Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 141-154).

University, Diss., 2002--Göttingen.

Universiẗat, Diss., 2002--Göttingen.

Dans un premier temps, je me suis intéressé à la sous-unité ε de l’ATP synthase mitochondriale chez la levure, un organisme qui se prête bien à l’étude des fonctions mitochondriales. Cette protéine fait partie d’un élément de l’ATP synthase appelé la tige centrale. Celui-ci permet de coupler le domaine translocateur de protons de cette enzyme (FO) à son secteur catalytique (F1) où l’ATP est synthétisé. En utilisant un système d’expression régulable (répressible par la doxycycline), j’ai montré qu’en l’absence de la sous-unité ε les secteurs F1 et FO ne sont plus couplés, avec pour résultat des fuites massives de protons à travers la membrane interne des mitochondries. J’ai ensuite montré que l’absence de la sous-unité ε peut être compensée par des mutations ralentissant l’activité du FO. Ces données permettent de conclure que la sous-unité ε est nécessaire au maintien de l’intégrité physique de l’ATP synthase lors de son fonctionnement. Dans un second temps, j’ai cherché à identifier de nouveaux facteurs intervenant dans la biogenèse du FO. Pour cela, j’ai utilisé un crible génétique où la survie des cellules de levure est conditionnée à des mutations inactivation le FO. Un millier d’isolats a été analysé. Les mutations ont été localisées dans les génomes mitochondrial et nucléaire. Dix-huit clones, issus de mutations n’affectant pas des facteurs connus pour être nécessaires à l’expression de l’ATP synthase, ont été entièrement séquencés. Plusieurs nouveaux systèmes cellulaires potentiellement impliqués dans la biogenèse du FO ont été identifiés. / At first, I am interested in the ε subunit of mitochondrial ATP synthase in yeast, an organism that is well suited for the study of mitochondrial functions. This protein is a part of the ATP synthase called central stalk. This allows the coupling of proton translocator domain of this enzyme (FO) to its catalytic domain (F1) where ATP is synthesized. Using a tetO expression system, I showed that in the absence of the ε subunit, F1 and FO domains are no longer coupled. It results in a massive proton leakage across the inner membrane of mitochondria. I then showed that the absence of the ε subunit can be compensated by mutations slowing the activity of FO. These data allow to conclude that the ε subunit is necessary to maintain the physical integrity of the ATP synthase for oxydative phosphorylation. Later, I tried to identify new factors involved in the biogenesis of the FO. For this, I used a genetic screen where the survival of yeast cells is conditioned by mutations inactivating the FO. About a thousand clones were analyzed. The mutations were localized in mitochondrial and nuclear genomes. Eighteen clones with mutations in genes encoding not yet known ATP synthase expression factors were completely sequenced. Several new cellular systems that are potentially involved in the biogenesis of FO were identified.

Le travail présenté dans ce manuscrit concerne le développement d’inhibiteurs sélectifs de NO Synthases, des enzymes qui catalysent la formation du monoxyde d’azote (NO) à partir de l’arginine. Trois isoformes ont été identifiées, la NOS neuronale (nNOS), la NOS endothéliale (eNOS) et la NOS inductible (iNOS). Une surproduction de NO dans l’organisme, notamment par la iNOS ou la nNOS, est impliquée dans différentes maladies, tel que le choc septique, l’arthrite, des maladies neurodégénératives ou encore certains cancers. L’inhibition des NOSs apparait donc une approche intéressante dans le traitement de ces maladies. Cependant, cette inhibition doit être sélective pour ne pas interférer avec les fonctions physiologiques des autres isoformes.Les composés synthétisés sont constitués d’une partie analogue du substrat de type S-Ethyl-Isothiocitrulline munie d’une extension sensée interagir dans le canal d’accès du substrat où la conservation entre les trois isoformes est plus faible que dans le site de liaison du substrat. Ces deux parties sont reliées par un lien qui peut être de type amide ou hétérocyclique. Ces composés sont obtenus grâce à une stratégie de synthèse en phase solide via un ancrage par la chaîne latérale, qui permet la synthèse rapide de bibliothèques de composés. Notre premier travail a été de tenter d’optimiser deux inhibiteurs sélectionnés de travaux antérieurs, l’un plutôt sélectif de la iNOS et l’autre de la nNOS. Pour cela, nous avons choisi certaines modifications selon une approche aléatoire. Mais nous avons également entamé une approche plus rationnelle en développant un protocole de docking, basé sur des structures de NOSs issues de la Protein Data Bank et destiné à prédire le mode de liaison des inhibiteurs dans le site actif des enzymes. Nous avons également développé de nouvelles séries de composés. En particulier, nous avons mis au point la synthèse sur support d’analogues où le carbone alpha de l’analogue de substrat est remplacé par un azote (composés de type aza). Nous avons aussi tenté la synthèse en solution de nouveaux analogues du substrat séléniés.Enfin, grâce au modèle de docking, un criblage virtuel de molécules issues de deux bases de données dont celle de la Chimiothèque Nationale a été effectué pour découvrir de nouvelles structures avec un potentiel pouvoir inhibiteur. Nous présentons donc dans ce document la conception et la synthèse de nouvelles séries d’inhibiteurs de NOSs, l’élaboration d’un protocole de docking pour apporter une approche plus rationnelle, et enfin l’évaluation des composés sur les trois enzymes recombinantes et, pour certains, sur deux lignées cellulaires productrices de NO. / This work is focused on the development of selective NO Synthases inhibitors, enzymes, which catalyse the production of nitric oxide (NO) from arginine. Three isoforms have been identified, the. neuronal NOS (nNOS), the endothelial NOS (eNOS) and the inducible NOS (iNOS). An overproduction of NO, in particular by iNOS or nNOS, is involved in many diseases such as septic shock, arthritis, neurodegenerative diseases or some cancers. Therefore, NOS inhibition looks very interesting to treat those diseases. However, this inhibition has to be selective of one isoform to not interfere with the physiological functions of the two others.The synthetic compounds are constituted of both an S-Ethyl-Isothiocitrulline as substrate analogue and an extension expected to interact into the substrate access channel, a less conserved region between the three isoforms compared to the substrate binding site. These two parts are joined together by a peptide bond or a heterocyclic link. These molecules have been obtained thanks to a solid-phase strategy through a side chain anchoring approach. This protocol allows the rapid synthesis of compound libraries. In a first work, we attempted to optimize two inhibitors selected from previous studies. One is rather selective of iNOS and the other to nNOS. We chose some modifications in a random fashion. But we also started a more rational approach by developing a docking protocol, based on NOS structures from the Protein Data Bank and designed to predict the binding mode of the inhibitors in the enzyme active sites.We also prepared new series of compounds. In particular, we developed the solid phase synthesis of derivatives where the alpha carbon of the substrate analogue is replaced by a nitrogen (aza-type compounds).. We also attempted the solution synthesis of new substrate analogues containing selenium.Finally, thanks to the docking model, we performed a virtual screening of molecules from two data bases including the Chimiothèque Nationale, to discover new structures with potential inhibitory activity.Therefore, we present in this manuscript the design and synthesis of new series of NOS inhibitors, the development of a docking protocol to provide a more rational approach, and finally the evaluation of compounds on the three recombinant isoforms and, for some, on two cell lines producing NO.

Cette thèse s’est focalisée sur les lavandes et en particulier sur trois lavandes retrouvées en France : la lavande fine (Lavandula angustifolia Miller), la lavande aspic (Lavandula latifolia Medik) et leur hybride le lavandin (Lavandula x intermedia). Capables de synthétiser de grandes quantités de composés organiques volatils (COV) et plus particulièrement des terpènes volatils tel les mono- et sesquiterpènes, les lavandes sont utilisées depuis l’antiquité par l’Homme pour les propriétés médicinales et aromatiques de ces terpènes, composants de l’huile essentielle de lavande. De par l’importance économique et écologique des terpènes volatils, ce travail de thèse présente différents aspects d’étude. Dans un premier temps la relation entre la diversité chimique, géographique et génétique de la lavande fine a été analysée sur l’ensemble de son aire de répartition. Les résultats ont mis en évidence des populations de lavande fine très différentes autant chimiquement que génétiquement au bord de leur aire de répartition. Dans un deuxième temps, l’impact du stress hydrique au cours du temps sur les contenus en terpènes volatils a été évalué sur la lavande aspic, le lavandin et six populations de lavande fine. Les résultats ont montré des tolérances différentielles en fonction des espèces et des populations ; ainsi le lavandin est plus rapidement affecté par le stress hydrique que la lavande fine. Les contenus terpéniques n’ont été que faiblement impactés par le stress hydrique et cela à des états hydriques différents selon les espèces et les populations. Malgré la grande diversité de réponse selon les composés, l’intensité du stress hydrique et les plantes ; les terpènes de la voie du camphre (bornéol, camphène et camphre) sont ceux qui présentent les plus grandes variations entre les plantes stressées et témoins. Il apparaissait alors intéressant d’étudier la voie de biosynthèse du camphre. Dans ce cadre-là, nous avons identifié et caractérisé la bornyl diphosphate synthase capable de former le bornéol à partir du bornyl diphosphate. L’ensemble de ces travaux permettent de mieux appréhender les relations entre production de terpènes volatils et environnement ainsi que de donner des outils génétiques afin de poursuivre ces investigations / The PhD was focused on lavenders and precisely on lavenders present in France: the fine lavender (Lavandula angustifolia Miller), the spike lavender (Lavandula latifolia Medik) and their hybrid the lavandin (Lavandula x intermedia). Skilled to synthetize huge organic volatils coumpounds (COV) amount and in particular volatils terpene such mono- and sesquiterpenes, lavenders are used by human from antiquity for medicinal and aromatic properties of these volatils terpenes, lavender essential oil is composed of. Due to economical and ecological volatils terpenes importance, several study aspects is considered in the PhD. In a first hand, on all the fine lavender’s repartition area, relationship between chemical, geographical and genetical diversities was assessed. Results showed chemical and genetical significant different populations, at the border of fine lavender repartition area. In a second hand, hydric stress impact over time on volatiles terpenes content was assessed on the spike lavender, lavandin and six fine lavender populations. Results put in evidence differential tolerances by species and populations; thus lavandin is more quickly affected by hydric stress than the fine lavender. Terpenes contents were slightly impacted by hydric stress and with different states amoung species and populations. Despite huge answer diversities amoung compounds, hydric stress intensity and plants; camphre pathway terpenes (borneol, comphene and camphre) are those which have the more important variations among stressed and controlled plants. Therefore study camphre biosynthesis pathway emerged. In this context, we have identified and characterized the bornyl diphosphate synthase able to produce the borneol from the bornyl diphosphate. These works allow a better understanding of relationships between volatils terpenes production and environment as well as give genetical tools to proceed to further investigations

La F1 Fo ATP synthase est un complexe enzymatique localisé au sein de la membrane interne mitochondriale qui utilise le gradient électrochimique en protons formé par la chaîne respiratoire pour synthétiser de l'ATP à partir d'ADP et de Pi. Cette enzyme conservée de la levure S. cerevisiae aux cellules de mammifères s'organise dans les membranes internes mitochondriales sous forme de structures supramoléculaires d'ATP synthases. Chez la levure, il est aujourd'hui parfaitement identifiée que cette organisation nécessite la présence de deux sous-unités accessoires de l'enzyme : les sous-unités e et g.Les travaux présentés dans ce manuscrit visaient à étudier l'implication des sous-unités e et g dans les mécanismes de dimérisation et d'oligomérisation des ATP synthases ainsi que dans la morphogénèse des crêtes mitochondriales chez la levure S. cerevisiae et dans les cellules humaines en culture.Chez la levure, l'étude réalisée nous a permis de déterminer la stœchiométrie des sous-unités e et g, élément indispensable à la modélisation de l'agencement des sous-unités membranaires de l'enzyme dans la membrane interne mitochondriale.Dans les cellules humaines en culture, nous avons pu établir que les sous-unités e et g participent à la stabilité des dimères d'ATP synthases. Cependant l'implication de ces sous-unités dans la stabilité de l'enzyme semble différente des observations effectuées dans les cellules de levure / The F1Fo ATP synthase is an enzymatic complex embedded in the inner mitochondrial membrane which use the electrochemical proton gradient generated by the phosphorylation oxydative pathway to synthesize ATP from ADP and inorganic phosphate. This enzyme is conserved from yeast to mammalian cells and displays supramolecular organization in the inner mitochondrial membrane. In yeast, it is actually well-known that the supramolecular assembly required two accessory subunits : e and g subunits.The present work was realized to understand the involvement of subunits e and g in dimerization and oligomerization of mitochondrial ATP synthases as well as their effect on mitochondrial inner membrane morphogenesis in yeast S. cerevisiae and human cultured cells.In yeast, this study led us to determine subunits e and g stoechiometry, which was cruelly missing to establish a model of the ATP synthases membranous subunits layout in the inner mitochondrial membrane.In human cells, we have demonstrated that subunits e and g are implicated in ATP synthase dimer stabilization. However, their involvement in this stabilization seems to be quietly different of what have been observed in yeast cells.

Orientador: Paulo Mazzafera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T10:40:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Geromel_Clara_D.pdf: 2807679 bytes, checksum: 87559525feb767ee465302f9b3380513 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Sabendo-se que a produtividade da cultura de café está diretamente ligada a três fatores básicos de produção, climáticos, genéticos e fisiológicos, nesse estudo foram abordados alguns aspectos do metabolismo de carboidratos envolvidos no processo de enchimento dos frutos de café ao longo do seu desenvolvimento. A composição de carboidratos, principalmente de polissacarídeos do grão (endosperma) de café é conhecida, assim como a importância dos açúcares sobre a qualidade da bebida, porém a importação de sacarose a partir de folhas e seu desdobramento nos frutos ainda não são completamente esclarecidos. Os açúcares utilizados no metabolismo das sementes são de extrema importância, tendo como exemplo a regulação da relação fonte-dreno, além de controlar a expressão de genes que codificam algumas enzimas envolvidas no metabolismo de açúcares. O trabalho teve como principal objetivo estudar o metabolismo de sacarose nos frutos de café, ao longo do desenvolvimento. Análises histológicas e fornecimento de compostos marcados mostraram que não existem conexões vasculares entre os tecidos, pericarpo,perisperma e endosperma, mas vasos condutores que percorrem o funículo chegam até o perisperma, permitindo um descarregamento direto de fotoassimilados produzidos nas folhas e dele a transferência para o endosperma, além de receber fotoassimilados do pericarpo, pelo transporte de célula a célula. A fotossíntese no pericarpo diminui ao longo do desenvolvimento do fruto. Grãos de amido foram observados nos estados jovens do perisperma e à medida que surge o endosperma, esses grãos vão desaparecendo em regiões próximas ao tecido que está sendo formado. As enzimas e os teores de açúcares endógenos avaliados em tecidos separados ao longo da maturação do fruto apresentaram diferenças entre diferentes tratamentos da lavoura (¿pleno sol¿: condições normais de cultivo, sombreamento e carga reduzida). A sacarose sintase (SUS) apresentou valores de atividades bem maiores que das invertases ácidas (IAV). A sacarose fosfato sintase (SPS) acompanhou o acúmulo de sacarose no estádio inicial no pericarpo de frutos de café. Foi mostrada a existência de duas isoformas de SUS, codificadas por dos genes chamados CaSUS1 e CaSUS2 em C. arabica, que possivelmente desempenham diferentes funções metabólicas nos diferentes tecidos do fruto de café. Esses genes apresentam uma expressão diferencial, com CaSUS1 expressando-se nas fases jovens do desenvolvimento do perisperma e do endosperma; porém a expressão de CaSUS2 sobrepõe os picos de atividade SUS detectados e o acúmulo de sacarose nos estados finais de desenvolvimento do pericarpo e do endosperma. Isso sugere que a isoforma CaSUS1 está relacionada à degradação de sacarose, quando parece claro que a isoforma CaSUS2 está relacionada com a síntese desse açúcar. Foi mostrado que esses dois genes se expressam também in C. racemosa, pois as sondas CaSUS1 e CaSUS2 de C. arabica reconheceram transcritos (mRNA) no endosperma dessa espécie. Portanto, os genes CrSUS1 e CrSUS2 parecem codificar para isoformas de SUS que desempenham funções diferentes daquelas observadas em C. arábica; SUS1 parece estar relacionado com a síntese da sacarose. O sombreamento influenciou na duração do ciclo de desenvolvimento dos frutos, tornando-o mais longo que no pleno sol (respectivamente 260 e 231 dias após o florescimento) e alterando o acúmulo de sacarose nos frutos. Com base nesses resultados fica clara a complexidade do metabolismo de sacarose em frutos de café, visto que nem sempre as atividades enzimáticas seguem o mesmo padrão de acúmulo de açúcares e enzimas de degradação e ressíntese de sacarose atuam simultaneamente, assim como a transferência de açúcares entre os tecidos / Abstract: Since coffee culture productivity is straightly connected to three basic production factors: climate, genetics and physiology, herein some aspects of the carbohydrates metabolism involved in the process of coffee grains filling through its development were analyzed. It is known the carbohydrates composition, mainly the polysaccharides composition of the coffee grain (endosperm) as well as the importance of sugars in the beverage quality, nevertheless the sucrose import from the leaves and its sharing in the fruits are still to be completely clarified. The sugars utilized in the seeds metabolism are extremely important, such as in the regulation of the drain-source relation and in the expression control of genes that codify some enzymes involved in sugars metabolism. The main goal of this work was to study the sucrose metabolism in coffee fruits through their development. Histological analyses and marked compounds supply showed that there are no vascular connections among the tissues of the pericarp, perisperm and endosperm, but conduction vases that run through the funiculus get to the perisperm, enabling an unloading of photoassimilates produced in the leaves. From the perisperm, these assimilates are transferred to the endosperm; The pericarp photosynthesis diminishes through the fruit development. Starch grains were observed in juvenile stages of the perisperm and during the endosperm formation these grains start to disappear in regions close to the forming tissue. The enzymes and the endogenous sugar level evaluated in separated tissues through fruit maturation show some differences among distinct lavoura treatments (¿full sun¿: ordinary culture conditions, shadowing and reduced loading). The sucrose synthase (SUS) showed activity values much higher than the ones presented by the acid invertases (IAV). The sucrose phosphate synthase (SPS) followed the sucrose accumulation in the pericarp initial stage in coffee fruits. It was shown the existence of two isoforms of SUS codificated by genes called CaSUS1 e CaSUS2 in C. Arabica, that possibly play different metabolic roles in different tissues in coffee fruit. These genes show a differential expression, in which CaSUS1 is expressed in the juvenile stage of perisperm and endosperm development; however, CaSUS2 expression overlaps the detected activity peaks of SUS and the sucrose accumulation in the final stages of pericarp and endosperm development. This fact suggests that the CaSUS1 isoform is related to sucrose degradation while it seems clear that the CaSUS2 isoform is related to sucrose synthesis. Both genes were shown to be also expressed in C.racemosa since CaSUS1 and CaSUS2 C. arabica probes recognized transcripts (mRNA) in this species endosperm. Therefore, CrSUS1 and CrSUS2 genes seem to codify SUS isoforms that play different functions from the ones observed in C. arabica; SUS1 seems to be related to sucrose synthesis. The shadowing has influenced the fruits development cycle duration, turning it longer than in pleno sol (respectively, 260 and 231 days after flowering) and altering the sucrose accumulation in fruits. According to these results, it is clear how complex is the sucrose metabolism in coffee fruits, since it is not always that the same pattern of sugar accumulation is followed by the enzymatic activities and enzyme degradation and sucrose (re)synthesis act simultaneously as well as sugar transference among tissues / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

La résistance aux antibiotiques par les micro-organismes est une menace mondiale. C'est pourquoi la recherche de nouveaux médicaments revêt une importance capitale de nos jours.Le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) est un cofacteur essentiel et un substrat dans de nombreuses réactions biologiques. Pour cette raison, les enzymes qui l'utilisent comme substrat et celles qui participent à sa biosynthèse sont largement étudiées en tant que cibles antibactériennes potentielles. Dans ce contexte, nous nous intéressons au développement de nouveaux agents antibactériens contre la quinolinate synthase (NadA). Cette enzyme participe à la voie de biosynthèse de novo du NAD chez les procaryotes et est essentielle chez deux pathogènes : Helicobacter pylori, responsable d'ulcères et de cancers gastriques, et Mycobacterium leprae, responsable de la lèpre. Le fait que NadA n'existe que chez les procaryotes et qu'elle est essentielle chez deux agents pathogènes font de NadA une cible intéressante pour la conception de nouveaux antibactériens. La quinolinate synthase est une enzyme [4Fe-4S] où l'un des atomes de Fe est coordonné par une molécule d'eau à l'état de repos et joue le rôle d'acide de Lewis durant la catalyse. La réaction catalysée par NadA consiste en la formation d'acide quinolinique (QA), précurseur du NAD, à partir d'iminoaspartate et de dihydroxyacétone phosphate. Sur la base de la découverte dans notre laboratoire du premier inhibiteur de NadA (le DTHPA), qui agit par coordination irréversible du fer catalytique du cluster, nous avons conçu et synthétisé une famille de molécules pouvant servir d'inhibiteurs plus spécifiques de NadA. Ces molécules contiennent un cycle benzène / pyridine ou pyrazine, deux carboxylates vicinaux et un thiol en tant que groupe coordinant du fer: l’acide 4-mercaptophtalique (4MP), l’acide 6-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylique (6MPDC), l’acide 5-mercaptopyrazine-2, 3-dicarboxylique (5MPzDC) et l’acide 5-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylique (5MPDC). Nous avons démontré que ces molécules inhibent l’enzyme NadA in vitro avec un IC50 du même ordre de grandeur que celui du DTHPA (dizaine de µM). Par l’utilisation de diverses spectroscopies et de la cristallographie, nous avons démontré que l'inhibition s’effectue par la coordination de ces molécules avec le fer catalytique du cluster via leur groupement thiol. Nous avons également étudié in vitro la spécificité de ces molécules. Nous avons montré que les molécules 4MP et 5MPDC étaient des inhibiteurs spécifiques de NadA lorsqu’on les teste sur l’aconitase B, une enzyme [4Fe-4S] bactérienne, dont le cluster présente des propriétés structurales et fonctionnelles similaires à celles du cluster de NadA.Enfin, nous avons étudié l'activité d'inhibitrice de l’ensemble des molécules in cellulo sur de la voie de biosynthèse du QA chez Escherichia coli avec le DTHPA comme contrôle. Alors que les molécules 6MPDC et 5MPzDC inhibent la croissance d’E. coli de manière indépendante de la voie de biosynthèse du QA, le 4MP et le 5MPDC (les deux inhibiteurs spécifiques in vitro) n'ont montré aucune activité inhibitrice in cellulo. Ce manque d'activité pouvant être dû à un manque de pénétration des molécules à l'intérieur des bactéries, nous avons envisagé de favoriser la pénétration à l'aide d'un vecteur transmembranaire, un analogue simplifié du tétra-cyclopeptide naturel FR235222. Nous avons synthétisé et couplé le cyclopeptide à l'inhibiteur 4MP. Malheureusement, aucune inhibition de la croissance d'E. coli n'a été observée. La thèse s’est terminée en essayent de comprendre la pénétration du tétra-cyclopeptide sur bactérie, en utilisant notamment des agents fluorophores. / Resistance to antibiotics is becoming a world-wide threat. Microorganisms are able to withstand drugs leading to persistence of diseases. This is why the research of new drugs is of great importance nowadays.Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is an essential cofactor and substrate in numerous biological reactions. For this reason, both the enzymes that use it as a substrate and those participating on its biosynthetic pathway are largely studied as potential antibacterial targets. In this context, we are interested in the development of new antibacterial drugs against quinolinate synthase enzyme (NadA). This enzyme participates in the prokaryotic NAD de novo biosynthetic pathway and is essential in two pathogens: Helicobacter pylori, cause of gastric ulcers and cancers, and Mycobacterium leprae, responsible of leprosy. The fact that NadA only exists in prokaryotes and the fact that it is essential for these two pathogens make it an interesting target for the design of new antibacterial drugs. Quinolinate synthase is a [4Fe-4S] cluster enzyme, where one of the Fe sites is coordinated by a water molecule in the resting state, and plays a Lewis acid role during catalysis. The reaction catalyzed by NadA consists in the formation of quinolinic acid (QA), precursor of NAD, from iminoaspartate and dihydroxyacetone phosphate. Based on the discovery in our laboratory of the first inhibitor of NadA (DTHPA) that coordinates irreversibly the catalytic iron site of the cluster, we designed and synthesized a family of molecules as potential more specific NadA inhibitors. These molecules contain a benzene/pyridine or pyrazine ring, two vicinal carboxylates and a thiol as an iron coordinating group: 4-mercaptophthalic acid (4MP), 6-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylic acid (6MPDC), 5-mercaptopyrazine-2, 3-dicarboxylic acid (5MPzDC) and 5-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylic acid (5MPDC). We demonstrated that these molecules inhibit NadA enzyme in vitro in the same range as DTHPA. Using different spectroscopies and crystallography, we demonstrated that inhibition occurs by coordination of the molecules to the catalytic iron site through their thiol group. We investigated also in vitro the specificity of these molecules. We demonstrated that 4MP and 5MPDC molecules are specific NadA inhibitors when assayed on bacterial aconitase B, a [4Fe-4S] enzyme, whose cluster displays functional and structural properties similar to those of NadA.Finally, we investigated the QA pathway inhibition activity of the four molecules in cellulo, in an Escherichia coli strain. Whereas, 6MPDC and 5MPzDC molecules inhibit E. coli growth in a QA biosynthetic pathway independent manner, 4MP and 5MPDC (the two in vitro specific inhibitors) did not show any in cellulo inhibition activity. Since this lack of activity might be due to a lack of penetration of the molecules inside bacteria, we thought about assisting the penetration of the molecules using a transmembrane carrier, a simplified analogue of the tetra-cyclopeptide FR235222 natural product. We synthetized and coupled the cyclopeptide to the 4MP inhibitor. Unfortunately, no E. coli growth inhibition was observed. The Ph.D ended by investigating the penetration of the tetra-cyclopeptide inside bacteria, using some fluorophore agents.

La mitochondrie forme un réseau dynamique de tubules, dont la morphologie et la distribution sont étroitement régulées. Les mitochondries sont des organelles à double membrane dont l’architecture interne est complexe. Les crêtes mitochondriales forment des invaginations de la membrane interne. Elles sont le lieu des phosphorylations oxydatives, réactions par lesquelles l’ATP synthase produit l’ATP. L’ATP synthase est également connue pour son rôle clé dans la morphogenèse des crêtes. Dans cette étude j’ai mis en évidence in vivo la localisation en cluster de l’ATP synthase au sein du réseau mitochondrial de S. cerevisiae se développant sur substrat fermentescible. Mes résultats suggèrent que ces clusters correspondent aux crêtes mitochondriales, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude du remaniement de la membrane interne.La morphologie du réseau mitochondrial est maintenue par un équilibre entre les processus de fusion et de fission des tubules mitochondriaux. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai mis en évidence une fragmentation progressive du réseau mitochondrial lors de l’entrée des cellules en quiescence, un état cellulaire non prolifératif réversible. En quiescence, le réseau mitochondrial est constitué de petites vésicules sous corticales immobiles au contenu enzymatique variable. Lors d’un retour à l’état prolifératif ces vésicules fusionnent rapidement pour reformer un réseau tubulaire, et ce, avant l’émergence de la cellule fille. De façon surprenante j’ai mis en évidence que ni les machineries canoniques de fusion ou de fission, ni le cytosquelette d’actine ne sont requis lors du remaniement du réseau mitochondrial dans les transitions entre prolifération et quiescence. / Mitochondria form a dynamic tubular network which organization and distribution is highly regulated.Mitochondria are double membrane organites with a complex internal architecture. Cristae, which areinner membrane invaginations, are the site of oxidative phosphorylation, reactions by which ATP synthaseproduces ATP. ATP synthase also play a key role in cristae morphogenesis. In this study, I have shown thatATP synthase localized as discrete clusters along the mitochondrial network in living S. cerevisiae cellsgrown on a fermentable carbon source. Overall our data suggest that ATP synthase clusers correspond tomitochondrial cristae, opening new avenues to explore the mechanisms involved in inner membraneremodelling.Mitochondrial network morphology is regulated by a dynamic equilibrium between the fusion and fissionof mitochondrial tubules. In the second part of my thesis, I highlight a progressive mitochondrialfragmentation during quiescence establishment, a state defined as a reversible absence of proliferation.Quiescent cells mitochondrial network is composed of immobile small cortical mitochondrial vesicles witha variable enzymatic content. Upon quiescence exit, cortical mitochondrial vesicles rapidly fuse and atubular network is reconstituted prior to bud emergence. Astonishingly, neither the canonical fusion orfission machineries nor the actin cytoskeleton are required for the mitochondrial network modificationduring quiescence / proliferation transition.