L'oxyde nitrique (NO), un important messager biologique, est biosynthétisé par une hémoprotéine nommée Oxyde Nitrique Synthase (NOS). Il est produit par une réaction d'oxydation du groupement guanidino de la L-arginine en Nm -hydroxy-L-arginine, qui est ensuite elle-même oxydée en NO et en L-citrulline. Chez les mammifères, deux types de complexes oxygénés formés durant la catalyse par les NOS ont été identifiés: hème-oxy 1 (Bande de Soret centrée à 420 nm) et hème-oxy 2 (Bande de Soret centrée à 430 nm). On sait que hème-oxy 2 possède un caractère ferrique superoxyde (Fe -O2"), puisqu'il a déjà été caractérisé en spectroscopie de résonance Raman. Cependant, peu d'informations sont connues sur le complexe hème-oxy 1. Dans le but de caractériser la nature de complexe hème-oxy 1 ansi que certains intermédiaires impliqués dans le mécanisme de catalyse des NOS, ce dernier a été l'objet d'études en spectroscopie de résonance Raman.

No / Summary. Background: Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity in endothelial cells is regulated by post-translational phosphorylation of critical serine, threonine and tyrosine residues in response to a variety of stimuli. However, the post-translational regulation of eNOS in platelets is poorly defined. Objectives: We investigated the role of tyrosine phosphorylation in the regulation of platelet eNOS activity. Methods: Tyrosine phosphorylation of eNOS and interaction with the tyrosine phosphatase SHP-1 were investigated by coimmunoprecipitation and immunoblotting. An in vitro immunoassay was used to determine eNOS activity together with the contribution of protein tyrosine phosphorylation. Results: We found platelet eNOS was tyrosine phosphorylated under basal conditions. Thrombin induced a dose- and time-dependent increase in eNOS activity without altering overall level of tyrosine phosphorylation, although we did observe evidence of minor tyrosine dephosphorylation. In vitro tyrosine dephosphorylation of platelet eNOS using a recombinant protein tyrosine phosphatase enhanced thrombin-induced activity compared to thrombin alone, but had no effect on endothelial eNOS activity either at basal or after stimulation with bradykinin. Having shown that dephosphorylation could modulate platelet eNOS activity we examined the role of potential protein phosphatases important for platelet eNOS activity. We found SHP-1 protein tyrosine phosphatase, co-associated with platelet eNOS in resting platelets, but does not associate with eNOS in endothelial cells. Stimulation of platelets with thrombin increased SHP-1 association with eNOS, while inhibition of SHP-1 abolished the ability of thrombin to induce elevated eNOS activity. Conclusions: Our data suggest a novel role for tyrosine dephosphorylation in platelet eNOS activation, which may be mediated by SHP-1.

L’obésité est une pathologie complexe d’origine multifactorielle qui constitue un facteur de risque indépendant de maladies métaboliques dont le diabète de type 2. L’inflammation chronique qui accompagne l’obésité semble d’ailleurs contribuer au développement de la résistance à l’insuline. Ainsi, il a été montré que l’induction de iNOS, enzyme importante lors des réponses immunitaires, dans les tissus et cellules cibles de l’insuline était impliquée dans la pathogenèse de la résistance à l’insuline associée à l’obésité. Les résultats présentés dans cet ouvrage permettent d’approfondir les connaissances concernant l’implication de cette enzyme dans les troubles métaboliques ainsi que d’identifier des cibles cellulaires potentielles pouvant servir à contrecarrer les effets délétères associés à celle-ci. Dans la première étude, nous avons observé que le resvératrol pouvait inhiber l’induction de iNOS et la production de NO dans le muscle et le tissu adipeux des souris traitées avec l’endotoxine LPS. Ces effets ont été reproduits dans des modèles in vitro. Nous avons pu également déterminer que l’inhibition de iNOS par le resvératrol impliquait l’activation de la voie de l’AMPK plutôt que celle de SIRT1 dans les cellules musculaires. Dans la deuxième étude, nous avons généré des souris MYOnos2-KO, HEPnos2-KO et ADPnos2-KO, modèles dans lesquels l’expression de iNOS est invalidée spécifiquement dans les myocytes striés, les hépatocytes et les adipocytes respectivement. Nous avons pu remarquer que l’invalidation de iNOS dans les myocytes, les hépatocytes et les adipocytes ne semble pas suffire à contrer les effets délétères d’une diète obésogène sur la sensibilité à l’insuline ou la tolérance au glucose. Par contre, l’invalidation de iNOS dans les adipocytes semble améliorer le métabolisme lipidique. Finalement, dans notre troisième étude, nous avons pu démontrer que iNOS pouvait être induite dans des cellules adipeuses d’origine humaine et que l’expression de cette enzyme, dans le tissu adipeux, corrélait négativement avec les niveaux d’adiponectine plasmatique chez les sujets de la cohorte étudiée. L’ensemble de nos études nous permet de proposer des cibles plus spécifiques visant l’inhibition de iNOS ainsi que de contribuer à la compréhension du rôle potentiel de cette protéine dans le développement des troubles métaboliques chez l’homme. / Obesity is a complex pathology, with a multifactorial origin, as well as an independent risk factor for metabolic diseases such as type 2 diabetes. It has been suggested that obesity-associated chronic inflammation contributes to the development of insulin resistance. It has been shown that iNOS, an important enzyme involved in immune responses, has been implicated in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance. Results presented here contribute to better understand the implication of this enzyme in metabolic disorders and thus identify potential cellular targets that might counteract deleterious effects associated with its induction. In the first study, resveratrol was shown to inhibit iNOS induction as well as NO production in muscle and adipose tissue of LPS-treated mice. These effects were recapitulated in vitro. We have also demonstrated that iNOS inhibition by resveratrol involves AMPK but not SIRT1 activation in muscle cells. In the second study, we generated MYO-nos2-KO, HEPnos2-KO and ADPnos2-KO mice, where iNOS expression was specifically invalidated in myocytes, hepatocytes and adipocytes respectively. We have observed that iNOS deletion in myocytes, hepatocytes and adipocytes was not sufficient to counteract obesogenic-diet deleterious effects on insulin sensitivity and glucose tolerance. However, iNOS specific deletion in adipocytes seems to improve lipid metabolism. In our third chapter, we have shown that iNOS could be induced in adipose cells of human origin and that its expression in adipose tissue, was negatively correlated with plasma adiponectin levels of the subjects of the study. Overall, our results allow us to propose more specific targets where iNOS inhibition might be beneficial. Likewise, the results presented here contribute to the understanding of the potential role of this protein in the development of human metabolic disorders.

La résistance à l'insuline est un désordre métabolique précoce dans le développement de l'obésité et du diabète de type 2. Plusieurs évidences suggèrent que la surproduction de monoxyde d'azote (NO) via l'induction de la synthase du monoxyde d'azote inductible (iNOS) dans les principaux organes cibles de l'insuline conduit à un état de résistance à l'insuline. De plus, des études récentes ont montré que l'invalidation génétique de iNOS chez des souris obèses prévient l'apparition de la résistance à l'insuline au niveau systémique et périphérique. Plusieurs agents thérapeutiques sont présentement disponibles en clinique pour traiter la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2, mais aucun d'entre eux ne cible spécifiquement la voie de iNOS et du NO. Dans notre première étude, nous avons trouvé que l'inhibition pharmacologique et sélective de iNOS avec le 1400W améliore l'action de l'insuline après seulement 4 jours de traitement chez des souris db/db génétiquement obèses et diabétiques. L'effet bénéfique du 1400W était associé avec la diminution de l'hyperglycémie à jeun et du stress nitrosatif déterminé par la diminution du niveau de 3-nitrotyrosine dans le muscle. Cependant, l'effet sensibilisateur du 1400W sur l'action de l'insuline était transitoire puisque aucun effet n'a pu être observé après 10 jours de traitement. Lors de notre deuxième étude, nous avons montré que l'invalidation génétique de iNOS chez des souris obèses augmente les effets métaboliques de la rosiglitazone, un agoniste des PPARy utilisé en clinique dans le traitement de la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2. Nous avons entre autres observé une efficacité supérieure de la rosiglitazone à améliorer la tolérance au glucose et à améliorer le défaut d'activation de la voie Akt par l'insuline dans le foie chez les souris iNOS-/- obèses. Ces effets étaient associés avec une augmentation du niveau plasmatique des gros complexes de l'adiponectine (HMW) ainsi que l'activation de la voie de l'AMPK dans les principaux tissus cibles de l'insuline. Finalement, dans notre troisième étude, nous avons démontré que le resvératrol, un composé naturel contenu dans le raisin, diminue l'induction de iNOS et du NO induite par les cytokines dans les cellules musculaires et les adipocytes en culture. Chez la souris, l'expression de iNOS induite par l'endotoxine LPS a été inhibée par le resvératrol dans le muscle et le tissu adipeux, ce qui était associé avec une diminution de l'accumulation des dérivés du NO dans ces tissus. Cependant, aucun effet du resvératrol sur l'expression de iNOS et la production de NO n'a pu être observé dans le foie des souris LPS. Ensemble, les résultats de nos études suggèrent que l'inhibition pharmacologique de iNOS représente une nouvelle stratégie prometteuse à développer dans la gestion du traitement de la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2.

Malgré la relocalisation au noyau d'une majorité des gènes du procaryote ancestral à l'origine des mitochondries, une poignée de gènes réside encore dans l'organite après près de deux milliards d'années d'évolution. Les raisons du maintien d'un génome mitochondrial sont mal comprises. Je me suis intéressé à cette problématique via des expériences de relocalisation artificielle de gènes mitochondriaux chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous avons réussi, pour la première, à exprimer de manière fonctionnelle depuis le noyau le gène ATP9 qui encode une petite protéine hydrophobe essentielle au canal à protons de l'ATP synthase. Majoritairement mitochondrial chez les eucaryotes, comme S.cerevisiae, ce gène est retrouvé dans le génome nucléaire de la majorité des métazoaires, des algues vertes chlorophycées et des champignons filamenteux ascomycètes tel que Podospora anserina. Nos résultats montrent que l'hydrophobicité de la sous-unité Atp9p doit être diminuée pour qu'elle puisse être importée dans la mitochondrie depuis le cytosol. Nous avons également identifié un certain nombre d'autres adaptations pour optimiser l'expression du gène ATP9 relocalisé. Il apparaît donc que si le transfert du gène ATP9 est en principe possible chez la levure, il s'agit d'un processus très complexe. Une telle évolution n'a donc que peu de chances de se produire et d'être maintenue par la sélection naturelle, à moins que le transfert du gène ATP9 au noyau ne confère quelque avantage à l'organisme. Nous avons confirmé cette hypothèse par une étude menée chez P.anserina où nous avons montré que la relocalisation au noyau du gène ATP9, qui s'est produite naturellement au cours de l'évolution, a permis la mise en place de régulations spécifiques permettant d'ajuster les besoins en ATP synthase au cours du cycle de vie de ce champignon. Les résultats de cette étude nous amènent à introduire une nouvelle hypothèse selon laquelle les variations de contenu en gènes des génomes mitochondriaux ne sont pas influencées uniquement par des contraintes au niveau de la structure de leur produits, mais aussi par le mode de vie de l'organisme. / Despite the nuclear relocation of most genes of the ancestral procaryotic genome which gave birth to mitochondria, a small set of genes still remains into the organite after 2 billions years of evolution. The reasons for this maintenance of mitochondrial genome are currently not clear. I studied these questions by experimenting artificial relocations of mitochondrial genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We managed, for the first, to functionally express the ATP9 gene from the nucleus, which encodes a small hydrophobic essential subunit of the proton chanel of the ATP synthase. Mostly mitochondrial within eukaryotes like S.cerevisiae, this gene can be found in the nuclear genome in most metazoans, chlorophyceans green algae and ascomycota filamentous fungi like Podospora anserina. Our results show that the hydrophobicity of the Atp9p subunit has to be decreased to be imported into the mitochondria from the cytosol. We also identified some adaptations optimizing the expression of the relocated ATP9 gene. It seems that if the ATP9 gene relocation is possible within the yeast, yet it is a complex and difficult process. Such an evolution has only few chances to occur and to be maintained by natural selection, unless it could confer some advantage to the organism. We have confirmed this hypothesis in a study made on P.anserina, in which we showed that the natural ATP9 relocation to the nucleus that appeared during its evolution allowed the setting up of specific regulations modulating the ATP synthase needs during the life-cycle of this fungus. The results presented here lead us to introduce a new hypothesis postulating that the variations of the set of genes contained in the mitochondrial genome are influenced not only by the constraints generated by their products structure, but also by the lifestyle of the organism.

Identification et caractérisation de la première N-acylphosphatidyléthanolamine synthase chez A. thaliana. Les N-acylphosphatidyléthanolamines (NAPE) sont des phospholipides complexes peu abondants au sein des membranes biologiques mais largement répandues dans différents organismes. Outre ses fonctions de stabilisation des membranes ce lipide est davantage connu pour être le précurseur des N-acyléthanolamines (NAE) qui sont impliquées dans de très nombreuses voies de signalisation chez les plantes (lors de la germination, du développement racinaire, de l’induction de gène de défense, etc.) comme chez les animaux (apoptose, ligand des récepteurs endocannabinoïdes, notion de satiété, etc.). Au début de ma thèse, les gènes codant pour les enzymes impliquées dans les différentes étapes de la voie métabolique des NAE (e.g NAPE-PLD, FAAH1 et 2) ont été caractérisées exceptées le ou les gène(s) codant pour l’enzyme catalysant la synthèse de NAPE précurseurs de ces lipides. Une étude bioinformatique a permis d’identifier de nouvelles séquences codantes pour des acyltransférases putatives chez A. thaliana dont celle du gène At1g78690. La caractérisation fonctionnelle de cette enzyme a été déterminée après son expression hétérologue chez E.coli sur fractions membranaires et protéines purifiées. Puis le profil d’expression génique, la localisation cellulaire de la protéine ainsi que son activité ont été étudiés chez les plantes à partir notamment de mutants d’A. thaliana (ADN-T et « 35S »). Les résultats obtenus au cours de cette étude ont permis d’identifier et de caractériser la première NAPE synthase chez les plantes. / Discovery and characterization of an A. thaliana N-acylphosphatidylethanolamine synthase. N-acylphosphatidylethanolamine (NAPE) is a widespread, albeit minor, membrane phospholipid in various organisms. Besides its stabilizing properties to membranes bilayers, NAPE is known to be the precursor for N-acylethanolamine (NAE) synthesis. NAE have been shown to regulate a variety of physiological functions in both plants (germination, root development, gene induction, etc.) and animals (apoptosis, ligand for cannabinoid receptors, satiety properties, etc.) At the beginning of my PhD, the genes encoding the enzymes involved in the different steps of NAE metabolism were well characterized (e.g NAPE-PLD, FAAH 1 and 2), with the exception of the NAPE synthase gene(s). A bioinformatic study allowed the identification of coding sequences for putative new acyltransferases in A. thaliana, such as the At1g78690 gene. After expression in E. coli, the functional characterization of At1g78690p was carried out by analyses of the lipid content and by enzymatic assays using membrane fractions or purified proteins. The localisation of the protein and its activity were also studied in A. thaliana mutants (ADN-T and “35S”). This study shows the identification and characterization of the first NAPE-synthase in plants.

Les polykétides sont des composés naturels. Ces composés possèdent des rôles thérapeutiques variés tels que antifongiques, antibiotiques, anticancéreux, immunosuppresseurs ou encore anticholestérolémiques. Par conséquent, la recherche de nouvelles structures possédant des bioactivités diverses se révèlent être intéressante. Une stratégie prometteuse pour créer des nouveaux polykétides est l’ingénierie génétique des enzymes synthétisant ces molécules, les polykétide synthases modulaires (PKS), une approche désignée sous le terme de « biologie synthétique ». Pour ce faire, il faut comprendre de façon détaillée le fonctionnement de ces systèmes multienzymatiques. Plusieurs points restent à éclaircir, dont : i) le contrôle de la stéréochimie du polykétide ; et ii) l’interaction des sous-unités composant la PKS. Lors de ma thèse, j’ai identifié deux kétoréductases (KR) qui, introduites dans un contexte modulaire intrinsèquement non-épimérisant, sont capables d’épimériser le méthyle en Cα de façon efficace. Cependant, la modification de la stéréochimie du polykétide ne dépend pas exclusivement des propriétés intrinsèques de la KR mais aussi du contexte modulaire. J’ai également contribué à la réalisation d’un second projet, pour lequel notre équipe a mis en évidence une nouvelle classe de domaine de docking de PKS de type trans-AT présentant une nouvelle topologie. L’un des DD étudié est une protéine intrinsèquement désordonnée dont le repliement est induit par son partenaire. Nous avons caractérisé l’interface complète entre deux sous-unités de PKS de type trans-AT, révélant une chambre de réaction protégée dans laquelle les chaînes de polykétide peuvent croître / Polyketides are natural products which exhibit a variety of therapeutic activities, including anti-fungal, antibiotic, anticancer, immunosuppressant and anti-cholesterolemic properties. Given their medical and economic importance, there is significant interest in identifying new structures with new biological activities. A promising strategy to create such analogues is to genetically engineer the enzymes responsible for synthesizing these molecules, the modular polyketide synthases (PKSs), an approach referred to as ‘synthetic biology’. However, in order to increase the efficacy of this approach, we must understand in detail how the PKS multienzymes work. A number of issues remain to be clarified, including: i) polyketide stereocontrol, ii) the interaction of the component subunits PKS. During my thesis, I identified two ketoreductase (KR) domains which when introduced into an intrinsically non-epimerizing modular context, were able to efficiently epimerise at the Cα of a model polyketide. I also showed that the modular context in which the KR functions has an influence on the ultimate stereochemical outcome. I also made essential contributions to a second project, in which the group identified a novel family of docking domains (DD) in the trans-AT type of PKS which present a novel topology. One of the two model DDs studied is an intrinsically disordered protein whose folding is induced by its partner. Finally, we were able to visualize a complete intersubunit interface within a trans-AT PKS, revealing a protected reaction center in which polyketide chains can grow.

Xue, Hongmei. / "December 2010." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 165-206). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

by Wong Ho Wai. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 1997. / Includes bibliographical references (leaves 107-129). / Abstract --- p.i / List of Abbreviations --- p.ii / Contents --- p.iii / Chapter Chapter 1. --- Introduction / Chapter 1.1 --- Introduction of aging in central nervous system --- p.1 / Chapter 1.2 --- Introduction of hippocampus / Structure of the hippocampus --- p.4 / Function of hippocampus --- p.6 / Chapter 1.3 --- A literature review of aging in hippocampus / Cell loss in aging --- p.8 / Ultrastructural changes in aging --- p.9 / Changes in neurotransmitter system --- p.10 / Neuroglial change --- p.11 / Change in potentiation --- p.13 / Chapter 1.4 --- A literature survey of Nitric Oxide Synthase (NOS) / General introduction of Nitric Oxide Synthase --- p.15 / Introduction of nNOS --- p.15 / Introduction of iNOS --- p.16 / Introduction of eNOS --- p.17 / Similarities and differences among isoforms --- p.18 / Role of NO/NOS in neurotransmission --- p.19 / Role of NO in neurotoxicity --- p.23 / Chapter 1.5 --- Aim of study --- p.25 / Chapter Chapter 2. --- Change of nNOS in aging / Chapter 2.1 --- Purpose and approach --- p.27 / Chapter 2.2 --- Basic principle of the techniques / Basic principle of immunohistochemistry --- p.28 / Basic principle of RT-PCR --- p.28 / Chapter 2.3 --- Experimental procedure / nNOS immunohistochemistry --- p.32 / RT-PCR of nNOS --- p.34 / Chapter 2.4 --- Result / nNOS immunohistochemistry --- p.38 / RT-PCR of nNOS --- p.44 / Chapter Chapter 3. --- Expression of iNOS in aging / Chapter 3.1 --- Purpose and approach --- p.50 / Chapter 3.2 --- Experimental procedure / iNOS immunohistochemistry --- p.50 / RT-PCR analysis of iNOS --- p.51 / Chapter 3.3 --- Result / iNOS immunohistochemistry --- p.52 / RT-PCR analysis of iNOS --- p.56 / Chapter Chapter 4. --- Verification of the RT-PCR product of iNOS / Chapter 4.1 --- Purpose and approach --- p.58 / Chapter 4.2 --- Basic principle --- p.58 / Chapter 4.3 --- Experimental procedure / Elution of PCR product from PAGE gel --- p.60 / Restriction digestion of the eluted PCR product --- p.61 / Chapter 4.4 --- Result --- p.62 / Chapter Chapter 5. --- Identification of the iNOS-positive cells / Chapter 5.1 --- Purpose and approach --- p.64 / Chapter 5.2 --- Experimental procedure --- p.64 / Chapter 5.3 --- Result --- p.65 / Chapter Chapter 6. --- Quantitation of astrocyte in aging hippocampus / Chapter 6.1 --- Purpose and approach --- p.67 / Chapter 6.2 --- Experimental procedure --- p.68 / Chapter 6.3 --- Result --- p.69 / Chapter Chapter 7. --- Detection of apoptosis in aging / Chapter 7.1 --- Introduction of apoptosis --- p.74 / Chapter 7.2 --- Purpose and approach --- p.75 / Chapter 7.3 --- Basic principle --- p.76 / Chapter 7.4 --- Experimental procedure / TUNEL method --- p.77 / DNA gel electrophoresis --- p.78 / Chapter 7.5 --- Result / TUNEL method --- p.80 / DNA gel electrophoresis --- p.82 / Chapter Chapter 8. --- Discussion / Chapter 8.1 --- Pattern of neuronal NOS in aging / Localization of nNOS --- p.84 / Decrease in staining of nNOS in the hippocampus during aging --- p.87 / No change in nNOS mRNA level --- p.88 / nNOS in aging - past and present works --- p.89 / Implication of the result --- p.91 / Chapter 8.2 --- Increased iNOS expression in aging / Neurotoxicity of iNOS --- p.93 / Circumstances of iNOS expression --- p.95 / Discussion of the present study --- p.96 / Chapter 8.3 --- Detection of apoptosis in aging --- p.103 / Chapter Chapter 9. --- Conclusion --- p.106 / Biblography --- p.107 / Appendix --- p.130 / Acknowledgements --- p.134

L’ANS recombinante de Vitis vinifera (VvANS) a été exprimée chez E. coli, et purifiée par chromatographie d’affinité sur colonne Nickel. La production et purification de l'holoenzyme chargée en fer a été mise en point, afin d’éviter les réactions d'oxydation non-enzymatique incontrôlée en présence de sel de Fe(II). Un complexe VvANS-Fe(II) stable est formé en présence d'α- cétoglutarate et d'ascorbate, complexe qui est catalytiquement actif à PO2 ambiante en l'absence de sel de Fe(II). La transformation de la (+)-catéchine par VvANS a été étudiée avec ou sans ascorbate, en utilisant le complexe VvANSFe( II) ou l’holoenzyme co-incubée en présence de sulfate ferreux, afin d’étudier le rôle de l’ascorbate. Aucune activité enzymatique n’a été observée en l'absence d’ascorbate, ce qui indique qu'il s'agit d'un cofacteur indispensable de VvANS. Un adduit covalent ascorbate-cyanidine est produit in vitro, mais seulement en l'absence d'un autre réducteur nucléophile majeur, le glutathion GSH. Les deux stéréoisomères de la leucocyanidine (flavan-diols 3,4-cis et 3,4-trans), substrats potentiels de VvANS, mais non commerciaux, ont été synthétisés par réduction de la dihydroquercétine par NaBH4, puis identifiés par RMN du proton. L'analyse des deux stéréoisomères par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) montre que leurs voies de fragmentation MS/MS sont distinctes et peuvent être utilisées pour les distinguer lors de leur production. Les deux stéréoisomères sont stables en milieu aqueux congelé à -20°C. Douze flavonoïdes de quatre familles distinctes (flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols et flavan-3,4-diols) ont été testés comme substrats potentiels. Tous les produits enzymatiques ont été purifiés par HPLC en phase inverse, puis identifiés par MS/MS, avec les résultats suivants: 1) Seuls les dihydroflavonols de configuration (2R,3R) sont acceptés comme substrats par VvANS dont l'activité diminue avec le nombre de groupements hydroxyles du cycle B. 2) Seuls les flavan-3-ols ou flavan-3,4-diols de configuration (2R,3S) ayant un catéchol ou trois OH phénoliques vicinaux sur le cycle B sont acceptés comme substrats. 3) La naringénine n'est pas substrat de VvANS, sans doute en raison de l'absence de groupement hydroxyle en C3. […] Le glutathion GSH est un puissant nucléophile, réducteur et piégeur de radicaux libres, qui est abondant dans la baie de raisin. Nous avons donc étudié son effet sur l'activité de VvANS avec tous les substrats identifiés. GSH n’a pas d'effet sur la transformation des dihydroflavonols et des flavan-3,4-diols, mais il modifie considérablement le mode de transformation de la (+)-catéchine et de la (+)-gallocatéchine. En présence de (+)-catéchine et de GSH, on observe deux produits majeurs, la cyanidine et un adduit thioéther cyanidine-glutathion, et le rendement de production est beaucoup plus élevé qu'en l'absence de GSH. De plus, l’adduit covalent ascorbate-cyanidine et le dimère issu de la (+)-catéchine obtenus lors de la réaction réalisée en l'absence de GSH ont disparu. Nos données suggèrent que l'adduit covalent cyanidine-glutathion est un thioéther en C4 qui fait l'objet d'un équilibre de tautomérisation céto-énolique en C3, et se décompose en cyanidine et GSH. En présence de (+)-gallocatéchine, un adduit thioéther similaire delphinidine-glutathion est aussi observé. Pour tester l'éventuelle spécificité de GSH, trois autres mercaptans (thiomalate, cystéine et cystéamine) ont été testés et aucun adduit similaire n’a été observé, ce qui suggère que GSH est un ligand spécifique, et pourrait être un coenzyme de VvANS. Nos résultats suggèrent que les anthocyanidines pourraient être produites in vivo à partir d'un substrat flavan-3-ol (catéchine ou gallocatéchine) via un intermédiaire thioéther de glutathion, alors que le stéréoisomère naturel (3,4-cis) de la leucocyanidine n'est pas transformé en cyanidine. / Recombinant anthocyanidin synthase from Vitis vinifera (VvANS) has been expressed in E. coli, and purified by nickel affinity chromatography. The production and purification of the iron-loaded enzyme has been developed in order to avoid uncontrolled nonenzymatic oxidation reactions in the presence of Fe(II) salt. A stable VvANS-Fe(II) complex is formed in the presence of 2-oxoglutarate and ascorbate, and this complex is catalytically active at ambient PO2 in the absence of Fe(II) salt. The transformation of (+)-catechin by VvANS has been studied with and without ascorbate, by using either the VvANSFe( II) complex or the holoenzyme co-incubated with ferrous sulfate, to investigate the role of ascorbate. No enzyme activity has been observed in the absence of ascorbate, which means that it is an essential enzyme cofactor. A covalent adduct ascorbate-cyanidin is produced in vitro, but only in the absence of glutathione (GSH), another major nucleophilic and reducing agent. The two stereoisomers of leucocyanidin (3,4-cis et 3,4-trans flavan-diols) which were expected to behave as substrates of VvANS, are not commercial and were synthesized by reduction of dihydroquercetin by NaBH4, and characterized by proton NMR. The analysis of the two stereoisomers by means of tandem mass spectrometry (MS/MS) shows that their fragmentation pathways are distinct and may be used to distinguish them during their production. The two stereoisomers are stable in frozen aqueous medium at -20°C. Twelve flavonoids of four distinct families (flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols et flavan-3,4-diols) were tested as potential substrates of VvANS. All enzymatic products were purified by means of reverse-phase HPLC and characterized by MS/MS, with the following results: 1) Only dihydroflavonols of (2R,3R) configuration are accepted as substrates by VvANS, the activity decreasing with the number of hydroxyl groups of ring B. 2) Only flavan-3-ols or flavan-3,4-diols of (2R,3S) configuration having either a catechol or three vicinal phenolic OH on ring B are accepted as substrates. 3) Naringenin is not substrate of VvANS, most likely because a C3 hydroxyl group is missing. […] Glutathione GSH is a powerful nucleophilic and reducing agent as well as a free radical scavenger, which is abundant in grape berries. We therefore studied its effect on VvANS activity with all identified substrates. GSH has no effect on the transformation of dihydroflavonols and flavan-3,4-diols, but it considerably modifies the transformation pattern of (+)- catechin and (+)-gallocatechin. In the presence of (+)-catechin and GSH, we observe two major products, cyanidin and a cyanidin-glutathione thioether, with production yields which are much higher than in the absence of GSH. Moreover, the ascorbate-cyanidin covalent adduct and the (+)-catechin dimer that had been obtained in the absence of GSH have disappeared. Our data suggest that the cyanidin-glutathione adduct is a C4-thioether which is in equilibrium between the two keto-enolic tautomeric forms at C3, and decomposes into cyanidin and GSH. In the presence of (+)-gallocatechin, a similar delphinidin-glutathione thioether adduct is also observed. In order to test the possible specificity of GSH as a cofactor, three other mercaptans (thiomalate, cysteine and cysteamine) were tested, and no similar product was observed, which suggests that GSH is a specific ligand, and might be a coenzyme of VvANS. Our results suggest that anthocyanidins could be produced in vivo from a flavan-3-ol substrate (catechin or gallocatechin) via a glutathione thioether intermediate, whereas the natural 3,4-cis stereoisomer of leucocyanidin is not transformed into cyanidin by VvANS.