La capacidad de Acinetobacter baumannii para causar infecciones nosocomiales se relaciona con su habilidad para desarrollar rápidamente resistencia a los antibióticos, junto con la capacidad que tiene este organismo para sobrevivir durante largos períodos de tiempo en el hábitat hospitalario.A pesar de ser un problema emergente en la UCIs, falta mucha información sobre los mecanismos de virulencia y resistencia a los antimicrobianos, a la desecación y a la desinfección. Los objetivos principales de este trabajo fueron estudiar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos en cepas clínicas de la especie Acinetobacter, haciendo énfasis en la identificación de nuevas bombas de expulsión y porinas, junto con un estudio del efecto que produce la formación de biopelícula en el éxito de A. baumannii como patógeno.Con A. baumannii, se ha estudiado la prevalencia de bombas de expulsión específicas para tetraciclinas (TetA y TetB) y β-lactamasas en una colección de cepas clínicas españolas. Adicionalmente, se ha estudiado el efecto de la secuencia de inserción ISAba1 como promotor de estas β-lactamasas y se ha concluido que este elemento móvil, que puede ser adquirido o perdido en el ámbito hospitalario, se está convirtiendo en un activador importante de estos genes de resistencia. Paralelamente, se ha analizado la actividad de ceftobiprole y doripenem, dos nuevos β-lactámicos, frente a cepas clínicas de este microorganismo que únicamente ofrecen una pequeña mejoría frente a las antiguas carbapenemas y cefalosporinas. También se ha detectado y secuenciado un gen homológo a mdfA en Escherichia coli que codifica una bomba de expulsión en una cepa clínica de A. baumannii.Aproximaciones genómicas y proteómicas han demostrado ser metodologías importantes para la identificación y caracterización de nuevos mecanismos de resistencia. Se ha hecho un análisis proteómico de una fracción enriquecida en proteínas de membrana en una cepa clínica y un estudio proteómico entre una cepa clínica sensible a quinolonas y un mutante isogénico resistente a quinolonas con la obtención de diversas proteínas de membrana que se sobre-expresaban en el mutante resistente; estas porinas podrían hacer la membrana bacteriana más impermeable a los agentes antimicrobianos. Un análisis de la membrana en mutantes resistentes a colistina demuestran que esta resistencia puede estar asociada a cambios a nivel proteico y a un incremento en la producción de lipopolisacáridos.Finalmente se ha analizado la formación de biopelícula en una colección de cepas clínicas de A. baumannii, estudiando la relación entre la formación de biopelícula y otras características clínicas o microbiológicas. Se ha demostrado que hay una clara asociación entre formación de biopelícula y sensibilidad a imipenem y ciprofloxacino; las cepas resistentes a quinolonas son menos propensas a formar biopelícula que sus equivalentes sensible debido a una expresión reducida de una fimbria de tipo 1, el primer paso en la formación de biopelícula. Además, pacientes tratados previamente con aminoglucósidos tienen un riesgo de ser colonizados o infectados con cepas de A. baumannii formadoras de biopelícula.En este trabajo también se han considerado otras genospecies y se han estudiado los mecanismos de resistencia a quinolonas y colistina, concretamente en cepas de la Genospecie 3 y 13. Cepas clínicas no pertenecientes al grupo A. baumannii están probablemente siendo subestimadas como agentes patogénicos porque las cepas resistentes pueden ser clasificadas como A. baumannii por equivocación. A pesar de que estas cepas son generalmente más sensibles a los antibióticos, están adquiriendo nuevos mecanismos de resistencia.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans es una bacteria Gramnegativa anaerobia facultativa, de morfología bacilar o coco-bacilar, frecuentemente asociada a procesos patológicos de la cavidad bucal como la gingivitis, la periodontitis juvenil o la periodontitis progresiva aguda. El papel de su membrana externa en la resistencia a los antibióticos de uso común en odontología se conoce poco.En nuestro trabajo hemos procedido al aislamiento e identificación de una serie de cepas de A. actinomycetemcomitans procedentes de muestras clínicas de casos especialmente graves de periodontitis agresivas y menos agresivas, que hemos comparado con dos cepas referencia de laboratorio. Hemos comprobado como tanto los patrones de susceptibilidad antibiótica frente a antibióticos de uso común en odontología, como los perfiles de proteínas de membrana externa estudiados mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida (SDS-PAGE), no varían significativamente entre unas cepas y otras, no presentando la variabilidad esperada. Además, una de las proteínas de membrana externa presente en todas las cepas, la denominada según su peso molecular como Omp 39, cumple la mayoría de las condiciones que presentan las porinas, habiéndose puesto de manifiesto su actividad formadora de poro mediante experimentos en Planar Lipid Bilayer, en los que muestra una conductancia de 0.75nS en KCl 1M y un tamaño de poro de alrededor de 0.73nm.Además, se ha demostrado la presencia funcional de una bomba de reflujo tipo acrAB, inhibible por CCCP, habiéndose detectado por amplificación la presencia de los genes que la codifican.La presencia de una única pequeña porina en la pared celular de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, unido a la ausencia de otros mecanismos de resistencia comunes como la existencia de integrones con genes de resistencia, podría condicionar su demostrada resistencia a ciertos tipos de antibióticos.

Los embutidos fermentados ligeramente acidificados son un grupo de productos tradicionales mediterráneos, caracterizados por un pH superior a 5,3.Para un control eficiente de la seguridad microbiológica de los embutidos se necesitan técnicas rápidas para la identificación y recuento de los microorganismos patógenos a estudiar. En el presente trabajo, se desarrolló una técnica para la enumeración de L. monocytogenes que combinó el método del número más probable y la identificación mediante PCR específica. Para la detección de Salmonella spp. y L. monocytogenes se desarrolló un sistema de PCR-multiplex que permitió la identificación de ambos patógenos de forma simultánea en una sola reacción.El estudio de la calidad microbiológica de los embutidos fermentados ligeramente acidificados se completó con la caracterización de las comunidades microbianas más importantes en estos productos. Se identificaron a nivel de especie los aislados de bacterias del ácido láctico (BAL), de enterococos y de cocos gram-positivos catalasa-positivos (CGC+). Posteriormente se realizó una tipificación molecular de los mismos mediante RAPD y análisis del perfil plasmídico y se estudiaron las principales características de interés higiénico-sanitario y tecnológico de las cepas.Mediante PCR se identificó Lactobacillus sakei como la especie predominante (74%), seguida por Lactobacillus curvatus (21,2%). La actividad aminoácido-descarboxilasa se asoció a la especie L. curvatus (el 66% de los aislados presentaron esta actividad).La identificación de los enterococos se realizó mediante PCR-multiplex y por secuenciación del gen sodA. Enterococcus faecium fue la especie de enterococos predominante (51,9%) seguida por Enterococcus faecalis (14,2%).Todas las cepas de E. faecalis presentaron genes asociados a factores de virulencia. E. faecalis presentó mayor resistencia a antibióticos que el resto de las especies de enterococos estudiadas. Tan sólo una cepa de E. faecium presentó el genotipo vanA (que confiere resistencia de alto nivel a la vancomicina).La identificación de los aislados de CGC+ (mediante PCR específica y amplificación de la región intergénica 16S-23S ARNr) demostró que Staphylococcus xylosus es la especie predominante en los embutidos fermentados ligeramente acidificados (80,8%).La amina biógena más común en los CGC+ fue la feniletilamina, producida por un 10,8% de aislados. Un pequeño porcentaje de aislados fueron mecA+ (4,6%), presentando además resistencia a múltiples antibióticos. El potencial enterotoxigénico de las cepas de CGC+ fue muy reducido (3,3% de los aislados), detectándose únicamente el gen entC.El estudio pormenorizado de las comunidades bacterianas de interés permitió la selección de 2 cepas de L. sakei y 2 cepas de S. xylosus con características tecnológicas e higiénico-sanitarias óptimas. Para evaluar su efectividad como cultivos iniciadores se elaboraron dos tipos de embutidos ligeramente ácidos, chorizo y fuet, inoculados con microorganismos patógenos (Salmonella spp., L. monocytogenes y S. aureus). El uso de cultivos iniciadores permitió el control de L. monocytogenes, Enterobacteriaceae y Enterococcus así como del contenido en aminas biógenas. Los recuentos de Salmonella spp. disminuyeron de forma significante durante la maduración de los embutidos, independientemente del uso de cultivos iniciadores. El uso del tratamiento de alta presión (400 MPa) en los embutidos madurados consiguió la ausencia de Salmonella spp. en los lotes tratados. / Low-acid fermented meat products (final pH, 5.3 to 6.2) are a group of traditional Mediterranean products with a great diversity within the regions.To control the microbial quality of this kind of sausages is necessary to use rapid methods able to produce results quickly and reliably. In this study, a highly sensitive PCR-based method to detect and quantify L. monocytogenes in fermented sausages was developed. This method combined the high sensitivity of the most-probable-number method with a L. monocytogenes specific PCR assay. Also a multiplex-PCR based method for the simultaneous identification of L. monocytogenes and Salmonella spp. was designed. The study of the microbial quality of the slightly fermented sausages was followed by the characterization of the microbial communities of this kind of products. Lactic acid bacteria (LAB), enterococci and Gram-positive catalase-positive cocci (GCC+) were identified at species level. RAPD-PCR and plasmid profiling were used to evaluate the genetic diversity within species and to identify identical isolates of the same strain. Safety and hygienic properties were also studied in order to characterize the isolates in detail. With this aim, bacteriocin production, biogenic amine production and antibiotic susceptibility were determined. By species-specific PCR, Lactobacillus sakei was identified as the predominant LAB (74%) followed by Lactobacillus curvatus (21.2%) and Leuconostoc mesenteroides (4.8%). The production of biogenic amines was mainly related to the species L. curvatus (66% of the isolates were biogenic amine-producers).Species-specific PCR and partial sequencing of sodA gene were used to identify enterococcal population. Enterococcus faecium was the most frequently isolated species (51.9%) followed by Enterococcus faecalis (14,2%). All the E. faecalis strains carried virulence genes. E. faecalis showed higher antibiotic resistance than the other species. Only one E. faecium strain showed vanA genotype (high-level resistance to glycopeptides).Species-specific PCR and amplification of the 16S-23S rDNA intergenic region were used to identify GCC+ population. Staphylococcus xylosus was the predominant species (80.8%) in this kind of sausages.Tyramine was the most intense biogenic amine produced, although by only 4.6% of the GCC+ isolates. Phenylethylamine was more frequently detected (10.8% of isolates) but at lower levels. A low percentage of isolates (4.6%) showed mecA genes displaying also resistance to multiple antibiotics. Only 3.3% of isolates showed staphylococcal enterotoxins genes, all identified as entC gene.The study of the safety and technological properties of the isolates allowed to select 2 strains of L. sakei and 2 strains of S. xylosus on the basis of their technological and safety characteristics. To evaluate their suitability as starter cultures two types of low acid fermented sausages, fuet and chorizo, were manufactured. Batters were inoculated with L. monocytogenes, S. enterica and S. aureus. Starter cultures were able to control the growth of L. monocytogenes, Enterobacteriaceae, Enterococcus and the biogenic amine content. Salmonella spp counts decreased significantly during ripening independently of the use of starter culture and product.High hydrostatic pressure treatment was necessary to assure absence of Salmonella spp. in final products.