Kentucky reported a solid 13.1% growth in certified organic land from 1997 to 2002. The relative lack of research on disease management practices in Kentucky consistent with organic regulations is an issue that needs to be addressed to provide more reliable information to local farmers. Thus, the first objective of this research was to investigate the potential disease control obtained with natural, organically certifiable spray materials against Colletotrichum orbiculare in vitro and in vivo. The second objective was to test certifiable spray materials in combinations to identify synergistic interactions. The third objective was to evaluate Organic Material Review Institute (OMRI)-certified materials for managing Septoria leaf spot and early blight in tomato under field conditions. The fourth objective was to evaluate chitosan-based products against C. orbiculare in vitro and in vivo. Essential oils, Trilogy®, and Actinovate®, failed to suppress C. orbiculare in vitro as well as cucurbit anthracnose. Bicarbonate salts, Regalia®SC, Sonata®, copper based-products, lime sulfur and water-soluble chitosan showed high antifungal activity in vitro. Bicarbonate salts, Sonata®, Serenade Max®, Soil Gard 12G®, copper based-products and lime sulfur reduced anthracnose disease severity in vivo. In the synergism experiments only a limited number of mixtures showed synergistic interactions, but even in those cases, the effect was not consistent between experiments. The main response obtained was antagonism. In field experiments the most effective fungicides for managing Septoria leaf spot and early blight of tomato were copper-based fungicides. None of the biological-based products (Sonata® and Serenade Max®)), plant-based extracts (Trilogy® and Regalia® SC), chitosan, ammonium bicarbonate nor horticultural lime sulfur provided a significant reduction in disease severity. For the fourth objective, water-soluble chitosan with a molecular weight between 3 to 10 kDa (80 and 85% deacetylated) showed the highest antifungal activity among all chitosan-based products evaluated in vitro. Also, combining the in vitro and in vivo results suggest that the antifungal activity of chitosan-based products is molecular weight- and concentration-dependent. These results provide a significant advance in the evaluation of the efficacy of OMRI-certified materials and natural materials to help organic farmers in Kentucky and the USA to manage diseases.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2002. / Härtill 5 uppsatser.

A.baumannii é um importante patógeno em infecções nosocomiais principalmente por sua capacidade de se tornar resistente aos antimicrobianos. Surtos de A.baumannii resistente aos carbapenêmicos (ABRC) têm sido descritos em todo mundo. Devido à emergência de resistência aos antimicrobianos e ausência de novas opções de tratamento, as polimixinas reemergiram como opção de terapia contra infecções causadas por A.baumannii. O uso de polimixina é associado a maior mortalidade e menor eficácia comparada a outros antimicrobianos. Alguns estudos in vitro têm avaliado a combinação de polimixina com outros antimicrobianos a fim de aumentar a eficácia dos tratamentos. O objetivo deste estudo foi avaliar o sinergismo entre a polimixina B com outros antimicrobianos em isolados de ABRC, pelo método de Curvas Tempo-Morte bacteriana (Time- Kill Curves). Os isolados foram provenientes de banco de amostras e foram avaliadas as combinações de polimixina B com carbapenêmicos (imipenem e meropenem), tigeciclina, rifampicina, amicacina e ceftazidima. As combinações foram testadas nos tempo 0, 30’, 1,4,12 e 24 h. Sinergismo entre polimixina B foi demonstrado contra todos antimicrobianos para ambos isolados, exceto para ceftazidima e imipenem no isolado 1. Nosso estudo mostrou que tigeciclina, amicacina e rifampicina são agentes mais ativos combinados com polimixina B, sendo assim estes agentes podem apresentar efeito benéfico em combinação com a polimixina no tratamento de ABRC. / A.baumannii is an important pathogen in nosocomial infections primarily for its ability to become resistant to antimicrobials. Outbreaks carbapenem- resistant A.baumannii (CRAB) has been described worldwide. Due to the emergence of antimicrobial resistance and the absence of new treatment options, the polymyxins reemerged as an option therapy against infections caused by A.baumannii. The use of polymyxin is associated with higher mortality and lower effectiveness compared to other antimicrobials. In vitro studies have evaluated the combination of polymyxin with other antimicrobial agents to enhance the effectiveness of the treatments. This study was to evaluate the synergy between polymyxin B with other antimicrobials in isolates from ABRC, by Time-Kill Curves. The isolates were from stool samples and were evaluated combinations of polymyxin B with carbapenems (imipenem and meropenem), tigecycline, rifampin, amikacin and ceftazidime. The combinations were tested at time 0, 30 ', 1,4,12 and 24 h. Synergism between polymyxin B was demonstrated against all antimicrobials for both isolates, except for ceftazidime and imipenem in isolated 2. Our study showed that tigecycline, amikacin and rifampicin more active agents are combined with polymyxin B, and thus these agents may have a beneficial effect in combination with a polymyxin in treating CRAB.

Diante do aumento global da resistência microbiana, cada vez mais as combinações de antimicrobianos são utilizadas na tentativa de obter uma atividade sinérgica eficaz que possa ser utilizada na prática clínica. O objetivo deste trabalho foi comparar a atividade de polimixina B isoladamente e em combinação com tigeciclina e carbapenêmicos (ertapenem e meropenem), frente a isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos. Foram selecionados quatro isolados de Enterobacter sp. resistentes aos carbapenêmicos, sendo três isolados produtores de carbapenemases (KPC, NDM, OXA-48-like) e um não produtor de carbapenemases (NPC). A avaliação da atividade sinérgica antimicrobiana foi realizada por ensaio de time-kill com as seguintes concentrações de cada antimicrobiano: tigeciclina 1mg/L, meropenem 1mg/L e ertapenem 0,5mg/L, que correspondem aos pontos de corte de sensibilidade do CLSI (2016). Para polimixina B, foram utilizadas diferentes concentrações de acordo com o perfil de susceptibilidade do isolado: para os isolados sensíveis, utilizou-se 0,5x; 1x e 2x a CIM do isolado; para o isolado resistente, foram utilizados 0,5x; 1x e 2x o ponto de corte de sensibilidade do CLSI (2 mg/L). Foi considerada sinérgica a combinação com redução ≥ 2 logs do inoculo inicial em comparação ao antimicrobiano sozinho mais ativo. As combinações de polimixina B em diferentes concentrações (0,5; 1 e 2mg/L) com meropenem apresentaram atividade sinérgica para a cepa produtora de NDM (CIM polimixina B 1 mg/L; CIM meropenem 8 mg/L) As combinações de polimixina B com tigeciclina foram sinérgicas apenas na concentração de polimixina B de 0,125 mg/L para cepa produtora de OXA-48-like (CIM polimixina B 0,25 mg/L; CIM tigeciclina 2 mg/L) e na concentração de 1 mg/L para a cepa produtora de NDM. Para a cepa NPC (CIM polimixina B 0,5 mg/L; CIM tigeciclina 4 mg/L; CIM meropenem 4 mg/L), apenas a tripla combinação com polimixina B (1 mg/L), tigeciclina e meropenem apresentou atividade sinérgica. A combinação de dois carbapenêmicos não apresentou atividade sinérgica para nenhum isolado, porém, quando acrescentado tigeciclina ao esquema, observou-se sinergismo no isolado produtor de OXA-48-like, o que leva ao questionamento da efetividade da terapia “carbapenem suicida”. Para o isolado produtor de KPC e com padrão de resistência a polimixina B, nenhuma das combinações testadas apresentou sinergismo. Esta situação é bastante preocupante devido à alta prevalência de infecções por bactérias produtoras de KPC nos hospitais brasileiros, juntamente com as crescentes taxas de resistência as polimixinas. / Due to the increase in microbial resistance, combinations of antimicrobials are increasingly being used to improve the therapeutic response. The objective of this study was to compare the activity of polymyxin B alone and in combination with tigecycline and carbapenem (ertapenem and meropenem) against to carbapenem-resistant Enterobacter sp isolates. Four isolates were selected, three were carbapenemase-producing (KPC, NDM, OXA-48-like) and a non-carbapenemase-producing (NCP). The evaluation of synergistic antimicrobial activity was performed by time-kill assay with the following concentrations of each antimicrobial: tigecycline 1mg/L, meropenem 1mg/L and ertapenem 0.5mg/L, which correspond to the breakpoints of CLSI (2016). For polymyxin B, different concentrations were used according to the susceptibility profile of the isolate: for susceptible isolates, it was used 0.5x; 1x and 2x the MIC of the isolate, for the resistant isolates it was used 0.5x; 1x and 2x the breakpoint of CLSI (2 mg/L). The combination with reduction ≥ 2 logs of the initial inoculum compared to the most active antimicrobial alone was considered synergies. Combinations of polymyxin B at different concentrations (0.5; 1 and 2 mg/L) with meropenem showed synergistic activity for the NDM-producing isolate (MIC polymyxin B 1 mg/L, MIC meropenem 8 mg/L) Combinations of polymyxin B with tigecycline were synergistic only at the concentration of polymyxin B of 0.125 mg/L for the OXA-48-like-producing isolate (MIC polymyxin B 0.25 mg/L, MIC tigecycline 2 mg/L) and at the concentration of 1 mg/L for the NDM-producing isolate. For the NCP isolate (MIC polymyxin B 0.5 mg/L; MIC tigecycline 4 mg/L; MIC meropenem 4 mg/L), only the triple combination of polymyxin B (1 mg/L) plus tigecycline and meropenem presented synergistic activity. The combination of two carbapenems was not synergic for the four isolates; however, when tigecycline was added to the regimen, synergies for the OXA-48-like-producing isolate were observed. Therefore, the so called, "carbapenem suicide" therapy was not effective in vitro against our isolates. For the KPC-producing isolate that it is polymyxin B resistant, none of the combinations tested showed synergies. This situation is very worrisome due to high prevalence of infections by KPC-producing in the Brazilian hospitals, associate with the increasing rates of polymyxins resistance.

Enterobactérias como Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. estão entre as principais causas de infecções hospitalares e estão frequentemente associadas à produção da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC). A emergência de isolados produtores desta e de outras carbapenemases é um grave problema de saúde pública uma vez que as opções terapêuticas tornam-se extremamente limitadas. As polimixinas frequentemente constituem uma das poucas opções disponíveis, porém têm sido associadas a menor eficácia clínica, maior mortalidade e toxicidade. Além disso, há descrição in vitro da emergência de subpopulações heterorresistentes de isolados expostos a esta droga. Neste contexto, muitos estudos têm avaliado a terapia combinada como alternativa e a utilização das polimixinas com outras classes de antimicrobianos tem mostrado resultados mais eficazes em comparação às monoterapias no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes, como aquelas produtoras KPC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho de combinações entre polimixina B (PMB) com a tigeciclina (TGC) e com os carbapenêmicos imipenem (IPM) e meropenem (MEM) contra enterobactérias produtoras de KPC-2 pelo método de Time Kill Curves - TKC (Curva de Tempo-Morte). Os isolados foram previamente caracterizados como produtores de KPC-2 e incluíram seis clones de três espécies distintas, sendo dois isolados de K. pneumoniae (KP), dois de Enterobacter cloacae (EC) e dois de Serratia marcescens (SM), provenientes de banco de amostras. A PMB foi testada em concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0 μg/mL, enquanto os carbapenêmicos e TGC foram testados a uma concentração fixa de 4,0 e 1,0 μg/mL, respectivamente. Os tubos contendo o inóculo e antibióticos foram incubados a 35 °C e uma alíquota foi semeada em placa de ágar sangue nos tempos: 0, 0,25, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, para a contagem das colônias. Os resultados foram interpretados conforme as seguintes definições: i) atividade bactericida = redução ≥ 3 log10 na contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC)/mL comparado ao inóculo inicial; ii) atividade bacteriostática = manutenção ou redução < 3 log10 na contagem total de UFC/mL comparado ao inóculo original; iii) sinergismo = diminuição ≥ 2 log10 na contagem total de UFC/mL entre a combinação de antimicrobianos e o agente mais ativo, após 24 horas de incubação. De acordo com nossos resultados, IPM, MEM e TGC não apresentaram efeito bacteriostático ou bactericida quando testados como única droga contra todos os isolados produtores de KPC-2. Todas as combinações de antibióticos mostraram sinergismo com atividade bactericida ou, pelo menos, um efeito bacteriostático para todos os isolados testados, sendo as combinações mais efetivas aquelas onde a de PMB foi usada nas concentrações de 1,0 e 2,0 μg/mL e combinada aos carbapenêmicos. Embora tenham sido observadas concentrações inibitórias mínimas elevadas para PMB contra os isolados de SM, para ambas as cepas houve sinergismo quando a PMB foi combinada a IPM e MEM. Nossos resultados confirmam a superioridade das combinações de antimicrobianos em comparação às monoterapias e sugerem que, a PMB combinada com carbapenêmicos ou TCG pode ser uma opção terapêutica eficaz para o tratamento de infecções causadas por isolados de enterobactérias produtores de KPC-2. / Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. are among the leading causes of nosocomial infections and are often associated with Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) production. The emergence of KPC and other carbapenemases is a serious public health problem due to the limited therapeutic. Polymyxins often constitute one of the few options available, but it have been associated with lower clinical efficacy, toxicity and increased mortality. Moreover, several studies have demonstrated the emergence of heteroresistant subpopulations when isolates are exposed to this drug. In this context, some authors have evaluated the combined therapy as an alternative and the use of polymyxins with other classes of antibiotics have shown to be more effective compared to the monotherapies for the treatment of infections caused by multiresistant bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the performance of polymyxin B (PMB) with carbapenems imipenem (IPM) and meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) combinations against KPC-2 producing Enterobacteriaceae by Time Kill Curves method. Isolates were previously characterized as KPC-2 producing comprising six distinct clones that included: two K. pneumoniae (KP), two Enterobacter cloacae (EC) and two Serratia marcescens (SM). PMB was tested at concentrations 0,5, 1,0 and 2,0 μg/mL, whereas carbapenems and TGC were tested at a fixed concentration of 4.0 and 1.0 μg/mL, respectively. Tubes with inoculum and antibiotics were incubated at 35 °C and an aliquot was plated on blood agar plates at times: 0, 0.25, 1, 2, 4, 8, 12 and 24 hours for counting colonies. The results were interpreted according to the following definitions: i) bactericidal activity = ≥ 3 log10 reduction in total count of colony forming units (CFU)/mL compared to the initial inoculum; ii) bacteriostatic activity = maintenance or reduction < 3 log10 in total count of CFU/mL compared to the original inoculum; iii) synergism = ≥ 2 log10 decrease in total count of CFU/ml between the combination and the most active antimicrobial agent after 24 hours of incubation. According to our results, IPM, MEM and TGC showed no bacteriostatic or bactericidal effects when tested as a single drug against all KPC-2-producing isolates. All combinations of antibiotics showed synergism with bactericidal activity or at least, a bacteriostatic effect for all the six isolates. The more effective combinations were those that PMB was used at 1,0 and 2,0 μg/mL, combined with carbapenems. Although high minimum inhibitory concentrations were observed for PMB against isolates of SM, for both strains, synergism was observed when PMB was combined with IPM and MEM. Our results confirm the superiority of antimicrobial combinations compared to monotherapies and suggest that PMB combined with carbapenem or TCG can be an effective therapeutic option for the treatment of infections caused by KPC-2-producing Enterobacteriaceae.

Submitted by BRUNA BARBOZA MARCHESI null (brumarchesi@hotmail.com) on 2016-03-16T17:25:35Z No. of bitstreams: 1 Versão FINAL_Bruna Marchesi.pdf: 2441821 bytes, checksum: 291ac40bb91fa79ae6cb35e82b758c16 (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-03-16T17:57:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marchesi_bb_me_bot.pdf: 2441821 bytes, checksum: 291ac40bb91fa79ae6cb35e82b758c16 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-16T17:57:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marchesi_bb_me_bot.pdf: 2441821 bytes, checksum: 291ac40bb91fa79ae6cb35e82b758c16 (MD5) Previous issue date: 2016-01-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Com o objetivo de avaliar os efeitos de formulações e de intervalos sem chuva três experimentos foram conduzidos afim de se obter informações sobre a deposição, absorção, translocação e eficácia dos herbicidas 2,4-D e glyphosate, isolados e em mistura, em plantas de Conyza canadensis. Todos os estudos foram realizados em casa-de-vegetação em delineamento inteiramente casualizado e em esquema fatorial, com 6 herbicidas (780 g e.a. ha-1 do herbicida EnlistTM; 780 + 820 g e.a. ha-1 da mistura formulada EnlistDuoTM; 780 g e.a. ha-1 de DMA 806 BR; 820 g e.a. ha-1 de Glizmax®Prime; 780 + 820 g e.a. ha-1 da mistura dos herbicidas DMA 806 BR + Glizmax®Prime e 780 + 820 g e.a. ha-1 da mistura de EnlistTM + Glizmax®Prime). Para o estudo de absorção o fatorial foi 6X4, com os 6 herbicidas e 4 intervalos de lavagem, com 5 repetições; para os de deposição e translocação o fatorial foi 6X2, sendo os 6 herbicidas e 2 regiões (ápice e base), com 6 repetições; e para o de eficácia, 6X5, os 6 herbicidas e 5 intervalos de chuva, com 4 repetições. No estudo de absorção foram quantificados os teores dos herbicidas internos e externos às plantas. Nos de deposição e translocação a quantificação dos herbicidas internos às plantas foi realizada para ambos, sendo que no de translocação a quantificação foi realizada aos 2 e 4 dias após a aplicação (DAA). No de eficácia foi realizada a avaliação visual de fitointoxicação aos 7, 14, 21 e 28 DAA e a massa seca aos 28 DAA. A mistura de 2,4-D e glyphosate, sendo ela formulada ou em tanque, aumentou a absorção e a eficácia do 2,4-D no controle de Conyza canadensis. A absorção de 2,4-D foi contínua ao longo das primeiras 24 horas com aumento dos teores internos e da porcentagem de controle com o avanço dos intervalos sem chuva ou lavagem. As folhas da base de Conyza canadensis receberam as maiores deposições de 2,4-D e glyphosate, sendo as principais responsáveis pela absorção dos herbicidas. A translocação do 2,4-D e do glyphosate é muito mais intensa no sentido base-ápice do que no sentido inverso. As maiores deposições nas folhas da base associada à maior translocação da base para o ápice contribuem para ação sistêmica desses herbicidas. / With the objective to evaluate the effects of formulations and rainless intervals three experimentes were done in order to obtain information about deposition, absorption, translocation and efficacy of the herbicides 2,4-D and glyphosate, alone or in mixture, in Conyza canadensis plants. All studies were performed in green house in a completely randomized design and in a factorial with 6 herbicides (780 g a.i. ha-1 of the herbicide EnlistTM; 780 + 820 g a.i. ha-1 of the formulated mixture EnlistDuoTM; 780 g a.i. ha-1 of DMA 806 BR; 820 g a.i. ha-1 of Glizmax®Prime; 780 + 820 g a.i. ha-1 of the herbicides mixtures DMA 806 BR + Glizmax®Prime and 780 + 820 g a.i. ha-1 of the mixture EnlistTM + Glizmax®Prime). To the absorption study the fatorial was 6X4, with 6 herbicides and 4 washing intervals, with 5 repititions; to the deposition and translocation study, the factorial was 6x2, with 6 herbicides and 2 regions (apex and base), with 6 repetitions; and to the efficacy study, 6X5, with the 6 herbicides and 5 rain intervals, with 4 repetitions. In the absorption study were quantified the levels of internal and external herbicides to plants. In the deposition and translocation, quantifying the internal herbicides to plants was conducted for both and to translocation the quantification performed at 2 and 4 days after application (DAA). For the efficacy study it was conducted a visual evaluation of injury at 7, 14, 21 and 28 DAA and dry mass at 28 DAA. The mixture of 2,4-D and glyphosate, formulated or in a tank mix, increased the absorption and the efficacy of 2,4-D in control of Conyza canadensis. The 2,4-D absorption was uniform throughout the first 24 hours with increasing internal levels and the percentage of control with the advance of intervals without rain or washing. The base leaves of Conyza canadensis received the biggest deposition of 2,4-D and glyphosate, mainly responsible for the absorption of herbicides. The translocation of 2,4-D and glyphosate is much more intense towards base-apex than in the reverse. The biggest depositons in the base leaves associated with higher translocation from base to apex contribute to systemic action of these herbicides.

Submitted by MARIA LAURA VIOLA AUGUSTO (marialauraa@gmail.com) on 2018-06-15T17:16:40Z No. of bitstreams: 1 augusto_mlv_dr_jabo.pdf: 1777889 bytes, checksum: 32d8b34f05ca40dec4ae93cca2a67527 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-15T18:34:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 augusto_mlv_dr_jabo.pdf: 1777889 bytes, checksum: 32d8b34f05ca40dec4ae93cca2a67527 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-15T18:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 augusto_mlv_dr_jabo.pdf: 1777889 bytes, checksum: 32d8b34f05ca40dec4ae93cca2a67527 (MD5) Previous issue date: 2018-05-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O controle da broca da cana, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae), pode ser feito pela aplicação de inseticidas químicos, mas o uso dessa tática de manejo pode resultar em danos ambientais e ao homem. De forma alternativa e com efeitos negativos reduzidos, o manejo de D. saccharalis e outros insetos-praga pode ser feito pela utilização do entomopatógeno Bacillus thuringiensis. Além do uso de formulações de B. thuringiensis para o controle de pragas, um ou mais genes que codificam proteínas inseticidas Cry e Vip de B. thuringiensis estão presentes nas plantas transgênicas com resistência a insetos comercialmente disponíveis no Brasil. Apesar de alta adoção, efeitos colaterais reduzidos e eficiência das plantas Bt, o uso desta tecnologia pode resultar na seleção de populações de insetos resistentes às plantas transgênicas. Por isso, a busca por novas proteínas e combinações de proteínas com diferentes modos de ação para retardar a evolução da resistência deve ser constante. Nesse cenário, uma quitinase de B. thuringiensis apresenta potencial para ser incorporada em uma nova geração de plantas transgênicas. Quitinases são enzimas que apresentam domínios catalíticos para hidrólise de quitina e domínios ligantes em quitina (CBD) que podem estar envolvidos com a atividade inseticida. A atividade inseticida das quitinases é relacionada com a desestruturação da membrana peritrófica dos insetos e consequente perda de suas propriedades e funções. Além da descoberta de proteínas inseticidas com diferentes modos de ação, é de interesse que essas apresentem interações positivas com outras proteínas inseticidas. No presente trabalho, duas formas de uma quitinase de B. thuringiensis - ChiΔSP (sem o peptídio sinal) e ChiΔSP.CBD (sem o peptídio sinal e sem o domínio ligante em quitina) - foram produzidas de forma heteróloga em Escherichia coli para avaliações bioquímicas e biológicas sobre D. saccharalis. Ensaios bioquímicos das enzimas ChiΔSP e ChiΔSP.CBD indicam que a atividade quitinolítica sobre quitina coloidal de ChiΔSP (3,07±0,15 U/nmol) foi maior que de ChiΔSP.CBD (1,83±0,06 U/nmol), a ligação de ChiΔSP à quitina coloidal também foi superior à ligação de ChiΔSP.CBD e as maiores atividades (60-100% da atividade total) de ChiΔSP e ChiΔSP.CBD foram detectadas a 30 e 40°C em uma ampla faixa de pH (4,0-9,0). Após estimar a CL50 da proteína Vip3Aa42 sobre lagartas neonatas de D. saccharalis em 352,132 ng/cm2 de dieta, foram avaliadas interações entre Vip3Aa42 e ChiΔSP ou ChiΔSP.CBD. Os resultados indicam que a adição isolada de 2,41 nmol/cm2 de ChiΔSP ou ChiΔSP.CBD não resultou na mortalidade de lagartas de D. saccharalis. A combinação da CL50 de Vip3Aa42 com 2,41 nmol/cm2 de ChiΔSP apresentou efeito sinérgico para mortalidade das lagartas (mortalidade de 90%), mas nenhum efeito (aditivo, sinérgico ou antagônico) foi observado para a combinação da CL50 de Vip3Aa42 com 2,41 nmol/cm2 de ChiΔSP.CBD. A ausência do CBD em ChiΔSP.CBD e consequentes alterações bioquímicas impediu sinergismo de ChiΔSP.CBD com Vip3Aa42 sobre lagartas de D. saccharalis. / Chemical control is applied to manage the sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae). However, this control tactic may result in great damages to the environment and non-target species, including men. Alternativelly, the use of the entomopathogen Bacillus thuringiensis can be made to manage D. saccharalis and other insect pests with reduced undisarable side effects. Beyond the use of formulations of B. thuringiensis for pest control, one or more genes of insecticidal proteins from B. thuringiensis such as Cry and Vip are incorporated into commercially available transgenic plants with insect resistance in Brazil. Despite of the high adoption rate, reduced side effects, and high efficency, the intensive use of this technology may result in the selection of insect-resistant populations to transgenic plants. For this reason, the search for new genes with different modes of action to delay the evolution of resistance must be constant. In this scenario, a chitinase from B. thuringiensis has potential to be incorporated into a new generation of transgenic plants. Chitinases are enzymes of the family of glycosyl hydrolases which catalyze the hydrolysis of chitin. Chitinases present catalytic domains responsible for the hydrolysis of chitin and chitin-binding domains (CBD), both associated to insecticidal activity. Insecticidal activity of chitinases is related to the disruption of the peritrophic membrane of insects, which results in the loss of properties and functions of this structure. In addition to the discovery of insecticidal proteins with different modes of action, positive interactions with other insecticidal proteins is desirable for pest management. In the present work, two forms of a chitinase of B. thuringiensis - ChiΔSP (without signal peptide) and ChiΔSP.CBD (without signal peptide and without the chitin-binding domain) - were produced by heterologous expression in Escherichia coli for biochemical and biological analyses. Chitinolytic activity of ChiΔSP (3.07 ± 0.15 U/nmol) was higher than that observed for ChiΔSP.CBD (1.83 ± 0.06 U/nmol) towards colloidal chitin. The binding of ChiΔSP to colloidal chitin was also higher than that observed for ChiΔSP.CBD, and the ChiΔSP or ChiΔSP.CBD chitinolytic activity (60-100% of total chitinolytic activity) was detected at 30 and 40°C in a broad pH range (4.0-9.0). After estimating the LC50 of the Vip3Aa42 protein at 352,132 ng/cm2 of diet, interactions between combinations of Vip3Aa42 and ChiΔSP or ChiΔSP.CBD were evaluated. Results indicate that the adition of 2,41 nmol/cm2 of ChiΔSP or ChiΔSP.CBD do not result in larval mortality of D. saccharalis. The combination of the LC50 of Vip3Aa42 with 2,41 nmol/cm2 nmol of ChiΔSP resulted in a synergic effect (mortality of 90%), but no effect (aditive, sinergic or antagonic) was observed when the LC50 of Vip3Aa42 was combined to 2,41 nmol/cm2 nmol of ChiΔSP.CBD. Lack of CBD in ChiΔSP.CBD resulted in biochemical changes in this form of B. thuringiensis chitinase which impacted on the sinergic effect of this protein with Vip3Aa42 against D. saccharalis. / CNPq: 140093/2015-0

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:51:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 11296.pdf: 4242945 bytes, checksum: 1b28e9ed10898f5407d88db1df72b329 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Submitted by Inácio Mateus Assane null (inaciomateusassane@gmail.com) on 2018-03-13T16:40:15Z No. of bitstreams: 1 Versão Final da Dissertação_Inácio Mateus Assane.pdf: 2500612 bytes, checksum: e7b1dcaa29bfec4105b34a055b4a403d (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-03-16T17:46:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 assane_im_me_jabo.pdf: 2500612 bytes, checksum: e7b1dcaa29bfec4105b34a055b4a403d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-16T17:46:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 assane_im_me_jabo.pdf: 2500612 bytes, checksum: e7b1dcaa29bfec4105b34a055b4a403d (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os surtos de bacterioses na piscicultura são imprevisíveis, por essa razão é necessário dispor de opções terapêuticas eficazes para reduzir a morbidade e mortalidade. Para que a terapia seja eficaz, a escolha do antimicrobiano deve se basear nas informações farmacocinéticas do fármaco no hospedeiro, nas condições de produção e na sensibilidade do patógeno. No Brasil, atualmente só dois antimicrobianos são legalizados para uso na aquicultura, a oxitetraciclina (OTC) e o florfenicol (FFC), os quais muitas vezes são ineficazes. Destes, somente o FFC é autorizado para tratar bacterioses em tilápia-do-Nilo, a espécie mais produzida no país. Este cenário nos levou a investigar a atividade antimicrobiana do tianfenicol (TAF) contra as principais bactérias patogênicas de peixes cultivados no Brasil. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) do TAF para 49 cepas isoladas de surtos de bacteriose ocorridos no período 2011 a 2017 em três estados. Adicionalmente, avaliou-se a atividade antimicrobiana do TAF (G1: 10 mg/kg), do FFC (G2: 10 mg/kg) e da combinação do TAF com o FFC (G3: TAF+FFC: 5 + 2,5 mg/kg e G4: 2,5 + 1,25 mg/kg) no tratamento de aeromonose em tilápia-do-Nilo experimentalmente infectadas com Aeromonas hydrophila. Como resultado do estudo in vitro, mais da metade das cepas testadas foram sensíveis ao TAF, sendo que os gêneros Aeromonas, Lactococcus e Vibrio foram os mais sensíveis. No estudo in vivo, o TAF foi eficaz no tratamento da aeromonose em tilápia-do-Nilo, tanto isolado como combinado. Os grupos G1, G2, G3, G4 e o controle apresentaram uma taxa de sobrevivência de 88,33 ± 11,55%; 70 ± 10%; 73,33 ± 11,55%; 85,93 ± 5,13% e 3,33 ± 5,77%, respectivamente, sendo todos diferentes do controle (p < 0,001). Os resultados do estudo sugerem que o TAF pode ser uma boa opção de tratamento de aeromonose, lactococose e vibriose em peixes. Além disso, a combinação do TAF com o FFC apresentou um efeito sinérgico, mostrando que é possível reduzir a quantidade de antimicrobiano e obter o mesmo efeito terapêutico. / Outbreaks of bacterial diseases in fish farm are unpredictable; therefore, it is necessary to have effective therapeutic options to reduce the morbidity and mortality. For effective therapy, the anticipated pharmacokinetics and antibacterial activity of the antimicrobial in the target fish species under the given conditions must be considered before decide which antimicrobial to use. In Brazil, only two antimicrobials are approved for use in aquaculture, oxytetracycline (OTC) and florfenicol (FFC), which are often innefective. Moreover, only FFC is approved for use to treat bacterial diseases in Nile tilapia, the main specie in Brazil. This scenario led us to investigate the antibacterial activity o thiamphenicol (TAP) against the main bacteria infecting fishes in Brazil. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of TAP were determined for 49 strains isolated from diseases outbreaks registered during 2011 – 2017 in three States. Additionally the antibacterial activity of TAP (10 mg kg-1), FFC (10 mg kg-1) and TAF combined with FFC (G3: TAF+FFC: 5 + 2.5 mg kg-1 e G4: 2.5 + 1.25 mg kg-1) against Aeromonas hydrophila in Nile tilapia aeromoniosi models were evaluated. More than half of the tested strains were in vitro sensitive to TAP, being TAP highly potent against Aeromonas, Lactococcus, and Vibrio. The in vivo therapy with TAP alone and combined with FFC was effective to treat aeromoniosis in Nile tilapia. Groups G1, G2, G3, G4 and control had survival rate of 88.33 ± 11.55%; 70 ± 10%; 73.33 ± 11.55%; 85.93 ± 5.13% e 3.33 ± 5.77%, respectively, all being different from the control (p < 0,001). These findings suggest the potential of TAP as a treatment option for aeromoniosis, lactococcosis and vibriosis. The combination of TAF and FFC has a synergy effect, showing that it is possible to reduce the amount of antimicrobial while maintaining the therapeutic effectiveness. / 190049/2015-4