El projecte de tesi doctoral s'emmarca en la producció de plantes inoculades amb soques seleccionades del fong ectomicorrízic comestible Lactarius deliciosus i en el seguiment de la seva persistència un cop establert en camp. S'ha avaluat la capacitat colonitzadora de 25 soques de L. deliciosus en síntesi en cultiu pur amb Pinus pinaster. Els resultats han mostrat que les soques provades presenten diferent potencial colonitzador. La capacitat de formació de micorrizes s'ha relacionat de manera negativa amb el temps des de l'aïllament del cultiu i, de manera positiva, amb la capacitat de formació de rizomorfs. S'han posat a punt diferents tècniques moleculars per a la caracterització específica i intraespecífica de L. deliciosus i s'ha comprovat la seva efectivitat en la identificació en camp del fong en les fases críptiques de la simbiosi (micorriza i miceli extraradical present en el sòl). L'encebador LDITS2R, dissenyat a la regió ITS del rDNA de L. deliciosus, en combinació amb l'encebador universal ITS1 ha permès l'amplificació específica d'aquest fong mitjançant PCR a partir de DNA extret directament de mostres de camp. L'anàlisi single strain conformation polymorphisms (SSCP) dels productes específics amplificats ha permès distingir fins a nou patrons diferents entre les 18 soques de L. deliciosus analitzades que permeten la identificació intraespecífica de la soca seleccionada introduïda en camp. S'ha produït planta micorrizada amb L. deliciosus en hivernacle i s'ha posat a punt un sistema de quantificació individualitzada i no destructiva de la colonització radical inicial mitjançant l'anàlisi de fotografies digitals. La planta produïda s'ha establert en plantacions experimentals i s'ha avaluat la persistència del fong inoculat a diferents temps per recompte del percentatge de micorrizes i quantificació del miceli extraradical mitjançant PCR en temps real. S'ha conclòs que la persistència de les micorrizes i l'extensió del miceli en el sòl es veuen afectades per les condicions de la localitat d'establiment de la plantació i per la soca inoculada. En canvi, el nivell inicial de colonització no ha tingut un efecte significatiu, en les condicions assajades, en la persistència de L. deliciosus. Per últim, s'ha avaluat la persistència de L. deliciosus enfront a dues espècies de Rhizopogon potencialment competidores que poden desplaçar el fong introduït. S'ha detectat un efecte negatiu de R. roseolus en la persistència de L. deliciosus. Els resultats suggereixen que la competència entre aquests dos fongs té lloc a nivell del sistema radical per la colonització de les arrels lliures mentre que no s'ha detectat interacció negativa a nivell de miceli extraradical. La correlació entre el percentatge de micorrizes i la quantitat de miceli present en el sòl ha estat positiva per a les tres espècies estudiades. En conseqüència, la quantificació de miceli extraradical pot ser un bon indicador del grau de colonització radical de la planta i permetre un seguiment no destructiu del fong en camp. / The main objective of the thesis project is the production of inoculated plants with selected strains of the edible ectomycorrhizal fungus Lactarius deliciosus and tracking its persistence once established in field plantations. The colonization ability of 25 strains of L. deliciosus has been evaluated in pure culture synthesis with Pinus pinaster. The results have shown differences in root colonization level of the evaluated strains. The formation of mycorrhizas has been negatively related to the age of the fungal culture and positively to the formation of rhizomorphs. Different molecular techniques have been optimized for specific and intraspecific characterization of L. deliciosus and evaluated for their effectivity in field identification of the fungus in the cryptic phases of the symbiosis (mycorrhizas and extraradical mycelium present in the soil). The design of the primer named LDITS2R in the ITS region of the rDNA of L. deliciosus combined with the universal primer ITS1 has allowed specific amplification of this fungus by PCR from DNA extracted from field samples. Single strain confromation polymorphisms (SSCP) analysis of the specific amplified products has provided nine different patterns among the 18 L. deliciosus analyzed strains which allowed for the intraspecific identification of the selected inoculated strain. Plants mycorrhizal with L. deliciosus have been produced in the nursery and initial radical colonization has been individually quantified in a non-destuctive way by analysis of digital photographs. Experimental plantations have been established with the inoculated plants. Fungal persistence has been evaluated at different times by determining the percentage of mycorrhizas and the production of extraradical soil mycelium by real time PCR. The site and the inoculated strain significantly affected the persistence of mycorrhizas and the extension of the extraradical soil mycelium whereas no effect of the initial colonization level was observed under the experimental conditions tested. Finally, the persistence of L. deliciosus against two Rhizopogon species identified as potential competitors has been evaluated. The presence of R. roseolus in the field site affected negatively the persistence of L. deliciosus. The results obtained suggest that competition between these two fungi takes place at the root system level for colonization of the available roots. No negative interaction between extraradical mycelia of both species was observed. Linear correlations between the percentage of mycorrhizas and soil mycelium biomass were significant and positive for the three fungal species studied. Consequently, the quantification of extraradical mycelium could be a good indicator of the root colonization level of the plant allowing for non-destructive tracking of the fungus in the field.

Los embutidos fermentados ligeramente acidificados son un grupo de productos tradicionales mediterráneos, caracterizados por un pH superior a 5,3.Para un control eficiente de la seguridad microbiológica de los embutidos se necesitan técnicas rápidas para la identificación y recuento de los microorganismos patógenos a estudiar. En el presente trabajo, se desarrolló una técnica para la enumeración de L. monocytogenes que combinó el método del número más probable y la identificación mediante PCR específica. Para la detección de Salmonella spp. y L. monocytogenes se desarrolló un sistema de PCR-multiplex que permitió la identificación de ambos patógenos de forma simultánea en una sola reacción.El estudio de la calidad microbiológica de los embutidos fermentados ligeramente acidificados se completó con la caracterización de las comunidades microbianas más importantes en estos productos. Se identificaron a nivel de especie los aislados de bacterias del ácido láctico (BAL), de enterococos y de cocos gram-positivos catalasa-positivos (CGC+). Posteriormente se realizó una tipificación molecular de los mismos mediante RAPD y análisis del perfil plasmídico y se estudiaron las principales características de interés higiénico-sanitario y tecnológico de las cepas.Mediante PCR se identificó Lactobacillus sakei como la especie predominante (74%), seguida por Lactobacillus curvatus (21,2%). La actividad aminoácido-descarboxilasa se asoció a la especie L. curvatus (el 66% de los aislados presentaron esta actividad).La identificación de los enterococos se realizó mediante PCR-multiplex y por secuenciación del gen sodA. Enterococcus faecium fue la especie de enterococos predominante (51,9%) seguida por Enterococcus faecalis (14,2%).Todas las cepas de E. faecalis presentaron genes asociados a factores de virulencia. E. faecalis presentó mayor resistencia a antibióticos que el resto de las especies de enterococos estudiadas. Tan sólo una cepa de E. faecium presentó el genotipo vanA (que confiere resistencia de alto nivel a la vancomicina).La identificación de los aislados de CGC+ (mediante PCR específica y amplificación de la región intergénica 16S-23S ARNr) demostró que Staphylococcus xylosus es la especie predominante en los embutidos fermentados ligeramente acidificados (80,8%).La amina biógena más común en los CGC+ fue la feniletilamina, producida por un 10,8% de aislados. Un pequeño porcentaje de aislados fueron mecA+ (4,6%), presentando además resistencia a múltiples antibióticos. El potencial enterotoxigénico de las cepas de CGC+ fue muy reducido (3,3% de los aislados), detectándose únicamente el gen entC.El estudio pormenorizado de las comunidades bacterianas de interés permitió la selección de 2 cepas de L. sakei y 2 cepas de S. xylosus con características tecnológicas e higiénico-sanitarias óptimas. Para evaluar su efectividad como cultivos iniciadores se elaboraron dos tipos de embutidos ligeramente ácidos, chorizo y fuet, inoculados con microorganismos patógenos (Salmonella spp., L. monocytogenes y S. aureus). El uso de cultivos iniciadores permitió el control de L. monocytogenes, Enterobacteriaceae y Enterococcus así como del contenido en aminas biógenas. Los recuentos de Salmonella spp. disminuyeron de forma significante durante la maduración de los embutidos, independientemente del uso de cultivos iniciadores. El uso del tratamiento de alta presión (400 MPa) en los embutidos madurados consiguió la ausencia de Salmonella spp. en los lotes tratados. / Low-acid fermented meat products (final pH, 5.3 to 6.2) are a group of traditional Mediterranean products with a great diversity within the regions.To control the microbial quality of this kind of sausages is necessary to use rapid methods able to produce results quickly and reliably. In this study, a highly sensitive PCR-based method to detect and quantify L. monocytogenes in fermented sausages was developed. This method combined the high sensitivity of the most-probable-number method with a L. monocytogenes specific PCR assay. Also a multiplex-PCR based method for the simultaneous identification of L. monocytogenes and Salmonella spp. was designed. The study of the microbial quality of the slightly fermented sausages was followed by the characterization of the microbial communities of this kind of products. Lactic acid bacteria (LAB), enterococci and Gram-positive catalase-positive cocci (GCC+) were identified at species level. RAPD-PCR and plasmid profiling were used to evaluate the genetic diversity within species and to identify identical isolates of the same strain. Safety and hygienic properties were also studied in order to characterize the isolates in detail. With this aim, bacteriocin production, biogenic amine production and antibiotic susceptibility were determined. By species-specific PCR, Lactobacillus sakei was identified as the predominant LAB (74%) followed by Lactobacillus curvatus (21.2%) and Leuconostoc mesenteroides (4.8%). The production of biogenic amines was mainly related to the species L. curvatus (66% of the isolates were biogenic amine-producers).Species-specific PCR and partial sequencing of sodA gene were used to identify enterococcal population. Enterococcus faecium was the most frequently isolated species (51.9%) followed by Enterococcus faecalis (14,2%). All the E. faecalis strains carried virulence genes. E. faecalis showed higher antibiotic resistance than the other species. Only one E. faecium strain showed vanA genotype (high-level resistance to glycopeptides).Species-specific PCR and amplification of the 16S-23S rDNA intergenic region were used to identify GCC+ population. Staphylococcus xylosus was the predominant species (80.8%) in this kind of sausages.Tyramine was the most intense biogenic amine produced, although by only 4.6% of the GCC+ isolates. Phenylethylamine was more frequently detected (10.8% of isolates) but at lower levels. A low percentage of isolates (4.6%) showed mecA genes displaying also resistance to multiple antibiotics. Only 3.3% of isolates showed staphylococcal enterotoxins genes, all identified as entC gene.The study of the safety and technological properties of the isolates allowed to select 2 strains of L. sakei and 2 strains of S. xylosus on the basis of their technological and safety characteristics. To evaluate their suitability as starter cultures two types of low acid fermented sausages, fuet and chorizo, were manufactured. Batters were inoculated with L. monocytogenes, S. enterica and S. aureus. Starter cultures were able to control the growth of L. monocytogenes, Enterobacteriaceae, Enterococcus and the biogenic amine content. Salmonella spp counts decreased significantly during ripening independently of the use of starter culture and product.High hydrostatic pressure treatment was necessary to assure absence of Salmonella spp. in final products.