study was to identify monosynaptic inhibitory connections in vivo in order to relate interneuron connectivity to their spontaneous activity. Therefore simultaneous two-photon targeted whole-cell recordings were made from two to three neighboring layer 2/3 GABAergic interneurons in the forepaw primary somatosensory cortex of urethane anesthetized mice. Two different mouse strains were used to record from genetically identified interneurons: in GAD67-GFP animals interneurons could be examined regardless to their subtype. Breeding of the triple transgenic mouse line GIN-VIPcre-Ai9 allowed to specifically target SST and VIP cells. Monosynaptic inhibitory connections could be identified in both mouse lines, with higher connectivity rates of non-fast spiking interneurons recorded in GAD67-GFP animals than for SST and VIP cells. Overall, the ongoing state of the cortex powerfully modulated inhibitory synaptic transmission, with IPSPs increasing in amplitude in depolarized network states. Subtype-specific correlations in the activity of neocortical interneurons could be observed and were reflected in the subthreshold and also spontaneous firing activity of cells.

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